（化学工艺专业论文）蛋膜生物活性肽酶法制备工艺研究.pdf

摘要 中国禽蛋资源丰富，品种多样，是世界禽蛋生产和消费的大国随着人们对 鸡蛋消费量的增加以及鸡蛋的集中加工使得大量蛋壳堆积与丢弃，造成了大面积 环境污染这一迫切需要解决的社会问题，对蛋壳的综合资源化利用已刻不容缓 由于国内外对蛋壳的资源化利用甚多，蛋膜的利用涉猎较少，而蛋膜又是蛋白争 多肤的潜在资源，具有十分可观的应用价值，为此，本课题在蛋膜利用方面开展 了系统的研究工作 首先，研究了工艺过程中最为关键的步骤一一活性肽的制备工艺路线的筛 选，得到了一条酶法提取蛋膜中活性肽的新工艺，该工艺相对于传统的蛋白质的 酸水解或者碱水解，其优点在于反应务件温和，对环境不适成污染，过程易于控 制，酶解产物稳定，保留了更多的营养价值，能较好的满足活性肽生产的需要， 是一条环境友好的资源化清洁化工艺技术，该技术具有良好的环境效益，社会 效益和推广前景 本课题首次将响应面分析法应用于酶解工艺条件的优化实验中，在单因素实 验的基础上通过响应面实验得到了酶解过程最佳工艺条件ip h 为9 6 ，时间为 2 0 4 h ，酶用量为蛋膜质量的3 9 ，温度为6 7 c ，固液比( 蛋膜：水) 为1 ：1 5 在 影响因素中，溶液p h 、反应温度对水解度及活性肽含量有较为显著的影响，反 应时间，酶用量扣固液比次之。 其次，利用高效液相色谱对酶解多肽进行初步的分离纯化，对分离的色谱条 件进行了探索和研究，为今后的研究工作提供了一定的参考依据 关键词：蛋膜生物活性肽酶解响应面分析法反相高效液相色谱 r e s e a r c ho np r e p a r a t i o no fb i o a c t i v ep e p t i d e sf r o m e g g s h e l lm e m b r a n eb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s a b s t r a c t c h i n ap o s s e s s e saw e a l t ho fe g g sa b o u tp r o d u c ta n dc o n s u m p t i o n a l o n gw i t ht h e i n c r e a s i n gc o n s u m p t i o na n dc e n t r a l i z e dp r o c e s s i n go fe g g , al a r g en u m b e ro f d i s c a r d e de g g s h e l l sm a k ep o l l u t i o n n o w , t h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fe g g s h e l l s b e a ：0 m e sa l lu r g e n ts o c i a lp r o b l e m t h ea p p l i c a t i o n so fe g g s h e l lh a db e e ns t u d i e da t a b r o a da n di nc h i n a , b u th o wt ou s ee g g s h e l lm e m b r a n ee f f i c i e n t l yi ss t i l ll a c ko f r e s e a r c h e g g s h e l lm e m b r a n e i sp o t e n t i a lr e s o u r c eo fp r o t e i na n d p e p t i d ew h i c hh a s a v e r yc o n s i d e r a b l ev a l u e a c c o r d i n g l y , h o wt ou s ee g g s h e l lm e m b r a n ei sd i s c u s s e di n t h i sp a p e r s y s t e m a t i c a l l y f i r s t l y , t h ek e ys t e p ，t h en e wt e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n gb i o l o g i c a l l ya c t i v e p e p t i d e sb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s 仃o me g g s h e l lm e m b r a n ei ss t u d i c d c o m p a r e dw i t h t r a d i t i o n a lp r o c e s so ft h ea c i do ra l k a l i n eh y d r o l y s i so fp r o t e i n s , i th a sas i m p l e t e c h