（环境科学与工程专业论文）潮土中氨氧化菌群对重金属铜和镉的响应机制研究.pdf

山东大学硕士学位论文 目录 摘要一l a b s t r a c t 3 第一章绪论5 1 1 土壤氨氧化菌群概述5 1 1 1 土壤氨氧化过程5 1 1 2 土壤氨氧化菌群分类及影响因素7 1 1 3 土壤氨氧化菌群在地球氮循环中的作用9 1 2土壤铜和镉污染概述1 0 1 2 1 土壤铜污染概述1 0 1 2 2 土壤镉污染概述l1 1 3 重金属铜和镉对土壤氨氧化菌群的影响1 2 1 4氨氧化菌群研究的分子生态学方法1 3 l 。5 研究背景、内容和意义1 4 第二章实验材料、仪器和方法1 6 2 。1 材料与仪器1 6 2 。l 。l 供试土壤1 6 2 1 2 测定仪器1 7 2 1 3 测定试剂1 8 2 2 技术路线1 9 2 3 研究方法2 0 2 3 1 土壤基本性质测定2 0 2 3 2 重金属诱导土壤样品实验2 0 2 3 3 土壤氨态氮、硝态氮的测定2 0 2 3 4 土壤潜在硝化速率( p n r ) 测定2 0 2 3 5 土壤d n a 提取2 l 2 3 6 土壤r n a 提取2 1 山东大学硕士学位论文2 3 7 实时荧光定量p c r ( r e a lt i m ef l o u r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r ) 2 2第三章重金属铜和镉对土壤潜在硝化速率的影响2 53 1 引言2 53 2 重金属c u 对p n r 的影响2 53 3 重金属c d 对p n r 的影响2 93 4 本章小结3 0第四章重金属铜和镉对氨氧化菌群的影响研究矗3 14 1 引言3 14 2 细菌及古菌的变化314 2 1c u 诱导下细菌和古菌的变化3 14 2 2c d 诱导下细菌及古菌的变化3 24 3 氨氧化细菌和古菌的变化3 34 3 1c u 诱导下氨氧化细菌和古菌的变化3 34 3 2c d 诱导下氨氧化细菌和古菌的变化3 54 4 讨论3 54 5 本章小结3 8第五章重金属铜和镉在不同诱导时间对氨氧化活性的影响研究3 95 1 引言3 95 2 土壤r n a 提取方法摸索结果3 95 3c u 胁迫下细菌和古菌代谢活性的变化4 05 4 重金属胁迫下氨氧化活性的变化4 45 4 1c u 胁迫下土壤氨氧化活性的变化4 45 4 2c d 胁迫下土壤氨氧化活性的变化4 85 5 讨论5 05 6 本章小结5 1第六章结论5 2参考文献5 3致谢5 9硕士期间发表论文6 0 山东大学硕士学位论文 c o n t e n t s a b s t r a c t 3 c h a p t e r1i n t r o d u c t i o n 5 1 1 s u m m a r yo f s o i la m m o n i ao x i d i z e r s 5 1 1 1a m m o n i ao x i d i z i n gp r o c e s si ns o i l 。5 1 1 2t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r sa n ds o r t a t i o no fa m m o n i ao x i d i z e r s 7 1 1 3t h er o l eo fa m m o n i ao x i d i z e r si nt h en i t r o g e nc y c l e 9 1 2 s u m m a r yo f c o p p e ra n dc a d m i u mc o n t a m i n a t i o ni ns o i l 1 0 1 2 1s u m m a r yo f c o p p e rc o n t a m i n a t i o ni ns o i l 1 0 1 2 2s u m m a r yo f c a d m i u mc o n t a m i n a t i o ni ns o i l 11 1 3t h ee f f e c to fc ua n dc do na m m o n i ao x i d i z e r s 。1 2 1 4t h em e t h o do f m o l e c u l a re c o l o g yt os t u d ya m m o n i ao x i d i z e r s 1 3 1 5r e s e a r c hb a c k g r o u n d c o n t e n t sa n dm e a n i n g 1 4 c h a p t e r2e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s i n s t r u m e n t sa n d m e t h o d s 1 6 2 1m a t e r i a l sa n di n s t r u m e n t s 16 2 1 1s o i ls a m p l e s 1 6 2 1 2i n s t r u m e n t s 17 2 1 3r e a g e n