（环境工程专业论文）农林废物堆肥化中木质素生物降解研究及接种剂开发.pdf

农林废物堆肥化中木质素生物降解研究及接种剂开发 摘要 目前，堆肥化处理技术已成为农业废物资源化利用技术之一，该方法能实 现农业废物循环利用，既可取得良好的经济效益，又可实现清洁生产，防止环 境污染。目前，堆肥化处理技术正进入科学化的新阶段，为了改善该技术存在 的如历时时间长，肥效低等诸多不足，提高堆肥效率、提升产品质量，使之能 大规模推广应用，国内外研究者就堆肥设备、堆肥化工艺、堆肥微生物学、堆 肥化控制以及堆肥技术和产品的应用等方面开展了大量研究工作。其中，限速 有机物的降解一直被认为是快速堆肥的关键，农业废物堆肥化中的限速有机物 主要是指木质纤维素，这类有机物结构坚硬，分解困难，与腐殖质产生有密切 联系。 木质素是农业废物堆肥化过程中的主要限速有机物，其降解被认为是快速 堆肥的关键。本研究采用p l f a 方法定量分析堆肥化过程中木质素降解微生物学 机理，并以此为依据，研究开发高效堆肥化接种剂。 应用p l f a p l s 法构建了木质素含量与p l f a 之间的定量回归模型，分析模 型参数可发现，农业废物堆肥化过程中木质素的有效降解是数量少、能力强与 数量多、能力弱的微生物共同作用的结果，前者主要是真菌、放线菌，后者主 要是细菌，其中真菌与放线菌在堆肥化过程中占主导地位。微生物种类较之数 量对于木质素降解更为有利。在高温期，有效的木质素降解微生物群落组成为： 革兰氏阳性细菌：革兰氏阴性细菌：放线菌：真菌为4 2 ：3 5 ：6 ：l7 ；在二次发 酵期为：革兰氏阳性细菌：革兰氏阴性细菌：放线菌：真菌为5 8 ：2 3 ：4 ：1 5 。 微生物浓度数量级为1 0 8 c e l l s gd w 。 选取农林废物堆肥中筛选出的木质素降解优势土著微生物枯草芽孢杆菌 ( b 口c f ，“js “6 ，f ，括) 、铜绿假单孢菌( n p “如聊o ，2 口s 口p 厂列g 砌o s 口) 、黑曲霉研印p 馏f ，z 甜s ，2 匆p ，) 、简青霉( p p 胛f c f 朋f 甜ms f 聊，f 确添f 研) 、栗褐链霉菌( & 厂印f d ，砂c e s6 口扰“s ) ，依 据p l f a p l s 定量分析所得堆肥化二次发酵期有效的木质素降解微生物群落组 成比例混合接种至稻草基质发酵瓶中，做组正交试验l 9 ( 3 4 ) 以优化混合比例， 以期研究开发一种基于木质素降解的高效堆肥化接种剂。试验结果表明：、混合 菌剂具有较强的木质素降解能力，其对木质素降解是木质素过氧化物酶、锰过 氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果；当按照个数比细菌： 放线菌：真菌为8 5 ：5 ：1 0 ；枯草芽孢杆菌：铜绿假单孢菌为5 5 ：2 5 ；黑曲霉： 简青霉为2 ：1 配比时，木质素、纤维素、半纤维素降解率最高，分别达到2 2 13 、 4 8 9 7 、5 5 9 3 。在不灭菌的前提下，按此配比接入菌剂相对于不接菌剂发酵 稻草其木质素、纤维素、半纤维素降解率分别提高1 9 1 6 、3 8 2 5 、4 6 3 0 。 i i 硕士学位论文 关键词：堆肥；木质纤维素；固态培养；p l f a 法；微生物接种剂 i i i a b s t r a c t n o w ，c o m p o s t i n gh a sb e c o m eal e c h n 0 1 0 9 yo fa g r i c u n u r a la n df o r e s t r yw a s t e u t i l i z a t i o n t h ea g r i c u l t u r a la n df o r e s t r yw a s t ec a nb er e c y c l e db yc o n l p o s t i n g w e c a ng e tag o o de c o m o n i cb e n e f i t ，r e a l i z et h ec l e a np r o d u c t i o n ， a n dp r o t e c tt h e e n v i r o n m e n tf r o mp o l l u t i o n t h ew a s t et r e a t m e n tt e c h n o l o g yo fc o m p o s t i n ge n t e r e d an e ws t a g eo fs c i e n c ed e v e l o p m e n t i no r d e rt oi m p r o v et h ed i s a d v a n t a g eo f c o m p o s t i n g ，i n c r e a s et h ec o m p o s te f n c i e n c y a n dm a k ei t c a nb eu s e di nl a r g es c a l e ， m a n vr e s e a r c h e r sa th o m ea n da b r o a dc a r r i e do u tal o to fr e s e a r c ho nt h ef i e l do f c o m p o s t i n ge q u i p m e n t ，c o m p o s t i n gt e c h n o l o g y a n dm i c r o b i o l o g yo fc o m p o s t i n g ，e t a 1 t h eb i o d e g r a d a t i o no fl i l n i t ss p e e do r g a n i cc o m p o u n di sc o n s i d e r e da st h ek e yo f c o m p o s t i n g i na g r i c u l t u r a la n df o r e s t r yc o m p o s t i n 舀l h e1 i g n o c e l l u l o s ei s t h em a jo r o r g a n i cc o m p o u n dt h a | tl i m i t i n gc o m p o s t i n gs p e e d t h i so r g a n i cc o m p o u n d h a sh a r d s t r u c t u r e ，a n di ss e p a r a t e dd i 伍c u l t l y e s p e c i a l l yt h el i g n i n ，i ti sc o n s i d e r e dt h ek e y o ff a s tc