n o l o g y , m i l dc o n d i t i o n , s c a r c e l yd e s t r o y i n gp e p t i d e sa n dc o u l dk e e pn u t r i t i v e v a l u e i na d d i t i o n , i tw o n tc a u s ep o l l u t i o nt ot h ee n v i r o n m e n t t h et e c h n o l o g yh a sa g o o de n v i r o n m e n t a lb e n e f i t s ，s o c i a lb e n e f i t sa n dp r o m o t i o np r o s p e c t s i nt h ep r o c e s so fs t u d y i n ge n z y m a t i ch y d r o l y t i cc o n d i t i o n s ，t h i sp a p e rb r o u g h t f o r w a r dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) f i r s t l y t h ee f f e c t so fm a i nf a c t o r s w e r ed i s c u s s e da n da c h i e v e dt h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o nt h r o u g hm o n o f a c t o ra n d r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) t e s t 。t h er e s u l t sa g ea sf o l l o w s ：t h ev a l u eo f p hi s9 6 e n z y m a t i ch y d r o l y t i ct i m ei s2 0 4 h ，e n z y m ed o s a g ei s3 9 ，t e m p e r a t u r ei s 6 7 a n ds o l i d l i q u i dr a t i oi s1 ：1 5 f u r t h e r m o r eb yt h er e s p o n s es u r f a c et e s t , t h e v a l u eo fp ha n dt h ee n z y m a t i ch y d r o l y t i ct e m p e r a t u r eh a v en o t a b l ee f f e c to nd ha n d c o n t e n to fb i o a c t i v ep e p t i d e s ，e n z y m ed o s a g ea n de n z y m a t i ch y d r o l y t i ct i m ea n d s o l i d 。l i q u i dr a t i oh a v el i t t l ee f f e c t s e c o n d l y , h y d r o l y z e dp o l y l ) e p t i d e sw e r cp u r i f i e dw i t hr e v e r s e dp h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p n p l c ) t h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s d u r i n gt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nw e r es t u d i e da n do p t i m i z e di nt h i st h e s i s ，a n di t i sh e l p f u lf o rf u r t h e rs t u d i e s k e yw o r d s ： e g g s h e l lm e m b r a n e ；b i o a c t i v ep e p t i d c s ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y s m ) ；r e v e r s e dp h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p i - w t l - 3 月l j舌 近些年来随着人类生活水平的显著提高，一方面人们对鸡蛋消费量的大幅度 增加，另一方面由于人们对鸡蛋的加工采用了集约化、多样化的处理手段，造成 了大批蛋壳作为废物被扔弃。这些废弃的蛋壳不但造成了资源浪费，更重要的是 对环境造成了严重的污染。