t s 18 2 2t e c h n o l o g yr o a d m a p 1 9 2 3m e t h o d s 2 0 2 3 1d e t e r m i n a t i o no f s o i lb a s i cp r o p e r t i e s 2 0 2 3 2t h ee f f e c to f h e a v ym e t a lo ns o i ls a m p l e s 2 0 2 3 3d e t e r m i n a t i o no f n h 4 n n 0 3 一n 2 0 2 3 4d e t e r m i n a t i o no f p n r 2 0 2 3 5e x t r a c t i o no f s o i ld n a 2 1 2 3 6e x t r a c t i o no f s o l lr n a 2 1 2 3 7r e a lt i m ef l o u r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r 2 2 c h a p t e r3t h ee f f e c t so fc o p p e ra n d c a d m i u mo np n r 2 5 i i i 山东大学硕士学位论文 3 1i n t r o d u c t i o n 2 5 3 2t h ee f f e c to fc o p p e ro np n r 2 5 3 3t h ee f f e c to fc a d m i u mo np n r 一2 9 ：；4c h a p t e rc o n c l u s i o n s 3 0 c h a p t e r 4t h e e f f e c to fc ua n dc do na m m o n i ao x i d i z e r s 31 4 1i n t r o d u c t i o n 31 4 2c h a n g e so f b a c t e r i aa n da r c h a e a 31 4 2 1c h a n g e so f b a c t e r i aa n da r c h a e at oc us t r e s s 3 1 4 2 2c h a n g e so fb a c t e r i aa n da r c h a e at oc ds t r e s s 3 2 4 3c h a n g e so f a o aa n da o b 3 3 4 3 1c h a n g e so fa o aa n da o bt oc us t r e s s 3 3 4 3 2c h a n g e so f a o aa n da o bt oc ds t r e s s 3 5 4 4d i s c u s s i o n 3 5 4 5c h a p t e rc o n c l u s i o n s 3 8 c h a p t e r5t h ei n f l u e n c eo fc ua n dc d o na m m o n i a o x i d i z i n ga c t i v i t y 一3 9 5 1i n t r o d u c t i o n 3 9 5 2o p t i m i z eo fs o i lr n ae x t r a c t i o n 3 9 5 3c h a n g e so f t h ea c t i c i t yo f b a c t e r i aa n da r c h a e at oc us t r e s s 一4 0 5 4c h a n g e so f a m m o n i ao x i d i z i n ga c t i v i t y 4 4 5 4 1c h a n g e so fa m m o n i ao x i d i z i n ga c t i v i t yt oc us t r e s s 4 4 5 4 2c h a n g e so fa m m o n i ao x i d i z i n ga c t i v i t yt oc ds t r e s s 4 8 1 ；5d i s c u s s i o n 5 0 5 6c h a p t e rc o n c l u s i o n s 51 c h a p t e r6c o n c l u s i o n s 5 2 r e f e r e n c e s 5 3 a c k n o w l e d g e m e n t s 5 9 l i s to f p u b l i c a t i o n 6 0 i v 山东大学硕士学位论文 摘要 硝化作用在全球氮循环过程中起着重要的作用，氨氧化过程是硝化作用的第 一个反应步骤，也是整个过程的限速步骤和中心环节。氨氧化细菌和氨氧化古菌 是整个自然界氨氧化作用的主要参与者。氨氧化细菌首先在氨单加氧酶 ( a m m o n i am o n o o x y g e n a s e 。a m o ) 的催化下将氨氧化成羟氨，再由羟氨氧化还 原酶( h a o ) 催化将羟氨氧化成亚硝酸。