（物理电子学专业论文）基于bdd的抗坏血酸氧化酶传感器的制备与性能研究.pdf

摘要 本论文以金刚石薄膜、生物传感器、化学修饰电极为理论基础，将掺硼盒刚石( b d d l 薄膜优异的性质和酶的催化能力结合起来，以b d d 薄膜电极为基底，分别采用共价键 合交联法、包埋法、电化学聚合法把抗坏血酸氧化酶修饰于b d d 薄膜电极表面，制得 抗坏血酸氧化酶生物传感器电极。利用循环伏安法对三种电极的电化学性能进行测定和 表征，对比分析三者对抗坏血酸的检测效果。较未修饰的b d d 薄膜电极，修饰后的电 极峰电流增大且峰电位减小，表明经化学修饰后，该电极降低了检测抗坏血酸的过电位， 灵敏度提高，最高检测限达1 1 0 q 1m o l l 。 共价键合交联法通过酰胺键的连接使抗坏血酸氧化酶固定在氨基化的金刚石表面， 修饰剂接着牢固，电极可沈涤、浸泡，导电性、反复性优于电化学聚合型和包埋型修饰 电极，检测限为1x1 0 。1 0 m o l l 。包埋法将含酶的壳聚糖溶液涂覆在电极表面，含酶的溶 质涂层干燥后形成壳聚糖酶膜。该电极制备简单，但稳定性和反复性较电化学聚合型、 共价键合交联型电极差，检测限为1 1 0 。1 0 m o l l 。电化学聚合法是在邻苯二胺的氧化 聚合过程中将酶嵌入载体材料，固化过程一次性完成，可通过控制聚合过程中电位值来 控制嵌入的酶量，所得的酶层浓度均匀。该电极电化学n 向应速度、灵敏度比共价键合型、 包埋型修饰电极快，检测限达1 1 0 川m o l l 。 关键词：掺硼金刚石薄膜抗坏血酸氧化酶生物传感器酶固定化 a b s t r a c t t h i sa r t i c l et a k i n gd i a m o n df i l m s ，b i o s e n s o r s ，c h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d ea st h e t h e o r e t i c a lb a s i s ，c o m b i n e db o r o n - d o p e dd i a m o n d ( b d d ) f i l mw i t ha s c o r b i ca c i d o x i d a s e t a k i n gb o r o n - d o p e dd i a m o n dt h i nf i l me l e c t r o d ea st h es u b s t r a t e ，t h i sa r t i c l ea d o p t e d t h em e t h o d so fc o v a l e n tb o n d i n g ，e m b e d d i n g ，a sw e l la se l e c t r o c h e m i c a lp o l y m e r i z a t i o nt o m o d i f ya s c o r b i ca c i do x i d a s eo n t ot h eb d de l e c t r o d e ，a n dt h u sa c h i e v e dt h ea s c o r b i ca c i d o x i d a s eb i o s e n s o re l e c t r o d e t h e nt h r e em o d i f i e de l e c t r o d e sw e r eu s e da st h ew o r k i n g e l e c t r o d e st o t e s tt h ea s c o r b i ca c i d a c c o r d i n gt ot h ec o m p a r a t i v ea n a l y s i so nt h et e s t i n g r e s u l t so fd i f f e r e n tm o d i f i e de l e c t r o d e so na s c o r b i ca c i d ，i ts h o w st h a tc o m p a r e dt ot h eb d d e l e c t r o d e sn o tm o d i f i e d ，t h o s em o d i f i e do n e sh a v el a r g e rp e a kc u r r e n ta n ds m a l l e rs p i k e p o t e n t i a l t h i sm e a n st h a tc h e m i c a l l ym o d i f i e db d de l e c t r o d ei sa b l et or e d u c et h ea c t i v e o v e rp o t e n t i a li nt e s t i n ga s c o r b i ca c i d ，a n dc o u l do v e r c o m et h ei n t e r f e r e n c