近年来，世界各国科学家对蛋壳研究和开发的工作力 度和深度在逐渐加大，研究和利用的对象主要包括蛋壳和蛋膜两方面。其中对蛋 壳中天然钙源的转化利用已有大量研究报道，而对蛋膜的研究却一直滞后。面对 这一现实，本课题在分析探讨了蛋壳中蛋膜的开发现状和存在问题的基础上，重 点对蛋膜中生物活性肽的提取、纯化工艺这一相对薄弱的领域进行了一些探索， 取得了阶段性的成果。 生物活性肽( b i o a c t i v ep e p t i d e s ) 是蛋白质经过生物酶降解后产生的具有 霉 特殊生物学活性、氨基酸组成少于5 0 的肽类混合物。由于生物活性肽具有多种生 理功能，是重要的营养物质。且极易被人体吸收利用，医此，这些年来，生物活 性肽的研究已成为高科技领域及产业化的新热点，有着广阔的开发推广前景。 本课题研究的主要目的，一是得到一条以蛋膜为原料酶法提取生物活性肽并 通过现代分离手段对其进行分离、纯化的新工艺，为从天然原料释放多功能活性 肽的生物制品开拓一条新的途径；二是解决废弃鸡蛋壳所造成的环境污染，变废 为宝，保护环境。 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期 间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论 文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：垂血i 指导教师签名： 皇给 ，哆年j 月上舌日q 弭f 月瑚日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：秩d ，刁年r 月瑶日 第一章文献综述与研究问题的提出 1 1 研究背景 随着人们消费意识与健康观念的更新以及人民生活水平的迅速提高，我国禽 蛋生产水平有了很大的发展。从1 9 8 5 年至今，我国禽蛋总量已连续2 2 年雄踞世 界第一位，禽蛋产量每年超过2 0 0 0 万顿，占世界总产量的4 2 ，蛋业产值超过 1 2 0 0 亿元。2 0 0 4 年我国禽蛋产量为2 8 4 5 万顿，2 0 0 5 年，禽蛋产量为2 8 7 9 万顿， 人均占有量达到了2 2 公斤，人均蛋品消费量已超过世界平均水平，与美国、法 国等发达国家接近。目前，蛋与蛋制品成为我国人民除猪肉外的第二大蛋白质消 费品f “。 在鸡蛋的开发利用上面，人们一直延用多年的传统习惯，仅利用了可直接食 用的部分鸡蛋清和鸡蛋黄，将不能食用的大量鸡蛋壳随意丢弃，近些年以来， 随着人们环境意识的加强和环境治理力度的加大，这些大量抛弃的鸡蛋壳的综合 利用已经引起了人们的注意和重视。鸡蛋外壳( 包括壳的内膜) 约占鸡蛋总重的 1 2 1 3 ，据资料统计，一个中等城市每月抛弃的鸡蛋壳总量高达5 0 8 0 吨， 我国每年丢弃的鸡蛋壳约4 0 0 万吨，而且随着人类的自然增长和消费水平的不断 提高，这一数字还会随之而增加，若不及时处理，就会对环境造成越来越严重的 污染i 蚴。鸡蛋壳中可以利用的物质主要为蛋壳和蛋膜，国内外对蛋壳的研究和 利用已有陆续的报道1 3 - 6 1 ，但关于蛋膜回收利用的报道甚少，研究工作一直处于 滞后的状态。其实，蛋膜中也含有丰富的蛋白质，是潜在的多肽和氨基酸资源1 7 j 。 中国是人口大国，蛋的消费量非常大，蛋膜资源丰富，廉价易得。从资源利 用化的角度出发，蛋膜资源的开发不仅具有一定的科学理论价值，而且具有重要 的社会效益、环境效益和经济效益，有着越来越广阔的前景【8 】。 面对以上社会现实，本文将如何有效利用蛋膜作为研究方向的切入点，进行 了系统的研究，取得了阶段性的研究结果。 1 2 蛋膜的构造及开发现状 1 2 1 蛋膜的组成、结构和性能 鸡蛋的组成分为鸡蛋壳、蛋白、蛋黄及胚盘或胚珠四部分，其构造如图1 1 所示。蛋壳由外向内分为硬蛋壳、胶质膜、蛋膜和气室。蛋膜是位于蛋壳与蛋清 之间的纤维状薄膜，大约厚7 0 # m ，约占鸡蛋湿重的1 0 2 ，干重的0 2 4 ，由外 蛋壳膜和内蛋壳膜构成，为双层结构。在蛋未产出以前是没有气室的，当产出后 遇冷，内容物收缩，外蛋壳膜和内蛋壳膜之间分离，于是在蛋的钝端就形成了气 室。鸡蛋内蛋壳膜附着一层白色半透明而富于营养的粘性半流动体物质，由浓厚 蛋白及水样蛋白组成1 9 l 。 图1 1 鸡蛋的构造 f i g 卜1s t r u c t u r eo fe g g 蛋膜的主要成分是蛋白质，以糖蛋白的形式存在，类似于细胞膜蛋白质的构 成【。蛋膜中含有约9 0 的蛋白质、3 的脂质体和2 的糖类。其中的蛋白质有 角蛋白、胶原蛋白( 大部分为l 、v 、x 型) 、复合蛋白等，如0 c 1 7 ( o v o e l e i d i n ) ， 唾液酸糖蛋白( s i a t o p r o t e i n ) 、o p n ( o s t e o p o n t i n ) 、卵清蛋白( o v a l b u r f i n ) 、 溶解酵素( 1 y s o z y m e ) 、卟啉蛋白( p o r p h y r i n ) 等【1 1 】。 蛋膜中还含有很多可溶性的高分子化合物，如n - 乙酰氨基葡萄糖半乳糖、葡 萄糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素、氨基酸等。