氨氧化古菌也己被证实含有氨单加氧 酶( a m o ) 和含c u 的蛋白质来完成氨氧化过程。因此氨单加氧酶( a m o ) 是 整个硝化反应过程中的关键酶。氨单加氧酶( a m o ) 是由3 个不同亚基组成的三聚 体膜结合蛋白，3 个亚基的分子量始分别为2 7 x 1 0 3 ( a m o a ) 、3 8 x 1 0 3 ( a m o b ) 和3 1 4 x 1 0 3 ( h m o c ) 。本次研究从氨氧化细菌关键酶的基因( a m o g ) 表达入手，研 究氨氧化细菌和氨氧化古菌的代谢活性，建立代谢活性和重金属之间的相互关系， 这对于建立土壤环境质量的生物学评价方法具有重要的理论意义和应用价值。 土壤重金属的污染已经成为世界各地重要的环境问题，主要来源于农业( 如， 施肥、污水灌溉、农药等) 和工业生产( 如金属矿的开采和冶炼等) ，使土壤的 重金属的含量达到原始土壤的几倍甚至几十倍，远远超出了土壤环境的承载力， 对动物、植物和微生物产生很大危害，严重威胁到生态系统的稳定性以及人类的 安全。本文根据前期研究结果，筛选出对土壤硝化速率敏感的重金属铜和镉进行 研究，供试土壤选用中国典型土壤之一( 潮土，因为潮土氨氧化菌群和硝化菌群 丰富，土壤肥沃，并且是重要的耕作土壤类型) ，研究不同浓度重金属铜、镉对 潮土潜在硝化速率的影响，还研究了这两种重金属对氨氧化菌群的影响，明确了 重金属与土壤氨氧化菌群相互作用关系。本文应用了土壤d n a 提取，r n a 提取， 实时荧光定量p c r 等分子生物学手段，对土壤氨氧化细菌( a o b ) 和氨氧化古 菌( a o a ) a m o a 功能基因的数量进行定量分析，以期阐明重金属对潮土氨氧化 菌群的作用机理，明确氨氧化菌群对重金属污染的响应机制，从而为重金属污染 的环境生物学评价方法的建立奠定基础。 山东大学硕士学位论文2本文的研究结果如下：( 1 ) 重金属c u 对供试土壤潜在硝化速率( p n r ) 的影响明显，并达到显著水平，随着c u 浓度的增加，p n r 逐渐降低。在诱导时间为5 6 d 时重金属c d对p n r 表现为显著的抑制。( 2 ) 在d n a 水平上，潮土氨氧化细菌和氨氧化古菌a m o a 基因数量并未随着重金属铜离子浓度的增加而发生显著变化，氨氧化古茵随着镉离子浓度增加发生显著的变化。然而，氨氧化菌群在d n a 水平上对重金属的响应并不敏感，需要的诱导时间更长。因此，氨氧化菌群a m o ad n a 水平的变化不能实时反应重金属的污染程度。( 3 ) 在r n a 水平上，潮土中氨氧化细菌和古菌在c u 胁迫时间为3 d 时，均随着铜离子浓度增加而显著的被抑制，氨氧化古菌在c u 浓度1 2 0 0m gk g - 1 抑制作用明显，而氨氧化细菌在c u 浓度1 0 0m gk g - 1 抑制作用明显。由此说明，氨氧化细菌对重金属c u 更为敏感。氨氧化古菌和细菌a m o a 基因活性随着c d 离子浓度增加，并没有发生显著的变化。因此，氨氧化菌群可以作为重金属c u污染的指示菌群。( 4 ) 荧光定量p c r 结果表明，氨氧化古菌丰度大于氨氧化细菌，即供试土壤中氨氧化古菌的数量更为丰富，这也就说明氨氧化古菌在土壤硝化作用过程中的重要作用不容忽视。然而，在供试土壤潮土中，氨氧化细菌的a m o a 基因活性高于氨氧化古菌，即氨氧化细菌在土壤硝化作用过程中更为活跃。关键词：氨氧化细菌；氨氧化古菌；重金属；土壤；荧光定量p c r 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t n i t r i f i c a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h en a t u r a ln i t r o g e nc y c l e i ti sat w o - s t e p ， w i t ha m m o n i af i r s to x i d i z e dt on i t r i t eb ya m m o n i a o x i d i z i n gm i c r o o r g a n i s m s ，a n d t h e nn i t r i t eo x i d i z e dt on i t r a t eb yn i t r i t e o x i d i z i n gm i c r o o r g a n i s m s t h er a t e - l i m i t i n g s t e p i st h ef i r s ts t e pi n t h i sp r o c e s s a m m o n i ai so x i d i z e dt on i t r i t eb ya m m o n i a o x i d i z e r s ( a r c h a e aa n db a c t e r i a ) v i at h ei n t e r m e d i a t eh y d r o x y l a m i n e i na o b ，t h i s p r o c e s