eo fe l e c t r o a c t i v e s u b s t a n c e s a s c o r b i ca c i do x i d a s e t h ec o v a l e n t b o n d i n gm e t h o dc o u l db o n dt h ea s c o r b i ca c i do x i d a s eu n i t so n t ot h e s u r f a c eo ft h eb d de l e c t r o n s ，a n dt h ea t t a c h m e n ti sf i r mt h r o u g ht h i sm o d i f i c a t i o na g e n t ，t h e e l e c t r o d ei sw a s h a b l ea n dc o u l db es o a k e d ，i na d d i t i o nt h a ti th a sb e t t e rc o n d u c t i v i t y , r e p e a t a b i l i t y , a n ds t a b i l i t yt h a nt h ee l e c t r o d e so f b o t ht h ee l e c t r o c h e m i c a lp o l y m e r i z a t i o nt y p e a n dt h ea b s o r b i n gm o d i f i c a t i o nt y p e t h i se l e c t r o d eh a st h em a x i m u mt e s t i n gd e g r e ea s l 10 10 m o l l t h ee m b e d d i n gm e t h o dc o u l dd r o po rc o a tt h em o d i f y i n gf l u i d sc o n t a i n i n g c h e m i c a lg r o u p so n t ot h es u r f a c eo ft h ee l e c t r o n ss oa st op r o d u c et h es o l u t ec o a t i n g c o n t a i n i n ge n z y m e s t h i sm e t h o dc o u l dr e n d e rt h es o l u t ec o a t i n ge a s i e rt ob ep r o d u c e da n d m o r ec o n v e n i e n tt ob eu s e d ，b u ti tc o u l dn o te n s u r et h ec h e m i c a lg r o u p st ob es t a b l ya t t a c h e d t ot h ee l e c t r o d e ，t h e r e f o r et h es o l u t ec o a t i n gi so fp o o rs t a b i l i t ya n dr e p e a t a b i l i t y t h e e m b e d d e dm o d i f i e de l e c t r o d eh a st h em a x i m u mt e s t i n gd e g r e ea s1 10 “”m o l l d u r i n gt h e o x i d a t i o na n d p o l y m e r i z a t i o np r o c e s s o fo - p h e n y l e n e d i a m i n ei nt h ee l e c t r o c h e m i c a l p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d ，e n z y m e sa r ee m b e d d e di n t ot h ec a r r i e rm a t e r i a l s ，t h es o l i d i f y i n g p r o c e s si sf i n i s h e dw i t h o u ts e c o n de f f o r t ，a n dt h ea m o u n to f t h ee m b e d d e de n z y m e sc o u l db e c o n t r o l l e db yr e g u l a t i n gt h ea m o u n to ft h ee l e c t r i c i t yd u r i n gt h ep o l y m e r i z a t i o np r o c e s s ， r e s u l t i n gi nt h a tt h eo b t a i n e