蛋膜中的无机物有钙、镁、锶， 而几乎不含铅、铝、镉、汞、碘。此外，蛋膜还含有粘多糖类的碳水化合物【l l 】。 蛋膜中的氨基酸组成可见表1 1 【切。 表1 - 1 蛋膜的氨基酸组成佴) t a b 卜1a m i n oa c i dc o m p o n e n t si ne g g s h e iim e m b r a n e ( ) 由表1 1 可见氨基酸组成中脯氨酸( p r o ) 、胱氨酸( c y s ) 居多，同时含有弹 性蛋白特有的锁链素和胶原蛋白特有的羟脯氨酸( h y p ) 、羟赖氨酸( h y l y ) 蛋膜的特定组成和结构决定了蛋膜的特殊性【1 1 1 。有关研究者对蛋膜做了半 透性实验【1 3 1 ，将生鸡蛋分别浸入乙酸溶液、葡萄糖溶液和水中，过夜，实验结果 见表1 2 。 表1 - 2 蛋膜的半透性实验结果 t a b 1 - 2t h er e s u i to fs m i - p e r m e a b l ee x p e ri m e n to fe g g s h e i il u e 1 b r a n e 结果表明，鸡蛋膜能选择性的通过乙酸、水等小分子物质，不能透过葡萄糖 等大分子物质。 日本科学家发现蛋膜可以在p h - 5 0 、3 0 、2 0 条件下，分别吸附铀、钍和钚 放射性元素。未经消毒的鸡蛋壳上通常有沙门氏菌( s a l m o n e l l a t y p h l m u r i u m ) ， e r n s tr t l l 2 1 和s a k c h a ih i m a t h o n g k h a m t 1 4 噜先后研究了蛋清及蛋黄感染和消除沙 门氏菌的条件，m a r keb e r r a n g 等发现蛋膜对沙门氏菌也有阻滞作用。p o l a n d 和 s h e l d o n l l 5 1 在2 0 0 1 年又发现蛋膜内的溶解酵素和n - 乙酰氨基葡萄糖半乳糖可以 分别阻止革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌进入蛋清中。 1 2 2 蛋膜的开发和应用现状 1 2 2 1 医药卫生领域 表皮损伤、创伤和炎症一直是医疗难题。传统的预防感染和抑制发炎的治疗 方法是消毒、抗生素、抗变态反应药物治疗。中药是中华民族的宝贵财富，我国 很早就知道用鸡蛋膜( 俗称凤凰衣) 治疗褥疮、手足体癣、烫伤、声哑等病型蜘， 但对蛋膜的治病机理及有效成分研究较少。1 9 9 7 年，叶立云、成源达等研究了凤 凰衣对黄羽鸡的防病机理和对小白鼠的作用效果【玲切。研究表明构成蛋膜的蛋白 质很像是掺有弹性蛋白的胶原蛋白，结构独特。胶原蛋白在皮肤移植、角膜手术、 外科手术缝合、溃疡病治疗等领域的独特疗效早有论述。蛋膜中含有其自重1 0 左右的胶原蛋白，特别是其中的x 型胶原蛋白还可以防止钙化，可使移植的心脏 瓣膜寿命增长，可治疗骨质增生等。纯的x 型胶原蛋白市价为1 0 0 0 美元艟，然而 成功地从蛋膜中提取纯的胶原蛋白尚未见文献报道。由于疯牛病的出现，胶原蛋 白的常见原料牛腱势必受到质疑i 堋，鸡胶原蛋白有取代牛胶原蛋白的趋势，而蛋 膜中宝贵的胶原蛋白，特别是x 型胶原蛋白的精制，值得关注。目前利用蛋膜制 作人工皮肤的研究也正在进行之中。 蛋膜薄，强度大，有弹性，适合覆盖皮肤表面，而且蛋膜的多孔结构能使水 分和气体自由通过，促进受损组织的生理恢复。在蛋膜粘附的蛋清高蛋白和内膜 的刺激作用下，血管进一步扩张，为修复创面创造有利条件。蛋膜的这些理化特 性都使得蛋膜成为较好的预防和治疗皮肤病的医学生物制剂，而且蛋膜价格便 宜，无副作用，疗效快，效果好，且无需通过特殊加工技术，容易得到，便于临 床应用1 1 恻。 1 2 2 2 化妆品领域 研究发现，蛋膜对皮肤细胞有较强的保健作用，可用于美容功能食品、抗衰 老的化妆水、香脂、洗浴用品等。对蛋膜美容抗衰功能食品的研究，为蛋膜的综 合利用起到了一个抛砖引玉的作用。 1 9 9 5 年，日本h i m y u k lk a k o k i ，y o s h i g u k i k o n o 等 2 1 】将干燥的蛋膜与2 m o l l 的n a o h 溶液、无水乙醇相混合，在4 0 下搅拌5h 。液化的蛋膜用纱布过滤，中 和，除去盐分，制得1 的蛋膜水溶液( 水解蛋膜溶液) ，将其与生育酚混合， 用于皮肤脂质过氧化物的消除，效果比单独使用生育酚优越。美国一家公司用水 解蛋膜、羟基乙酸、生育酚亚油酸酯、鳖烷、茶芥提取物等制得e 3 型再生乳膏， 我国每瓶( 3 0 m l ) 售价5 5 0 0 元。另外，使用蛋膜及其水解产物来调配的护肤霜、 洗发香波等在国外己大量生产。 王淑珍等人研制了纳米蛋膜美容保健奶。蛋膜美容保健奶和一般鲜牛奶一样 为乳白色液体，但比一般鲜牛奶的香味更浓，因为蛋膜粉的蛋白质中天冬氨酸、 谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸等有关香味成分的氨基酸含量高，与奶香混为一体，浑 厚、浓郁，这些香味都是天然成分，营养、安全。