s i s c a t a l y z e db yt h ee n z y m ea m m o n i am o n o o x y g e n a s e ( a m o ) a n d h y d r o x y l a m i n eo x i d o r e d u c t a s e ( h a o ) r e c e n ts t u d i e s h a v er e p o r t e dt h a ta o a c o n t a i na m o a ，ba n dc g e n e sf o rt h et h r e es u b u n i t so fap o t e n t i a la r c h a e a la m o ，b u t n o h o m o l o g o u sg e n e s o fb a c t e r i a lh a o ，w h i c hc a t a l y z e st h eo x i d a t i o no f h y d r o x y l a m i n et on i t r i t e h o w e v e r , a o ap o s s e s sn u m e r o u sc u - c o n t a i n i n gp r o t e i n s ， s u c ha sm u l t i c o p p e ro x i d a s e s ，s m a l lb l u ec o p p e r - c o n t a i n i n gp r o t e i n s ，w h i c hm a y f u n c t i o n a l l yr e p l a c ec y t o c h r o m e s t h ee n e r g ym e t a b o l i s mo fa o ap o s s i b l yr e l i e so n c ur a t h e rt h a no ni r o n - c o n t a i n i n ge l e c t r o nt r a n s f e rs y s t e m s t h e r e f o r e ，a m oa n d h a ow e r ek e ye n z y m ei nt h en i t r i f i c a t i o np r o c e s s a m oc o n t a i na m o a ，ba n dc g e n e sa n dt h e i rm o l e c u l e rw e i g h tw a s2 7 x1 0 3 ( a m o a ) ，3 8 x1 0 ( a m o b ) a n d3 1 4 x10 3 ( a m o c ) ，r e s p e c t i v e l y t h e r e f o r e ，i ti ss i g n i f i c a n tt or e s e a r c ht h ee f f e c to fc u a n dc do na m m o n i ao x i d a t i o na c t i v i t yu s i n gf u n c t i o n a la m o ag e n e c uc a ni n f l u xi n t ot h ee c o s y s t e m ，p a r t i c u l a r l yi n t ot h es o i le c o s y s t e m ，i ns e v e r a lw a y s t h r o u g hp e s t i c i d e s ，f e r t i l i z e r s ，i n d u s t r ya c t i v i t e s ，m i n i n ga n ds oo n i na g r i c u l t u r a l s o i l s ，c uh a sb e e nw i d e l yu s e df o rm a n yy e a r si nb a c t e r i c i d e sa n df u n g i c i d e s ，l e a d i n g t oi t sc o n s i d e r a b l ea c c u m u l a t i o n t h e s ea c t i v i t i e sl e a dt ot h ec o p p e rc o n t e n ti nt h es o i l w a st o oh i g h ，f a re x c e e d i n gs o i lc a p a c i t yt h eh e a v ym e t a lc o n t a m i n a t i o nh a v eg r e a t h a r mt oa n i m a l s ，p l a n t sa n dh u m a n sa n di tc a nb es e r i o u st h r e a tt ot h es t a b i l i t yo f e c o s y s t e ma n dt