de n z y m e1 a y e r sh a v eh i l g ha c t i v eu n i tc o n t e n t ，e v e nc o n c e n t r a t i o n ， a n df a s t e re l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s et h a nt h em o d i f y i n ge l e c t r o d e si nt h et y p e so fc o v a l e n t b o n d i n ga n de m b e d d i n g p o l y m e r i ce l e c t r o d e h a sb e t t e rs e n s i t i v i t yt h a nt h ec o v a l e n t b o n d i n gt y p e ，e m b e d d e df a s tm o d i f i e d e l e c t r o d ew i t ht h em a x i m u mt e s t i n gd e g r e ea s 1 1 0 - 1 l m o l i ， k e yw o r d s ：b o r o n - d o p e d d i a m o n d ，a s c o r b i ca c i do x i d a s e ，b i o s e n s o r s ，e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n 第一章绪沦 1 1 课题研究的目的和意义 第一章绪论 抗坏血酸( 维生素c ) 在人体内的含量是许多疾病诊断的重要指标【，也是营养评 价的重要参考项【2 】。目前抗坏血酸的测定方法大多涉及贵重仪器设备和复杂专业的操作 瞄j 。部分方法用于测定血清中抗坏血酸含量时，抗污染能力差，检测灵敏度低，响应速 度和重现性比较低。 掺硼金刚石电极具有宽的电势窗口、极高的析氧过电位，可以有效避免电极表面由 于生成氧化物膜而导致的钝化现象。其强大的抗污染能力和较长的寿命克服了一般电极 在电化学分析上的不足，它的碳碳强键和出色的生物相容性，符合理想电流型生物传感 器基底材料的要求。抗坏血酸氧化酶对抗坏血酸具有专一、高效的催化氧化作用。 本文在研究抗坏血酸检测方法和存在问题的基础上，结合酶生物传感器和b d d 薄 膜电极优异的物理化学性能，提出将抗坏血酸氧化酶修饰在b d d 电极上，应用于抗坏 血酸生物传感器【3 。使所制备电极一方面保留了b d d 电极原有的低的背景电流，宽的 电势窗，高的电化学稳定性，电极表面强抗玷污能力【4 ；另一方面充分利用所修饰酶的 高效催化能力等优良特性，成为一种高效、稳定、抗干扰、寿命长的抗坏血酸生物传感 器电极。 1 2 国内外研究现状 目前对抗坏血酸的电化学检测方法主要有极谱法、伏安分析法、库仑滴定法 5 1 。 1 、极谱法 极谱法的特点是检测抗坏血酸时灵敏度比较高，检测分析结果也很稳定。但是，滴 汞电极在较正电位下容易发生氧化，而且极易挥发出有毒汞蒸气，这两项缺陷极大限制 了该法的广泛应用。王长法等【6 】用示波极谱法研究抗坏血酸与硅钼杂多酸的反应，得到 最大检测限为5 1 0 s m o l l 。他的研究发现，硅钼杂多酸的配合物可在+ 1 1 2 v ( v s s c e ) 产生一个灵敏的吸附氧化峰，此法适合于对针剂和片剂中抗坏血酸的测量。铜离子与抗 坏血酸之间能发生氧化还原反应，孙卢东 7 】等对此做了大量的研究，抗坏血酸的改变量 影响铜离子还原峰的峰高，这种定量关系可以问接反映抗坏血酸的含量。 2 、伏安分析法 1 ) 化学修饰碳糊电极的伏安分析法 刘宝红等【1 1 1 以四氰基醌二甲烷( t c n q ) 作介体，制成t c n q 碳糊电极。这种电极 检测区问较宽，对环境p h 要求不高，对水溶液中的抗坏血酸电催化氧化时，电极的响 应时问短( 小于3 0 s ) ，稳定性好，同时发挥了对溶液中的抗坏血酸的富集作用，使分析 第一章绪论 灵敏度提高。应太林等一j 用青椒籽浆与石墨粉制成青椒籽一碳糊电极，用作抗坏血酸含量 检测，该电极响应速度快，可用作伏安法快速检测抗坏血酸，选择性好，重现性高，检 测下限达9 8 7 1 0 m o l l 。张国荣等 1 0 】采用岱一环糊精一二茂铁包合物修饰碳糊电极 ( c f c p e ) ，结果显示，检测产生的氧化峰不可逆，下限为lx1 0 m o l l 。刘宝红等】 研究的四氰基醌二甲烷( t c n q ) 碳糊电极，对抗坏血酸有良好的电催化氧化作用。该 电极以t c n q 作介体，优点为对溶液浓度和酸碱度要求不高，对溶液中的抗坏血酸有富 集作用，响应时问比较短( 小于3 0 s ) ，灵敏度高，稳定性很好。 2 ) 聚合物薄膜修饰电极的伏安分析法 b a 曲“a 等【l2 】在玻碳电极表面聚合二苯基胺，选用的电解质为h c l 0 4 ，用于对尿 液中的抗坏血酸，检测限达0 2m g l 。