而且蛋膜经过超微粉碎呈纳米 粒度( 4 6 1 5 r i m ) 后，表面效应和粒度效应呈现出与常态完全不同的物理、化 学、生物学效应，促使蛋膜粉的生物活性增强；生物利用度提高；改变了蛋膜粉 在人体内的分布特征，达到靶向补给，使蛋膜美容保健奶的生物学价大幅度提高， 通过保健功能的分析，说明该产品确为纯天然的功能食品【1 0 l 。 1 2 2 3 轻工领域 1 9 8 8 年，日本m i y a h a r af u m i o 等将蛋膜粉与纤维材料混合，根据需要加入 适量表面活性剂、分散剂、消泡剂或增稠剂可以制得蛋膜纸【捌。1 9 9 3 年，日本 o y a m a at o s h i o 用胶粘剂与纤维材料与小片蛋膜通过高压制得蛋膜纸1 2 3 1 。以上两 种造纸方法可以减少森林伐木和清除水中放射性元素。1 9 9 7 年，日本k a w a g u c h i ， y o s h i h i r o 将蛋膜粉用于敛油剂、除皮脂剂等的制备取得成功【刎。美国i o w a 州立 大学用蛋膜粉与水性可塑剂、甘油、丙烯醇( p g ) 、聚乙二醇( p e g ) 2 0 0 和 p e g 4 0 0 按适当工艺混合，制得了鸡蛋蛋膜蛋白可降解塑料【2 5 l 。 用蛋膜作模板制备仿生纳米超结构材料的方法，涉及一种仿生纳米超结构材 料的制备技术。先将蛋壳除掉表面矿物质得到蛋膜，用去离子水清洗后备用。然 后取浓度为0 0 5 0 2 0m o l l ，离子摩尔数之比与产物化学式相对应的含钙、钡 离子的阳离子化合物的溶液和含铬酸根、硫酸根、钼酸根、钨酸根的阴离子化合 物的溶液，分别放置于蛋膜的两侧，调节p h ，室温下反应1 0 1 5h 。最后取出蛋 膜两侧的反应产物，室温下离心分离，弃去澄清液，沉淀物依次用丙酮、去离子 水洗涤；蛋膜也用丙酮、去离子水洗涤，所有产物合并即为松柏状( 或田螺状、 花瓣状、羽毛状、棱柱状等) 仿生纳米超结构材料。该发明成本低廉、工艺简单、 无任何污染、产物具有良好的仿生形貌，可广泛应用于开发各种功能性纳米仿生 材料及器件【硐。 日本科学家最近开发了一系列巧妙利用蛋膜的新技术，成功地将加工成直径 仅为5 微米的极细的蛋膜粉末添加至纺织纤维里，即可制成一种特别的新型纤维。 据悉，以这种新纤维缝制的内衣，每根纤维表面都含有蛋膜成分，因而当纤维接 触皮肤时，皮肤上的皮脂会使蛋膜成分融化，此后皮肤中的胶质便大为增加，皮 肤自然就变得颇富弹性了。此外，蛋膜成分还有自动调节皮肤湿度的功能，故可 有效抑制皮肤的干燥和老化。最后，由于黏附在纤维表面的蛋膜粉末极为细小， 所以织物往往手感很好，穿上后感到十分滑爽、舒适。目前，除“蛋膜内衣”已 进入市场外，掺有蛋膜成分的纤维织成的运动服以及袜子也将陆续上市闭。 1 2 2 4 分析测试领域 日本科学家通过研究发现，蛋膜对金属有良好的吸附性，利用蛋膜可回收贵 金属。将蛋壳破碎，水洗，倾析分离，便可得到蛋膜。每1 9 这种蛋膜粉，能吸附 铜2 2 9 m g ，银7 1 5 m g 。同时，已吸附银的蛋膜粉对霉菌、酵母菌及其它细菌在2 0 0 1 0 0 0 m g m l 的浓度下，显示有抗菌性。 将干燥的蛋膜粉浸在金属溶液中，进行振荡，使其吸附金属离子。在p h 为 2 7 时，1 9 蛋膜粉能吸附3 0 0 m g 以上的金属钯及白金。蛋膜粉在高浓度的铜和镍的 存在下，能选择性吸附金属钯，在稀浓度下，共存的铜和镍不影响蛋膜对金属钯 的吸附，溶液中钯的浓度可在5 h 内减少到1 m 班以下。蛋膜粉对金、铑等贵金属 也有吸附性，其吸附类型与吸附钯和白金不同，有利于金属元素的相互分离。 蛋膜吸附的金属量超过角蛋白、胶原蛋白、弹性硬蛋白对金属的吸附能力。 由于利用蛋膜可回收贵金属，因此，除了可用蛋膜从贵金属的溶液中提取贵金属 外，还可以用蛋膜净化受贵金属污染的工业废水及污水【篮】。 长期以来，矿样中金银的测定，都是溶矿后用王水提取，泡沫塑料或巯基棉 动态吸附金银，再灰化，然后用原子吸收光谱法或光度法测定。中国地质大学材 化学院盛绍基教授研制的“试纸法测定金和银”是采用鸡蛋膜小片吸附金和银后， 用硫代米蚩酮( t m k ) 显色剂直接在片上显色，与标准色谱对照即可得结果， 大大简化了操作手续，降低了成本，适合野外现场快速测定。该方法目前正在申 请发明专利【捌。 1 3 生物活性肽概述 1 3 1 生物活性肽的含义及来源 蛋膜是天然角蛋白和胶原蛋白的来源之一，角蛋白和胶原蛋白都是不溶性的 大分子硬蛋白质，为纤维状结构，很难被人体直接吸收。只有被水解成小分子肽 类和氨基酸后才能被吸收利用，满足各组织器官的需要，提高人体对营养物质的 有效利用率【3 。 肽类( p e p t i d e s ) 是氨基酸通过酞胺键( 肽键) 相互连接形成的化合 物，其实质可以看作是构成蛋白质的片段，它与蛋白质的区别在于肽类的 聚合度较小，而蛋白质较大。肽类物质，作为生命活动的基本调节物质， 担负着十分重要的角色，如激素、促激素、神经调质以及许多器官合成、 释放的功能调节因子等等，都是调节机体功能、维持生命活动的重要生物 活性物质【3 2 1 。通常所说的寡肽( o l i g o p e p t i d e s ) 指的是含有十个以下氨基 酸残基的肽类。