o m p o s t ，i t sd e g r a d a t i o ni se s s e n t i a lf b rt h eo p e r a t i o no fc o m p o s t i n g s i n c el i g n i ni st h em a j o ro r g a n i cc o m p o u n dt h a tl i m i t i n gc o m p o s t i n gs p e e d ，i t s d e g r a d a t i o ni se s s e n t i a lf o r t h eo p e r a t i o no fc o m p o s t i n g p h o s p h 0 1 i p i df a t t ya c i d ( p l f a ) a n dp a n i a ll e a s t s q u a r e sr e g r e s s i o n ( p l s ) m e t h o d sw e r es e i e c t e dt oe s t a b l i s ht h eq u a n t i t a t i v er e g r e s s i v em o d e lb e t w e e nl i g n i n c o n t e n ta n dp l f a t h r o u 曲t h ea n a l y s i so fm o d e lp a r a m e t e r s ，i tw a sf o u n dt h a ta f e wm i c r o o r g a n i s m sw i t hs t r o n gl i g n i nd e g r a d i n ga b i l i t ya n dp l e n t i f u lm i c r o b e sw i t h w e a kl i g n i nd e g r a d i n ga b i l i t yc o o p e r a t e dd u r i n gt h ec o n l p o s t i n go fa g r i c u l t u r a l w a s t e s t h ef o r m e rw e r ef u n g ia n da c t i n o m y c e t e s t h a td o m i n a n ti n l i g n i n d e g r a d a t i o n ，w h i l et h el a t t e rw a sb a c t e “a m i c r o b i a ls p e c i e sw e r eb e i i e v e dt ob e m o r ei m p o r t a n tt h a na m o u n t s d u r i n gt h et h e f m o p h i l i cp h a s e ，t h ee f 琵c t i v el i g n i n d e g r a d i n gm i c r o b i a ip r o p o r t i o n w a s4 2 ：35 ：6 ：l7( g r a m 。p o s i t i v eb a c t e r i a ： g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ：a c t i n o m y c e t e s ： f u n g i ) ， w h i l et h ep r o p o r t i o nw a s 5 8 ：2 3 ：41 ：5d u r i n gt h em a t u r a t i o np h a s eo fc o m p o s t i n g t h em i c f o b i a lc o n t e n t w a sa b o u tl0 8 c e l l s 儋d w f i v es t r a i n so fm i c r o o r g a n i s m sw e r ei s o l a t e df r o mt h ea g r i c u l t u r a l w a s t e c o m p o s t i n g ，t h e yw e r ei d e n t i n e da s 上；口c f j z 甜ss 甜6 ，f z i s ， 尸j p “d d ，”d 胛a s 口p ， g f 门o s 口， a s p e r g i l t u sn i g er p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m s f r e p t o m y c e sb a d i 弘s b 了a 了o tb e h g f o u n dt ob ec a p a b l eo fu t i l i z i n gs e v e r a ll i g n i nm o d e lc o m p o u n d s ，t h e s es t r a i n sw e r e p r o v e d t h a tt h e yh a dt h ea b i l i t yt od e c o m p o s e t h eh y c r o x y b e n z e n ea n d n o n h y d r o x y b e n z e n el ig n i nc o m p o u n d so fl o wm o l e c u l a rw e i g h t f o rd e v e l o p i n ga i v k l n do fh i g he 简c i e n c yo fm i c r o b e i n o c u l ai n c o m p o s t ， t h i sr e s e a r c hh a da n l n o c u l a t l o nw i t ht h ef i v ef u n g u sa c c o r d i n gt od i 疏r e n t q u o t at on a t u r a lr i c e - s t r a w a 士= t e r3 0d a y ss o l i d 。