金利通等【l3 】采用聚乙烯六氯铱酸吡啶单体聚合修 饰电极，该电极检测溶液中的抗坏血酸，得到很好的重复性和灵敏度。h u a n gs h a s h e n h 】 等以1 萘基胺聚合物膜修饰电极，常用于片剂中抗坏血酸的检测。这种电极表面络合了 n i 2 + 和c u 2 + ，电催化抗坏血酸时，需要碱性的检测介质。吴婧等【1 5 】以2 氨基吡啶聚合膜 修饰玻碳电极。该电极选择性很好，对抗坏血酸有增敏作用，能排除多巴胺的影响，检 测下限达1 3x1 0 m o l l ，重现性好。y ua i m i n j 以组氨酸聚合修饰电极，在磷酸缓冲 溶液中对抗坏血酸的循环伏安曲线显示，检测下线为4x1 0 一m o l l 。g a oz h i q i n g 1 7 j 等采 用3 , 4 二羟基苯甲醛修饰玻碳电极，该电极能抵御表面活性物质的影响，并降低了抗坏 血酸的氧化过电位。 3 ) 无机化合物薄膜修饰电极的伏安分析法 王升富等【18 j 以铁氰化镍修饰膜电极，该电极催化抗坏血酸时，阳极峰电流值随着抗 坏血酸浓度线性变化，与聚乙烯二二茂铁修饰电极相比，灵敏度提高一个数量级。刘芳等 【1 9 采用纳米氧化铁修饰电极测定抗坏血酸，该电极为电位型传感器电极，对橙汁和v c 药片中的抗坏血酸的检测限为8 9x10 - 7 m o l l 。张军等【2 0 】直接用二茂铁修饰到玻碳电极 表面，检测限达1 1 0 - 6 m o l l 。w a n gp e n g 2 1 】选用1 ：1 2 磷钼酸修饰陶瓷碳电极，表面再 生性很好，电极稳定。 4 ) 生物传感器的伏安分析法测抗坏血酸含量 e r o la k y i l m a z 掣2 2 将溶解氧探测器和黄瓜切片上的抗坏血酸氧化酶组合，固定到聚 四氟乙烯膜上，这种酶电极在1 2 1 0 。3 5 x1 0 与m o l l 范围内呈线性关系。邓家祺等【2 3 】 以植物组织膜生姜组织同氧电极配合，制得的传感器检测抗坏血酸的线性区问为1 1 1 0 3 4 x1 0 一m o l l 。马全红等 2 4 】以石墨电极为基体，苯醌用作电子传递的介体，聚乙烯 薄膜为载体，将苯醌固定在石墨电极上，然后将花椰菜组织磨成浆，修饰在苯醌修饰电 极上，它的线性区间为5 6 6 1 0 。2 5 6 6x1 0 。4 m o l l 。金利通等【2 5 】用n a t i o n 甲基紫精修 饰电极为基底，将抗坏血酸氧化酶固定在电极上，交联剂采用的是牛血清白蛋白和戊二 醛。他制各的电极，测定人体中的血清，检测限达2 5 1 0 m o l l ，该法克服了尿酸等 活性物质的干扰，提高测定的选择性和灵敏度。 3 、库仑滴定法 一般容量分析方法中，以指示剂变色确定终点，这种目测的方法观测误差比较大， 而且需要配置大量的标准溶液。而库仑滴定以电位或电流法指示终点，观测误差小，准 第一章绪沦 确度大，以f 乜解产生的滴定剂直接进行滴定，依据法拉第定律进行汁算，得出分析结果， 这种方法既快速灵敏，又精密。a n t o n i oc a m p i g l i o 2 6 1 用硫酸铜对抗坏血酸进行恒压微量 库仑滴定。沈友昌等 2 7 1 用恒电流库仑滴定法，在电极反应中使电解液碘化钾产生滴定剂 1 2 ，滴定剂与被测抗坏血酸发生定量反应。 1 3 本文的主要研究工作 本文以硼掺杂金刚石薄膜、生物传感器、化学修饰电极为理论基础【2 8 】，致力于抗坏 血酸氧化酶传感器电极的研究制备，及其对抗坏血酸检测效果的分析。 以b d d 薄膜为基底，采用共价键合交联法、包埋法、电化学聚合法将抗坏血酸氧 化酶修饰在b d d 电极上，制得抗坏血酸氧化酶生物传感器电极。详细对制备流程、测 定表征条件等进行优化选择，应用循环伏安法对三种传感器电极的电化学性质进行表 征，对比分析不同修饰类型的电极，对抗坏血酸的检测效果【5 1 。 各章主要研究内容： 第一章：对本课题的研究目的和意义，国内外研究现状进行概述，提出解决方案和 主要工作。 第二章：对生物传感器和酶传感器进行概述，介绍适用于生物传感器的化学修饰电 极。 第三章：介绍掺硼金刚石薄膜的性质，h f c v d 制备和表征方法，总结掺硼金刚石 在电化学方面的性能以及在电化学领域的应用。 第四章：共价键合交联法修饰b d d 电极，应用于抗坏血酸氧化酶传感器。本章介 绍b d d 薄膜的氨基化修饰方法；设计共价键合交联法制备抗坏血酸氧化酶电极的制备 方案和检测方法。对测定结果进行分析讨论，得出该电极检测抗坏血酸的优势和不足。 第五章：包埋法修饰b d d 电极，应用于抗坏血酸氧化酶生物传感器。本章介绍壳 聚糖的结构和溶液性质：设计包埋法制备抗坏血酸氧化酶传感器电极的制备方案和检测 方法；对检测结果进行分析讨论，得出该电极检测抗坏血酸的优势和不足。 第六章：电化学聚合法修饰b d d 电极，应用于抗坏血酸氧化酶生物传感器。本章 介绍聚邻苯二胺的结构、特性及聚合机理；没计采用电化学聚合方法制备抗坏血酸氧化 酶传感器的实验方案和检测方法；对检测抗坏血酸结果进行分析讨论，得出该电极检测 抗坏血酸的优势和不足。 第七章：总结全文。 第：章生物传感器 2 1 生物传感器简介 第二章生物传感器 2 1 1 生物传感器的概念 生物传感器是一种检测器，对目标分析物有很单一的选择性。