其中仅含2 3 个残基的肽一般被称作小肽( s m a l l p e p t i d e s ) 【3 3 1 。生物活性肽( b i o a c t i v ep e p t i d e s ) 是指组成蛋白质分子的 氨基酸数目少于5 0 个，分子量小于6 0 0 0 道尔顿，在构象上较松散，具有 某些特殊生理功能和生物活性，对生物机体的生命活动有裨益的肽类1 3 4 1 。 生物活性肽的来源主要有三个方面：( 1 ) 存在于生物体中的各类天然活性 肽。( 2 ) 消化过程中产生或者体外水解蛋白质产生的活性肽。( 3 ) 通过化学方 法( 液相或固相) 、酶促合成法、重组d n a 技术合成的活性肽【蚓。 1 3 2 生物活性肽的吸收和生理作用 大多数蛋白质的分子结构非常复杂，相对分子量在l o 万道尔顿以上， 并且分子高度压缩、折叠，形成了立体规则实体，正是这些复杂的结构严 重影响了机体的消化和吸收率。 现代营养学理论曾认为蛋白质只有彻底被降解为氨基酸才能被人体 吸收。随着研究的深入，发现在胃肠道是由胃蛋白酶启动蛋白质的消化过 程，然后由胰酶( 如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶) 和黏膜肽酶最终将其水解 为寡肽和游离氨基酸。寡肽通过小肠吸收，食物中约3 0 7 0 的氮是以 寡肽的形式被机体吸收，进入门静脉循环，这一发现为活性肽的临床营养 研究奠定了理论基础。 作为基础营养物质，肽比氨基酸更易吸收，生物利用度更高。实验证明：小 肠中的小分子肽比蛋白质、氨基酸的利用率高3 0 5 0 。肽优于氨基酸，一是 肽比氨基酸吸收速度快；二是肽能以完整的形式被机体吸收；三是肽为主动吸收 ( 氨基酸属被动吸收) ；四是与氨基酸比较，肽的吸收具有低耗或不需消耗能量 的特点，肽通过十二指肠吸收后，直接进入血液循环，将自身能量营养输送到人 体各个部位；五是肽吸收较氨基酸具有不饱和的特点；六是氨基酸只有2 0 种， 功能可数，而肽以氨基酸为底物，可合成上千上万种；七是各种肽之间转运无竞 争性和不存在抑制性1 3 6 1 。因此，人体吸收蛋白质的主要途径，是以肽的形式吸收 的。 若氨基酸为蛋白质的二次深度开发，肽就是其三次深度开发产品。肽既是宜 吸收的营养物质基础又具有调节各种生理功能的作用 3 7 - 3 9 1 ： ( 1 ) 提高智商肽可以实现跨膜转运，透过血脑屏障，直接供给脑细胞营 养。肽能促进神经细胞的生长和发育，活化记忆细胞能。 ( 2 ) 调节神经系统蛋白质在消化道内水解产生的某些肽类具有神经递质 的作用。如b - 酪蛋白的水解产物酪啡肽，其氨基酸排列顺序与内源阿片肽的n - 末端顺序相似。这种生物活性肽可被肠道吸收入血而发挥神经肽的作用。神经系 统中，神经肽是人和动物生长和激素调节的重要物质。例如：p 活性肽能兴奋平 滑肌和由于舒张血管而降低血压；神经紧张肽( n t ) 能降低血压，对肠和子宫 具有收缩作用，它能在不影响生长激素或促甲状腺素释放的情况下增加黄体生成 素( l h ) 和卵泡刺激素( f s h ) 的分泌；内啡肽与脑啡肽的衍生物有着很强的 镇痛作用；1 9 7 5 年m o n n i e r 发现的催眠肽( d s i p ) 是唯一没有副作用的多肽。 ( 3 ) 防病治病肽对人体自身免疫机能具有双向调节的作用。研究结果证 实白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子( f t s ) 等可以引起免疫t 细胞的分化。 一种环状的1 4 肽( s s t ) 能治疗糖尿病、胃溃疡、胰腺炎。生长激素( s t h ) 或 人体生长激素( h g h ) 是一种线型多肽，能治疗侏儒症。治疗风湿关节病、支 气管哮喘和肾病中使用的2 4 肽a c t h 有明显的治疗作用。肽可以促进肠道有益 菌群的生长与繁殖，提高菌体蛋白的合成，增强机体抗病力。不仅如此，蛋白质 水解产生的肽具有某些免疫活性。有资料表明，经蛋白酶、凝乳酶消化获得的伊 酪蛋白c 末端序列1 9 3 2 0 9 ，可诱发大鼠淋巴细胞大量增殖。关荣发等报道，在 饲料中添加酪蛋白磷酸肽能提高血清中免疫球蛋白g ( k g ) 、免疫球蛋白a ( 1 e a ) 等抗体水平。同时酪蛋白磷酸肽使肠道内抗原性i e , a 和总i e , a 得到显著提高。 ( 4 ) 延缓皮肤衰老、延长健康寿命肽具有抗氧化、清除体内过多自由基 的作用。“寿斑”即老年斑是皮肤上的棕褐色斑块，这些斑块同时存在于人体的 内脏器官上。随着年龄的增长，“寿斑”会越来越多，同时人体会表现出神经官 能不全，记忆力、智力等障碍，标志着人体的衰老。由于活性肽分子量小、结构 紧凑，能最大限度地捕捉和消除体内过多“自由基”及有害质，抑制自由基对自 由基质的过氧化作用，使细胞功能修复，保持肌体活力，减少色素沉着的发生， 从而阻止“寿斑”的出现。肽的这种抗氧化作用也具有抗衰老作用，使身体各系 统之间健康、有效增强机体免疫功能，维护细胞正常代谢，延缓细胞衰老，使人 延年益寿。肌肽是大量存在于动物肌肉中的一种天然二肽，具有抗氧化活性。