h eh e a l t ht oh u m a n s w es e l e c t e dt h ef l u v o a q u i cs o i la st h et e s t e ds o i l ，w h i c hi st h eo n eo ft h et y p i c a l s o i li nc h i n a t h es o i li sf e r t i l ea n dc o n t a i n sa b u n d a n ta m m o n i a o x i d i z i n g m i c r o o r g a n i s m sa n dn i t r i t e - o x i d i z i n gm i c r o o r g a n i s m s w er e s e a r c h e dt h ee f f e c to fc u a n dc do na m m o n i ao x i d i z i n gc o m m u n i t i e s ，i no r d e rt od e t e r m i n ec o r r e l a t i o n s b e t w e e nh e a v ym e t a l sa n da m m o n i ao x i d i z i n gc o m m u n i t i e s e x t r a c t i o no fs o i lr n a a n dd n a ，f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c rw e r eu s e dt oq u a n t i f i e dt h ea m o ag e n ec o p y n u m b e r sf o ra o aa n da o b t h es e n s i t i v i t yo fa m m o n i ao x i d a t i o na c t i v i t yt oc ui n s o i l ss h o u l db ed e t e r m i n e da n dt h er e s u l t so fw h i c hc a nb ea p p l i e da sab i o l o g i c a l 山东大学硕士学位论文m e t h o dme n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g t h em a i na c h i e v e m e n t so f t h i sp a p e ra r ea sf o l l o w s ：( 1 ) t h ep o t e n t i a ln i t r i f i c a t i o nr a t ew a si n h i b i t e dq u i c k l ya n dr e g u l a r l yw i t hi n c r e a s i n gc uc o n c e n t r a t i o na n dr e a c has i g n i f i c a n tl e v e l t h ep o t e n t i a ln i t r i f i c a t i o nr a t ec h a n g e dw i t hi n c r e a s i n gc dc o n c e n t r a t i o n w h e nt h es o i ls a m p l e sw e r ei n c u b a t e df o r5 6d a y s ，p n rw e r ei n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) ( 2 ) ma m o ad n ac o n t e n td i dn o tc h a n g es i g n i f i c a n t l ya f t e rc ua d d i t i o nf o r5 6d a y sa n dt h ea b u n d a n c eo fa r c h a e a la m o ag e n ew a sm o r eh i g h e rt h a nt h a to fb a c t e r i a la m o ag e n e h o w e v e r , t h ea o aa m o ag e n ec h a n g e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rc da d d i t i o nf o r5 6d a y si nd n al e v e l t h e r e f o r e ，a m o ad n al e v e lc a n n o tu l t i m a t e l yr e f l e c tt h ea c t i v i t yo fa m m o n i u mo x i d i z i n gc o m m u n i t i e s i s o l a t i o