它由感受器和换能器 两部分组成，感受器也叫生物分子敏感识别基元，通常为在电极上固化的具有识别功能 的生物活性物质，一般包括酶、核酸、抗体、抗原、激素、全细胞、组细胞器等，或者 是生物本身。感受器对特定物质具有专一的催化活性【2 9 】。换能器主要是由电化学或光学 检测元件【2 ，如电化学电极、热敏电阻、压电石英晶体、光导纤维等构成【3 0 】。当目标检 测物与功能膜中的敏感识别单元特异性反应后，所发生生化反应的反应程度，包括产生 的热、光，或生成或消耗的化学物质等，通过信号转换器转变为光、电信号，在仪器上 显示或记录下来，达到分析检测的目的。 生物传感器的组成及工作原理如图2 1 所示。在扩散作用下，底物、酶、辅酶、抗 原、抗体、维生素、抗菌素等待检测物质进入生物敏感薄膜层，和固定于其中的活性基 元发生化学反应，反应产生的光或热等信号，被对应的换能器处理，转变成可被识别和 处理的光信号或电信号，这些信号被放大、整流、去噪后，从控制单元输出，信号的大 小和类型反映目标检测物质的浓度等信息1 2 9 1 。 感受器储譬转换器绪弓输m 分t 翩 f 套二矧 9q 哆z 蠹l o i 癸l 图2 1 生物传感器的组成及i ：作原理 簿 墼 藩 墨 菪 鍪 2 1 2 生物传感器的特点 生物传感器是一种新型的检测手段，与传统的分析技术等相比，具有如下显著特点 1 、体积小 测定过程简单迅速，可实现连续在线检测，能满足现代工业的实时控制方面的要求。 第：章生物传感器 2 、灵敏度高 生物活性基元对待测物质具有的、e 司s 度特异性的催化亲和作用，使其能准确反映痕 量目标物，对于很多传统分析技术做不到的痕量检测，表现出很高灵敏度。 3 、多样性 生物之间的反应具有多样性和特异性，根据生物活性单元对这种特异性的专一性捕 捉，可设计出多种不同用途的传感器。 4 、生物相容性 生物传感器通常具有人体亲和能力，可植入人体内部，体内物质和人体新陈代谢反 应实时检测，利用反馈数据决策并控制治疗活动。 5 、重复性 敏感活性基元是固定的，可以重复使用。酶分析法等传统方法的化学分析过程步骤 繁琐、操作专业，试剂费用昂贵且不可重复使用，生物传感器很大程度上克服了这些缺 点。 6 、专一性强 每种待测物质都有专一敏感生物活性基元，生物传感器只对目标检测物具有敏感反 商 2 1 3 生物传感器的应用 生物传感器是由多门学科互相渗透而成的高新技术。近些年来，生物传感器技术更 加先进，对使用环境的要求也越来越低，导致生物传感器的应用领域不断扩大，己成为 一个独立的高科技领域。其热点应用领域主要集中在以下几个方面： l 、生物医学 酶、免疫传感器等能实时或非实时地检测体液中化学成分及变化情况，各项及时、 连续的数据是医生进行诊断和医治的依据【3 2 】。 2 、食品分析 如利用络氨酸酶生物传感器，以食物中的安息香酸对络氨酸酶抑制反应程度，依次 可以判断食品防腐剂在食物中的用量【3 3 1 。 3 、军事应用 如检测神经剧毒剂梭曼、沙林等。 4 、环境监测 传统的对污染物分析过程，包括很多步骤，如萃取、提纯，以及浓缩和色谱分离等。 步骤冗繁决定了很难在污染物现场实时快速检测，更无法满足很多要求实时得出连续分 析数据的场合。大量使用无法循环利用的试剂导致高昂的环境监测费用。生物传感器的 发展为克服这些传统分析方法弊端提供了新的手段。以环境中普遍存在的微生物细胞， 如细菌、酵母、真菌，作为生物活性识别单元，辅以自动化控制单元研制出的生物传感 器，能覆盖众多要求连续自动快速的环境监测场合。如利用重金属离子对微生物的新陈 代谢具有抑制作用而研制出的微生物b o d 传感器，对环境中重金属离子类污染物能做 出快速准确的检测；微生物毒物传感器能够对大气中c 0 2 、n 0 2 、n h 3 等污染气体连续 第一：章生物传感器 检测，广泛应用于城市空气质量检测以及重污染排气口的污染物监控；离子敏场效应晶 体管酶传感器在农产品市场应用广泛，对抗生素和农药残留量分析对保障食品健康具有 重要意义【3 3 1 。 2 2 酶传感器 在生物传感器中，酶是最常用、也是最具有代表性的生物活性基元。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 利用聚丙烯酰胺凝胶膜将葡萄糖氧化酶固定到氧电极上，制成第一代生物传感 器，标志了生物传感器的诞生【3 引。酶传感器的核心技术在于酶的固定化，各种物理方法 不问断地引入生物传感器中，跨学科的方法和技术，给酶的固定化技术以巨大推动。半 个多世纪以来，酶传感器从诞生到取得当前的进步与发展，大约划分为三个阶段。 19 6 2 年c l a r k 和l y o n s 在氧电极表面利用一种透析膜固定葡萄糖氧化酶，得到酶电 极的雏形，自此，丌始了第一代酶生物传感器的研究【3 6 1 。第一代酶生物传感器普遍采用 非活性的基质薄膜，包括反应膜或者透析膜，对酶进行电极上的固定。它的电催化作用 的完成以氧为媒介。 2 0 世纪术，第二代酶生物传感器阶段产品的特点是，酶在电极上的固定通常采用直 接吸附或共价键合的方法。作为一种生物大分子，酶的活性中心，与电极表面进行直接 电子传递时【37 l ，速率很低，且随两者之i 自j 距离的增加呈现指数衰减【3 8 】。