有 研究表明，大豆蛋白酶解液中可分离出6 种具有抗氧化活性的多肤。 ( 5 ) 消除疲劳、改善体力状况肽具有抗疲劳、增加肌肉、促进代谢的作 用。由于活性肽具有易被吸收利用的特点，所以，当体内消耗过多的营养物质时， 体内会出现内环境失调，各系统功能处于低效状态，感到疲劳，服用活性肽就能 迅速地使缺乏的活性物质和营养得到补充，从而改善细胞代谢，恢复失调的内环 境，使其协调工作，从而达到消除疲劳的目的。 1 3 3 生物活性肽的开发现状及前景 生物活性肽的开发应用是当前生物工程领域的热门课题，被广泛应用于医 药、保健、食品、化妆品等行业，是正在形成的具有广阔前景的新产业。2 0 世 纪8 0 年代，国际上如日本、韩国、美国和欧洲等国家都已经有了专业的多肽经 营企业进行产业化运作，交流和研究课题涉及生物、化学、制药、食品等众多与 多肽相关联的产业。 在欧美和日本，已经形成广泛的多肽市场，产品主要有两个方面，一类是多 肽药品和试剂，目前世界上有大约1 0 0 多种多肽药物上市，这类产品纯度非常高， 价格也非常昂贵；另一类是以活性多肽为功能因子的低抗原保健食品和含多肽的 普通食品。多肽应用于食品( 保健食品、营养食品、普通食品) ，开始于上世纪 8 0 年代的日本，随后多肤食品在美国、西欧等发达国家也方兴未艾。目前多肽 食品已经形成产业，许多著名的公司成系列的开发多肽食品、多肽食品添加剂以 及添加多肽因子的配餐等。功能肽作为一种高科技产品已广泛应用于各类食品， 在日本、美国和西欧，含有多肽的健康食品层出不穷，有多肽饮料、多肽儿童午 餐、多肽老人套餐、多肽运动食品，促钙吸收食品，降压食品等。 我国对多肽的研究和开发起步较晚，但随着现代科技的飞速发展，从天 然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高，一些新方法、新思路的应用，使 得新的肽类物质不断被发现并应用于防病治病中。目前，在我国多肽保健品和多 肽食品的应用势头越来越广泛，已经有不少企业涉足多肽行业，推出的产品也不 下几十种，生产已经初具规模。但从总体来看我国多肽产业尚处于布局分散、规 模小、产品体系乱，产业链远未形成的初级阶段，应该说国内的多肽产品市场正 在逐步形成，广阔的市场前景已初现端倪。生物活性多肽以其独特的健康概念， 全新的科技内涵和良好的工艺性能，将会开创一个人类健康事业的新天地1 3 6 】。 1 4 研究的目的 通过本课题的研究可以达到以下目的：( 1 ) 在技术上得到一条从蛋膜中制备 生物活性肽的新工艺，为生物活性肽的生产提供一条新的途径。( 2 ) 将废弃的 蛋膜进行综合利用、变废为宝，达到保护环境以及资源化利用的目的。( 3 ) 为人 类医疗水平和生活质量的提高做出一定的贡献。 第二章酶法制备生物活性肽工艺研究 2 1 实验方案的确定 目前，生物活性肽的制备方法很多，归纳起来主要包括以下几种1 4 0 】： ( 1 ) 提取法 提取法，即从富含肽的生物机体内通过不同的工艺将其提取出来，可采用盐 析、层析、沉淀等物理方法，分离纯化出以天然形式存在的活性多肽。由于此方 法的原料来源，种类有限，因此限制了提取法的应用范围。 ( 2 ) 合成法 化学合成法，即把氨基酸附着在载体上，然后从氨基端或羧基端逐步增长肽 链来合成所需的多肽； 酶合成法，即用蛋白酶来催化肽键的生成以合成多肽； d n a 重组技术，即先从复杂的基因组中分离出带有目的基因的d n a 片断， 然后将此片断克隆至适当的载体并采用特定方法将其导入受体细胞，通过细胞表 达获得所需要的活性肽。 合成法虽然可以合成具有生理功能的活性肽，但反应不完全，某些肽链上氨 基酸缺损、纯度不高、分离困难、且副产物多，成本高等，不利于应用和推广。 ( 3 ) 水解法 化学水解法，即以天然蛋白质为原料，经酸水解或碱水解得到多肽； 酶解法，即通过选用合适的蛋白酶，水解蛋白质的多肽链，使其释放出功能 性的肽片段。 化学水解法虽然工艺简单，但难以控制水解程度，参与水解反应的酸、碱浓 度高，水解后必须除酸或除碱，成为工艺过程中的主要工序；水解后产物是否安 全，在短期内难以诊断。而且，酸碱化学物质性质较烈，水解出的多肽，结构和 功能会遭到破坏( 碱法水解尤为突出) ，营养价值大大降低。在多肽感官性质上， 蛋白质本身没有苦味，但经酸碱水解的蛋白质往往会出现苦味。采用蛋白酶进行 酶解反应生产肽制品，其优点在于，首先反应的温度和p h 比较温和，可以进行 定位水解产生特定的肽，且水解过程易控制。此外，其反应过程不会对环境造成 危害，安全性高。酶解法不仅不减原蛋白的营养价值，而且还能获得比原蛋白更 多的功能，同时还可以保持多肽的天然绿色属性，酶解出来的多肽没有苦味和异 味。随着发酵工业和基因工程的发展，酶的制取及提纯工艺日渐成熟，酶的产量 和活性大幅提高，使酶的生产成本也随之急剧下降，从而使酶解法得到生物活性 肽的优点更加突出。 蛋膜是一种纯天然的蛋白源，蛋白质含量丰富，氨基酸组成平衡，营养价值 高，是很好的活性肽制备原料。基于以上的分析，本课题拟采用酶法从蛋膜中制 备活性肽的工艺路线。 2 2 酶及酶解机理 2 2 1 酶的定义 酶解法制各多肽，首先提到的是酶。酶是一种由于其特异的活性能力，而具 有催化特性的蛋白质，是一种特殊的生物催化剂。