no fs o i lr n aa n da n a l y s i so ft h ea b u n d a n c ea n dd i v e r s i t yo fa m m o n i u mo x i d i z i n gc o m m u n i t i e sa ta m o ar n al e v e la r en e c e s s a r y ( 3 ) c e l l u l a rm r n al e v e l sw e r ea s s o c i a t e dw i t hs u r v i v a la n db a s a lm e t a b o l i s m w h e nt h es o i ls a m p l e sw e r ei n c u b a t e da f t e r3d a y sa td i f f e r e n tc uc o n c e n t r a t i o n s ，t h ea c t i v i t yo fa r c h a e a la m o ag e n ew a si n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l y ( 尸 9 9 ) f 3 】， 因此酶的这些特性使a m o 成为在环境中检测氨氧化细菌的功 能特异目标序列【9 】 突变研究表明口m d 基因的三个拷贝都是功能型的，但表达程 度不同【1 0 】。 羟氨氧化还原酶( h y d r o x y l a m i n eo x i d o r e d u c t a s e ，h a o ) 是一种由相同亚基( 脚 = 6 4x 1 0 3 ) 构成的三聚体细胞周质蛋白，它可以氧化羟氨，通过细胞色素c y c 5 5 4 气 山东大学硕士学位论文 系统进行的电子转移磷酸化形成并释放两对电子，一对被转运到a m 0 直接用于 n h 3 的氧化过程，重新氧化成羟氨，另一对用于细胞物质的合成以及a t p 的产生 【1 1 】。对于羟氨氧化酶基因( h a o ) 研究较为详细的是欧洲亚硝化单胞菌的h a o 基因， 欧洲亚硝化单胞菌中含有3 个h a o 基因拷贝 12 1 ，且它们相距甚远；除了一个拷贝的 一个核苷酸外，3 个拷贝的编码区域的核苷酸序列完全一样，只是它们编码区上 游的序列有些差异。从a m o 和h a o 两种酶的作用特性可知a m 0 和h a o 两种酶协 同作用才能完成将n h 3 氧化成n 0 2 的氨的氧化过程，a m o 和h a o 两种酶控制着 氨氧化细菌的生长速率和硝化速率。 a o bn h 3 a o a i ：l ，2 ：0 2 n oo c l i ce l e c t r o nf l o w ! r a i n 2 0 + h 刀l p m f - a t p a s e p m f i a t p a s e 厂下、 a d p + p ia t p 图1 1 氨氧化细菌( a o b ) 和古菌( a o a ) 的电子传递链中氮、氧以及电子流 的去向【2 2 】。 f i g u r e 1 1 p r o p o s e dp a t h w a y so fn i t r o g e n ，o x y g e na n de l e c t r o nf l o w i nt h e q u i n o n e o x i d i s i n ga n d r e d u c i n gb r a n c h e so ft h ee l e c t r o nt r a n s p o r tc h a i n s ( e t c ) i n a m m o n i a o x i d i s i n gb a c t e r i a ( a o b ) a n da r c h a e a ( a o a ) 【2 2 】 6 山东大学硕士学位论文 1 1 2 土壤氨氧化菌群分类及影响因素 2 0 世纪7 0 年代末期，w o e s e ” 等学者根据核糖体小亚基的核酸序列( s m a l l s u b u n i tr r n a ) 的系统发育关系，重新将所有生物划分为三大生物域，包括真核生 物、真细菌和古菌。在氨氧化生物的研究中，随着宏基因组学等分子生物技术的 快速发展和应用，发现新的微生物类群一氨氧化古菌( a m m o n i a o x i d i z i n ga r c h a e a ， a o a ) 在氨氧化过程中起着潜在的作用【1 4 1 。氨氧化古菌( a o a ) 与氨氧化细菌 ( a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i a ，a o b ) 的功能类似，即可以将n h 3 氧化为n 0 2 ，并 利用反应中所产成的化学能【l5 1 。a o a 和a o b 在自然生态系统中具有重要的生 态地位。因此，对氨氧化细菌和氨氧化古菌组成、数量和生态特征的研究，将为 探究全球氮循环过程、提高氮素利用效率、减轻氮素环境危害提供重要依据。 