为克服这个问题， 第二阶段的生物传感器通常以二茂铁、四硫富瓦烯等作电子媒介，加速酶的氧化还原过 程中的电子传递。 2 l 世纪初期发展起来的第三代产品的特点是，选用合适的结合剂，通过共价键合把 酶固定到化学修饰电极上，或者在多孔导电聚合物的电聚合过程中，吸附到电极表面。 第三代生物传感器无须媒介体，灵敏度更高，因排除酶介质引进过程中附带复杂性物质 或反应，该电极选择性更好。这种局限性的避丌使第三代生物传感器的应用范围得到新 的突破。近年来广泛应用的结合剂材料主要有：有机导电复合材料膜、有机导电聚合物 膜、金属以及非会属纳米颗粒等。 2 2 1 酶的固定化要求 基于对酶活性的保护，以及保证酶传感器的工作效率和寿命，固定方法应满足以下 基本要求【4 0 】： 1 、保持酶的催化活性和专一特性 这要求固定化技术保证对酶活性中心的构造进行保护。在固定过程中，应有效避免 酶活性部分的氨基酸残基受到损坏。 2 、载体与酶结合要牢固 载体不能和酶以及酶促反应的产物发生反应。载体和酶的结合牢固度满足传感器反 复多次使用要求。 3 、位阻要小 酶固定化之后产生的位阻要小，以加快反应速率。 第一章生物传感器 2 3 酶的固定化方法 在生物传感器领域，依照酶与载体结合过程中的化学反应类型来分类，酶固定化方 法可分为吸附法、包埋法、交联法和共价键合法四种。其示意图如2 2 所示。 吸附法借用物理作用将酶吸附在电极基底材料上，这类物理作用力包括范德华力、 离子键、氢键、疏水力等。吸附法工艺简便、条件温和，活化和清沈步骤极少。缺点是 酶负载量比较低，对溶液的温度、离子强度、p h 值变化和基底条件比较敏感，吸附的 酶易脱落，使用时稳定性和重复性比较差。 包埋法是将酶单元截留在高分子膜中，形成稳定的高分子酶敏感膜。这类高分子具 有三维空f b j 网状结构，网状结构允许小分子的底物和产物自由通过【4 2 1 ，阻挡大分子酶穿 过。这种方法中，酶很容易掺入高分子聚合物的凝胶中，一般情况下不产生化学修饰。 包埋过程很少改变酶的结构，但由于聚合物形成时产生自由基，这对酶的活性有一定程 度的影响。 共价键合法指将酶通过共价键作用力固定到电极表面，物理环境要求低温和生理 p h 条件。为防止电极与酶的活性部位发生键合，固定时要加入酶的底物起保护作用 州。 该方法的优点是酶分子无泄漏，与基底结合牢固。缺点是反应条件苛刻，相对于其它方 法，共价键合程序复杂，步骤繁多，耗时较长。如果酶的活性基团与基底或酶膜基质发 生共价键合，容易导致酶活性降低，甚至失活。此外，其回收率也较低。 ( 3 ) 共价结合法( 4 ) 交联法 幽2 2 酶的同定化方法示意图 交联法也是利用化学方法完成酶的固定。在酶分子问、酶分子与惰性蛋白之问双功 能或者多功能交联剂形成网状结构，酶分子与载体之问也是交联剂的网状结构完成固定 作用。戊二醛、己二胺、鞣酸、双偶氮苯、顺丁烯二酸酐等是比较常见的双功能交联剂。 - c o o h ，- n h 2 ，一s h ，一o h 等则是参与交联过程的基刚4 6 | 。如果酶活性中心与附 近基团发生反应，可能导致酶活性降低。若将交联法与包埋法、交联法与吸附法的联合 使用，固定效果将会加强。各种酶固定方法的比较如表2 一l 所示。 萋一嚣 肇遗 第章生物传感器 表2 1 不同酶i 州定方法的优缺点比较 2 3 1 共存物质的影响 如要测定血清中某一特定成分，血清中其它各种共存成分对酶膜会有影响，因此， 有必要把阻碍催化功能的物质除去。血清中共存的蛋白质或脂类物质等也会吸附在酶膜 表面，把酶的催化活性点覆盖掉。这些共存物质的存在，会使酶的寿命缩短，同时占据 高分子膜的细孔，抑制物质的扩散，使传感器的响应速度减小。因此，共存的物质对酶 膜影响很大，要对此加强重视，以保护酶膜。 2 3 2 酶电极的分类 酶传感器有各种分类方法，按照电极分类如下： 1 、氧电极型 如测定葡萄糖用的酶电极，酶膜涂在c l a r k 型氧电极上，那么作为氧化酶基质( 或 底物，这罩是葡萄糖) ，原则上就可以用这种酶传感器进行测定。测定方式是电流测定。 2 、过氧化氢电极型 氧化酶催化的反应中，多半会有h 2 0 2 生成，如氧电极型，用这些氧化酶膜制成过 氧化氢电极，即酶传感器。一般用铂电极作为阳极，氯化银电极为阴极，h 2 0 2 在阳极上 氧化，电位为0 6 v 。测定方式是电流测定。 3 、离子电极型 在酶反应中，如有h + 或其他离子生成或消失时，只要在p h 电极等电极表面上涂覆 一层酶膜，即制成离子电极型酶传感器。这种传感器的测定采用电位法。 4 、气体电极型 c 0 2 电极、n h 3 电极是在p h 电极表面上覆盖一层有透过性能的塑料薄膜而制成的。 在脱羧酶等酶反应中有c 0 2 生成，因此把这些酶膜跟c 0 2 电极结合就制成了c 0 2 电极 型的酶传感器。在氨基酸氧化酶、脱羧酶等反应中，有n h 3 的生成或消失，因此，可制 成n h 3 电极型的酶传感器。 2 3 3 酶的催化特性 与一般有机或无机催化剂相比，酶具有以下显著特点： l 、高效催化性 第一：章生物传感器 酶能降低化学反应在过渡状态的自由能，推动反应以极高的速度进行。