酶的催化作用实质就在于它能 降低反应的活化能，使反应在较低能量水平上进行，从而加速反应的进行。因此， 酶和酸、碱或有机的催化剂相比，其特点是：( 1 ) 酶是高效催化剂，能在温和 条件下大大加速反应，在可比较的情况下，其催化效率较其它类型催化剂高1 0 倍以上。( 2 ) 酶具有高的作用专一性，只能催化一种或一类反应，作用一种或 一类物质。( 3 ) 酶的化学本质是蛋白质，一切可使蛋白质变性失活的因素同样 可以使酶变性失活1 。 目前，市场上的酶制剂大多数为水解酶，按作用底物的不同，可分为淀粉酶、 蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、木聚糖酶、8 葡聚糖酶、纤维素酶、植酸酶、核糖核 酸酶等。在酶的作用下，底物大分子物质( 如蛋白质、脂肪，多糖等) 被降解为 易吸收的小分子物质，如寡肽、氨基酸、脂肪酸、葡萄糖等1 4 2 1 。 其中，蛋白酶根据其来源的不同分为：动物蛋白酶( 胰蛋白酶，胃蛋白酶等) 、 植物蛋白酶( 木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等) 和微生物蛋白酶( 枯草杆菌蛋白酶， 黑曲酶等) ；根据蛋白酶作用的最适p h 来分，可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶 和碱性蛋白酣删。 2 2 2 酶解机理 在酶的作用下，蛋白质在水溶液中肽键发生断裂，形成长短不一的多肽和少 量的游离氨基酸，如图2 - 1 所示【枷4 5 l ： p i 铲 e n z y m ej + h 2 0 4 ij 一h + ”h + h 1j - i t + ri ， p k h 图2 1 蛋白质酶解示意图 f i g 2 - 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp r o t e i n 由图2 - 1 可以看出，在水解过程中，随着蛋白质断裂为各种大小不等的多肽 及少量游离氨基酸，溶液中各种多肽和氨基酸的羧基和氨基逐渐显示出其效应， 表现为水解液的p h 随着水解的进行而下降；同时溶液中的可溶性蛋白质和多肽 的含量随水解进行逐渐增加。蛋白质酶解过程中采用的各种检测方法也大多也是 基于这两个特点。 2 3 评定蛋白质酶解效果的主要参数及检测方法 2 3 1 蛋白质的水解度( d e g r e eo fh y d r o i y s i s ，d h ) 蛋白质水解过程中被裂解的肽键数h ( m m o l g 蛋白质) 与给定蛋白质的总 一 v j c一 u j c i r n j h 一 v 0 c o u ：_ c i r n l h 一 v i c 甲2 ) i 啦 一 n h 一 v 0 c一 ， h i c l r n i h 一 一 o = c h i 卜i 凡 一 n i h 一 v i c o h i c r + 一 h j n h h + o一 u j c 甲卜i & 一 n h 一 v j c ，2卜凡 一 n j h 一 一 v 0 c一 h l c r n 1 h 一 v c一 3 h i c r n ；h hho一 v 0 c ，2)甩 一 n i h 一 v i c一 ， un，_丫r n i h 肽键数 “( m m o l g 蛋白质) 之比，称为水解度( d h ) 4 6 - 5 1 l ： d h 旦1 0 0 i l t 吖 水解度是指被水解的肽键数占肽键总数的百分比，它表示蛋白质被酶水解的 程度，是控制水解过程的一个重要参数。 对于某一特定的蛋白质来说，其_ i l “是一个常数，它可以由组成该蛋白质的 氨基酸含量计算出。在许多蛋白质中，氨基酸的平均分子量约为1 2 5 道尔顿，每 克蛋白质的l i l “约为8 m m o l 。所以只要测出水解后蛋白质被裂解的肽键数( h ) 就可以计算出相应的d h 值。由于每裂解一个肽键就同时生成一个- n h 2 基和 - c o o h 基，只要定量地测出蛋白质水解后新生成的n h 2 基、c o o h 基的量就可 以求得h 值。 水解度也可以看作水解液中游离氨基氮含量与样品中总氮含量之比，即 水解度( d h ) = ( 游离氨基氮含量，样品中总氮含量) x 1 0 0 本实验就是根据此式对水解度进行测定。 2 3 2 游离氨基氮含量的测定 蛋白质水解液中游离氨基的含量会随着水解的进行而增加，因此游离氨基氮 的含量也可以表征蛋白质水解的程度，同时也可以评价酶解蛋白质产生氨基酸的 效果。常用的测量方法有三硝基苯磺酸法( t n b s ) 、茚三酮法、甲醛滴定法等【5 2 硼。 2 3 2 1 三硝基苯磺酸( t n b s ) 法 将水解蛋白溶解于含1 s d s ( 十二烷基硫酸钠) 的热溶液中，使氨基浓度 达到0 2 5 2 5m m o l l ，将0 2 5 m l 样品与2 m l 0 2 1 2 5m o l l 的磷酸缓冲液及2 m l 的0 1 三硝基苯磺酸( 1 n b s ) 混合并在5 0 水浴中放置6 0m i n 。加入4 m l 0 1 m o l l n h 4 c i 使反