氨氧化类细菌可以分为3 类：1 ) a o b ，一类在好氧条件下将n h 3 氧化为n 0 2 一的化能自养型细菌；2 ) 厌氧氨氧化细菌( a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o nb a c t e r i a ， a n a m m o x ) ，这类菌在厌氧条件下获取n 0 2 - 的电子来氧化n h 3 ，从而生成n 2 ， 但通常将其归为反硝化过程；3 ) 另外，自然界中还存在一些可进行异养硝化作 用的细菌【1 剐。另外，基于1 6s rr n a 基因序列同源性的系统发育分析表明，环 境中的好氧氨氧化菌主要属于和b 和t - p r o t e o b a c t e r i a 两个亚纲。尽管1 6s r d n a 基因序列分析促进了氨氧化菌分类学的发展，但是近年来的许多研究表明，不 同氨氧化细菌的1 6 s rd n a 序列之间有高度的相似性，所以，基于1 6 srd n a 序列的亲缘关系分析的特异性和灵敏度均存在一定局限性【17 1 。叶磊等人通过分子 生物学的方法，研究白洋淀湖滨湿地岸边带氨氧化古菌与氨氧化细菌的生物多样 性和丰度分布，发现岸边带陆相区和湖相区的多样性依次降低， 陆相区的氨氧 化古菌和氨氧化细菌分别有3 和6 个操作分类单元，湖相区的氨氧化古菌和 氨氧化细菌分别有2 和6 个分类单元u 8 1 。 氨单加氧酶功能基因a m o a 在泉古菌中的发现，使研究者开始关注古菌在 各种生态系统氨氧化过程中所起的作用。现己探明氨氧化古菌广泛地分布于海洋 水相和陆地土壤等环境中。目前己证实，氨氧化细菌是化能自养微生物，氨氮 是其唯一的能量来源。然而，a o a 在自然界中的数量也较为丰富，其a m o a 基 因的拷贝数最高可超过a o ba m o a 基因拷贝数3 个数量级。并且，a o a 具有丰 富的生物多样性，水体和沉积物中a o a 的a m o a 基因很少有重叠相似的，而氨 7 山东大学硕士学位论文 氧化细菌的a m o a 基因数相对较少。化能自养型氨氧化古菌仅限于海洋中的泉古 菌，海洋中下层的氨氧化古菌被论证为存在异养和兼养等类型，土壤中的氨氧 化古菌也可能存在异养和兼养等类型，氨氧化古菌的多种营养类型可能是导致 其在自然界中广泛存在的原吲1 9 1 。 研究表明，氨氧化古菌的氨氧化途径可能与己知的氨氧化细菌不同。 h a l l a m l 2 0 1 等对泉古菌g r o p e1 1 1 a 中的c e n a r c h a e u ms y m b i o s u m 与海绵共生体的 宏基因组进行分析，发现其中存在几乎所有与化能自养氨氧化过程有关的基因簇， 包括氨单加氧酶基因( a m o a ，a m o b ，a m o c ) 、氨透性酶，尿酶、尿素运输系统、 亚硝酸盐还原酶和n o 还原酶辅助蛋白基因，但是没有发现细菌催化氨氧化过程 中第二步酶促反应的关键成分羟胺氧化还原酶( h a o ) 和细胞色素c 5 5 4 及c 5 5 2 的同系物，这一步骤是将羟胺( n h 2 0 h ) 氧化为亚硝酸盐【2 1 1 。然而，在氨氧化 细菌中，h a o 传递电子给a m o 和一个包含细胞色素c 蛋白( c 5 5 4 及c 5 5 2 ) 的电 子传递链，电子最终流向辅酶q 。氨氧化古菌中虽然没有这些细胞色素，但是它 具有大量的含有c u 的蛋白，例如，多聚铜氧化酶类( m u l t i c o p p e ro x i d a s e s ) ，含 c u 的小分子蓝蛋白( s m a l lb l u ec o p p e r - c o n t a i n i n gp r o t e i n s ) 以及潜在巯基二硫键 氧化还原酶( p o t e n t i a lt h i 0 1 d i s u l p h i d eo x i d o r e d u c t a s e s ) ，这些蛋白质在功能上也 许能够代替细胞色素的作用。这也许说明，a o a 是具有独特的氨氧化途径，它 的能量代谢依赖于含有c u 并非f e 的电子传递系统 2 2 1 。 由于氨氧化菌群生理特征上的局限性，对环境因子较为敏感等使得氨氧化这 一步骤成为整个氮素循环的限速步骤。土壤中影响氨氧化菌群的生态因子主要集 中在以下几个方面【2 3 。( 1 ) 铵浓度，铵作为氨氧化细菌的间接底物，其浓度与 a o b 的数量和种类有直接的关系，研究表明，铵浓度的增加可以直接导致a o b 数量的增加。( 2 ) 酸度，酸度是影响氨氧化菌种群结构的重要因素之一，对氨 氧化菌亦具有一定的选择性。氨氧化菌适宜生长的酸度范围为p h7 0 , - - 8 5 ，一 般在p h 值小于6 5 的环境中不易生长。( 3 ) 温度，温度可能直接或间接地影响 氨氧化菌的群落结构。研究表明， 在保证土壤湿度、铵浓度和p h 相对稳定的 情况下，温度对a o b 的直接影响表现为在中等温度( 1 5 2 5 ) 下其硝化活 性最蒯2 4 1 。( 4 ) 盐度，盐度影响氨氧化菌的生长和生理特性。研究发现，高盐 度环境下能抑制氨氧化菌的硝化活性，盐度是不同生境中a o b 种群的重要选择 8 山东大学硕士学位论文 因素之一，而盐度的变化差异还会对a o b 种群的演替速率产生不同的影响