酶的催化作 用具有明显的方向性【4 7 。 2 、高度专一性 一种酶只能对一种或一类物质起催化作用，产生特定的反应物。对除此之外的其它 物质，不具有催化活性。这种严格的选择性称为酶的专一性，或特异性。 3 、催化活性可调节 酶的催化速度受酸碱度、温度等很多囚素的影响。 4 、催化活性具有不稳定性 酶本质是一种蛋白质，所有使蛋白质变性的条件，如强酸、强碱、高温、有机溶剂、 重金属等，都可能使酶变性，进而导致失活。酶促反应要求适宜的温度、p h 等特定的 条件。它对环境变化很敏感，温度、p h 值的轻微改变，存在抑制剂，都可能导致酶活 性发生非常大的改变。 2 3 4 酶传感器的性能指标 酶传感器的性能指标包括【4 9 】：选择性、响应速度、检测灵敏度、检测极限浓度( 最 大值或最小值) 、温度、p h 的影叭稳定性、寿命等。 2 4 化学修饰电极 化学修饰电极是把带有特定功能的化学基团，通过化学或物理的方法，修饰到电极 表面。修饰基团给电极增加了特定的性能，可以针对性的提高电极的灵敏度。 要提高生物传感器的性能，电极材料应该具备以下条件： 1 ) 良好的生物相容性，以保证生物分子在传感器表面的微结构稳定，并保持其自身 良好的生物活性。 2 ) 稳定性，电极的物理稳定性和化学稳定性，保证电极性质；还要求机械的稳定性， 保证电极的寿命【4 。 3 ) 为惰性，使固定住生物分子而不干扰生物分子功能。 4 ) 表面具有活性基团，可以与生物活性基元连接。 要满足灵敏度要求，生物活性组分的固定化技术应满足以下条件： 1 ) 固定化后，生物组分的生物活性不变，或发生的微小改变不影响活性基团能力。 2 ) 生物膜和换能器接触要紧密，适应各种测试环境。 3 1 固定化的薄膜层有良好的耐用性和稳定性。 4 ) 生物膜中各种生物组分相对惰性，保持生物活性基元高度选择性 5 。 第二章生物传感器 以表面微结构的尺寸为标准进行分类，电极表面有机修饰物分为单分子层修饰物， 和以聚合物膜为主的多分子层修饰物。单分子层的制备主要有吸附法、共价键合法、l b ( l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜法、欠电位沉积法和s a ( s e l f - a s s e m b l i n g ) 膜法【5 引。多分子层 修饰电极的制备主要有气相沉积法和聚合物膜法。如图2 3 所示。常用的修饰电极有吸 附型电极、共价键合型电极、聚合物型电极三大类。吸附型修饰电极通过平衡吸附型、 静电吸附型、l b 膜吸附型和涂层型四种方法将修饰物质吸附于电极上。共价键合型电 极在电极表面含氧基上以共价键方式接合修饰化合物，完成共价键合修饰。聚合物修饰 电极时，导电聚合物在一定电化学条件下聚合到电极的表面，形成修饰膜。聚合过程中， 可以将溶液中游离的酶单位嵌入到聚合物膜中。其表面修饰的酶溶质膜微结构能使检测 物有效富集，使活性单元和反应生成物易于分离，借助对电极电位的控制，提高选择性 和灵敏度。 2 5 本章小结 图2 - 3 化学修饰电极分类 本章对生物传感器、酶传感器的主要概念、发展历程，及它们的特点和应用范围进 行了简单的介绍。并对酶的固定化要求方法，进行了详细的叙述。酶的固定方法主要有 吸附法、包埋法、交联法和共价键合法四种。与化学修饰电极相联系，将酶固定到化学 修饰电极上，既能保留电极原有的优异的性质，又可以有针对性地将修饰活性部分的性 质添加到电极上。制成更加专一、高效，性能更优异的生物传感器电极。 第二章掺硼金i r l i j 4 “刚其电极 第三章掺硼金刚石薄膜电极 会刚石捌有优异的物理性质、良好的化学稳定性，它具有高导热率、高电子空穴迁 移率和禁带宽度、高光学透过率，它化学惰性优良的机械性能i ：t ：o h 耐高温、宽带隙、高 硬度以及耐腐蚀等使得金刚石薄膜能应用于其它材料无法应用的恶劣环境中，被认为目 前最有前景的工业材料之一。但会刚石是良好绝缘体，极大地限制了它的应用范围。9 0 年代，对金刚石薄膜掺硼使金刚石薄膜成为一种兼具导电导热和极强耐腐蚀性能的材 料，这一发现大大拓展了金刚石薄膜材料的应用领域。最近几年，金刚石以其碳碳强键 和优异生物相容性被认为是应用于化学修饰和生物传感器领域非常有潜力的材料【5 3 1 。 3 1b d d 薄膜电极的性能 现有研究成果表明，b d d 薄膜电极具有以下几个优异的电化学性质： l 、宽电势视窗 在水溶液中，电极电化学窗口的大小由析氧过电位和析氢过电位的差值决定。电化 学电位窗口是衡量电极的电催化能力的重要指标。对于电分析性能来说，只有当氧化或 还原过程在电极的电势窗口以内发生，被研究物质在阳极上爿得以电催化氧化或者还 原，可以较好的分析氧化或还原过程【5 4 1 。 图3 1 金刚彳i 电势窗口与常规l 乜i 极的对比【1 2 4 】 图3 1 显示了在o 1 m o l l 硫酸中，金刚石电极与常见电极铂、金和玻碳电极电势窗 口的对比结果，其电化学势窗分别为：b d d 电极3 5v ，铂电极1 7v ，金电极2 0v ， p蠢。遥血)扫譬每_娶墓q 第二章掺删金刚f 舔孽膜l i i 极 玻碳电极2 8 v 。与这些常规使用的电极相比，b d d 电极具有最宽的电化学势窗，这一 优势，使得它能应用于过电位比较高的物质的检测，也能用于电合成高氧化性物质。 2 、低背景电流 背景电流大小与电极表面的静电容量大小有关。b d d 电极的背景电流接近于零， 在水处理过程中能耗很低，接近理想化电极。在分析检测微量物质氧化还原反应的过程 中，b d d 电极的这一特性在痕量检测方面具有极大优势，可使它得到大大高于常规电 极的信噪比( s b ) 。检测痕量物质时，在很低的检测限上，有较高的灵敏度 5 5 。 3 、高电化学稳定性 b d d 薄膜本身结构是共价形式结合的碳碳键，这种自然界最强原子组合使它及其 稳定。薄膜表面非活性的s p 3 结构以及氢终端使它具有高的电化学稳定性【5 6 1 。 c o m n i n e l l i s 的研究组曾设计一系列实验，以研究b d d 薄膜的电化学稳定性。一组 设定电流密度为3 0 m a c m 2 ，对b d d 电极进行极化，在硫酸溶液中对异丙醇进行4 0 0 小时的氧化，电极未失去活性，且没有被侵蚀迹象。另一组试验以氢氟酸为电解溶液， 长时间电解后，金刚石的表面形貌变化不大，电化学特性基本保持不变。 c 、一 c m k 丁 c ) 图3 - 2 ( a ) 掺硼金刚彳i 微电极和( b ) 碳纤维微电极 图3 - 2 为b d d 微电极( a ) 和碳纤维微电极( b ) 在实验室空气中放置一定时问后在 f e ( c n ) 6 3 - 4 - 溶液中的循环伏安曲线，支持底液为0 1 m o l l 氯化钾。由图可以看出，在空 气中暴露氧化两周之后，金刚石电极的伏安曲线几乎保持不变。而碳纤维微电极仅仅经 过一周，循环伏安曲线便出现明显变化，电极性质很不稳定【4 1 。 3 2 热丝c v d 法制备掺硼金刚石膜简介 3 2 1 合成机理 第三章掺硎金刚彳i 薄膜l 乜极 h f c v d 法是最早用来合成掺硼金刚石的方法，该方法的机理是：反应炉内，在热 丝高温作用下，氢气与含碳气体的混合气体，被分解为含碳活性基团和处于激发态的氢 原子。扩散作用驱使到达衬底的表面时，处于激发念的氢原子将一部分碳氢活性基团分 离为单个石墨结构或金刚石结构的碳原子。氢原子能快速刻蚀掉石墨相的碳，保留住金 刚石相的碳于衬底表面，使衬底上连续生长较纯的金刚石膜，保证金刚石表面的碳原子 的s p 3 杂化结构【5 7 j 。沉积过程如图3 3 所示。 玛 汛兰2渤 燃a n ：s 一强既! 毛气 h 锄瓤n 。八。i 。八八。八。八幽“撕粥 耳 h i 讯， ，- 一一一一嚣雹： i z 一 蔓蛋 f l e wa n d ，j ，丑慑 ”1 。 - 凹进。羔一一- 4 一兰4 4 一二h + + 0 ，。l ”0 ”t ”。t | ，t ” 图3 - 3h f c v d 沉积金刚彳i 薄膜示意图 图3 - 4h f c v d 法金刚彳i 沉积设备示意图 与其它设备相比，h f c v d 形核时相对困难，沉积速率比较低，生长膜耗时很长。 与此同时，它生长出的膜质量比较好，且设备装置简单，生产成本相对低，工艺条件易 于控制。相较其它技术方式，尤其易于生长出大面积薄膜。所以目前，从金刚石薄膜商 业化角度分析，热丝c v d 技术仍是最可行技术之一。沉积设备示意图如图3 - 4 所示。 s _|8土 ，o 第二章掺删金刚f i 薄膜电极 3 2 2h f c v d 沉积过程 h f c v d 方法沉积金刚石薄膜具体流程如图3 5 所示【4 1 。 j r 一 二亟司 二j 巫 - - l 一 二至巫亟 | r 一 二亟五四 广l 广l i 衬底温度监控i _ l 卜反应室气压监控 1 - - - - - - - - - - - - ， r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ， 图3 5h f c v d 方法沉积金刚彳i 薄膜具体流祥 3 2 3 金刚石与无序碳的竞争生长过程 金刚石和无序碳沉积随着碳氢比的变化呈现竞争生长关系，如图3 - 6 所示。在o 0 0 2 区间，氢原子对金刚石的刻蚀速率远大于金刚石的生长速率，在此区问无任何膜生 长：在o 0 2 1 区间，无序碳的沉积速率小于对它的刻蚀速率和无序碳的转化速率4 1 ， 是金刚石的生长区：在x l 区，氢原子的刻蚀作用降低，对无序碳的刻蚀速率小于它的 沉积速率，只有无序碳的沉积【4 1 。 1 4 第二章掺硼金刚f 一剐莫电极 3 3 金刚石的表征 3 3 1s e m 和拉曼光谱 图3 - 6 金刚彳i 和无序碳的竞争生长 实验采用h f c v d 的方法在钽衬底上沉积的金刚石薄膜，由它的s e m 图像( 图3 7 所示) 可以看出，该膜晶粒均匀，膜的连续性很好。图3 - 8 为它的拉曼光谱，从图中可 以看出，金刚石相的特征峰强度远大于非金刚石相的特征峰，表明金刚石薄膜质量很好。 蒋 耄 图3 7b d d 薄膜的s e m 照片 g y l 0 。 5 x t 0 。 釜4 t 0 。 墨 一 a 1 0 2 1 1 0 1x 1 0 0 1 2 0 01 4 0 01 6 0 01 8 0 02 0 0 0 w a v e n u m b e