s t a t e f e r m e n t a t i o n t h ef e s u l t ss h o w e dt h a t t h em i x e df u n g u s n a dl i g m n 0 1 ) ，t i c a b i l i t yw h i c hw a sf u n h e r e dp r o v e d b yt h ea n a l y s e so fe n z y m e p r o d 唧o m f i v ek i n d so f e n z y m e s ，l 蛳np e r o x i d a s e ， m a n g a n s e sp e r o x i d a s e ， j a c c a s e ，c e m a s ea n dh e m i c e l l u l a s e w e r eb e l i e v e d t ob et h em o s t i m p o r t a n t c a t a l y z e sm b i o d e g r a d i n gp r o c e s s ，a n dt h e ya l w a y sw o r k e ds y n e r g i s t i c a l l y w h e nt h e q u o a o f6 臼c 删口： 彳c ，f ，z o 删c e 阳： 馏“s i s 8 5 ：5 ：1 0 ；b 口硎甜s s m b 锄s p s e u d o m o n n s q e r 材g i n o s al s 5 s ：2 5 ；a s p e 倒l t l s n i g e r ：p e n i c i cc l m s 2 叩删s j 砌 i s2 ：1 ， t h ed e g r a d a t i o nr a t e so fi i g n i n ，c e i l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e w e r e h e h i 曲e s ，b e i n g2 13 、4 8 9 7 、 5 5 9 3 r e s p e c t i v e l ya r e r3 0d a v s l n c u b a t l d n 】nt h ec o n d i t i o no fn o tb e i n g s t e r i l i z e d ，r e l a t i v et on o tb e i n gj n o c u d t n ee x p e r l m e n tb e i n gi n o c u l a t e da c c o r d i n g t ot h i sr a t i om a d et h ed e g r a d a t i o nr a t e so f 1 1 9 n l n ，c e l l u l o s ea n d h e m i c e 】1 u l o s e i n c r e a s e9 1 6 ，3 8 2 5 ，4 6 3 0 r e s p e c t i v e l ya f t e r 竺w o ? ：c o m p o s t 抽g “g n o c e u l o s e s ；s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ；p h 。s p h o l i p i d f a t t ya c j d ；m i c r o b ei n o c u l a v 农林废物堆肥化中木质素生物降解研究及接种剂开发 插图索引 图1 1 苯丙烷单元基本结构5 图1 2 木质素的六种基本结构6 图1 3 软木木质素结构片断7 图1 4 堆肥化中不同温度下木质素的降解8 图1 5 堆肥化过程中木质素可溶片断的1 h ，2 0 0 m h z ，n m r 谱图1 0 图1 6l i p 催化氧化v a 机理示意图1 6 图1 7m n p 催化氧化木质素机理示意图1 7 图1 8 木材细胞壁的降解1 8 图2 1 用于微生物生态领域的脂类分析技术2 5 图2 2 农业废物堆制过程中温度变化曲线3 0 图2 3 典型g c m s 分析图3 l 图2 4 提取主成分个数的交叉比对结果：3 2 图2 5 偏最小二乘因子解释的变差的百分比3 2 图2 6 偏最小二乘回归方程的参数估计3 3 图2 7 模型计算值与实测值的相关关系3 4 图2 8 指示木质素降解微生物的p l f a 聚类分析3 6 图2 9 三类p l f a 的变化曲线3 7 图2 1 0 堆肥化过程中木质素降解微生物群落结构3 8 图3 1 试验2 产l a cl i pm n p 酶活曲线4 7 图3 2 试验2 产纤维素c m c 酶活及半纤维素木聚糖酶活曲线4 8 图3 3 纤维素半纤维素木质素相对含量变化曲线4 9 v n i 硕士学位论文 附表索引 表1 1 木质素、纤维素、半纤维素在农作物残留物中的比例5 表2 1 表征特定微生物的p l f a 生物标记物2 6 表2 2 堆制过程中磷脂脂肪酸的变化3 2 表2 3 堆肥化中利于木质素降解p l f a 与对应微生物3 5 表3 1 因素水平设计4 2 表3 2 混合菌最适发酵比率试验方案4 2 表3 3 不同比例混合菌处理稻草的木质素、纤维素、半纤维素降解率4 6 表3 4 方差分析4 7 l x 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本入在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 强、笏善 日期：d 8 年f 月i 工日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 作者签名 导师签名 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不猓密口。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 日期：口3 年，月jz 日 日期：口8 每b g 月l 土日 硕士学位论文 1 1 农业废物概述 第1 章绪论 农业废物指农业生产过程中产生的、不能有效利用并可直接或间接引起环 境污染的物质。广义的农业废物包括农村生活垃圾、畜禽废物、秸秆、农用塑 料等。狭义的农业废物主要指畜禽废物和秸秆两大类。 随着集约化程度的提高和生产规模的不断扩大，包括畜禽粪尿及养殖业生 产污水在内的畜禽废物产生数量持续增加，对环境的威胁也越来越大。由国家 环保总局组织的“全国规模化畜禽养殖业污染情况调查及防治对策”显示，19 9 9 年全国畜禽粪便产量为1 9 1 0 9 t ，是当年工业固体废物产生总量的2 4 倍，部分 地区如河南、湖南、江西这一比例甚至超过4 倍。据估算，到2 0 1 0 年，全国畜 禽粪便的排放量将达4 5 1 0 9 t 。调查还发现，全国9 0 以上的规模化养殖场没有 经过环境影响评价，9 0 的规模化养殖场缺乏必要的污染治理设施。大量的畜禽 粪尿不经处理就排放到环境中，不仅污染了地表水和地下水，而且也会导致病 原菌的扩散，对畜禽及人类的健康构成威胁l lj 。据分析化验，猪粪污水c o d 达 5 0 0 0 m g l 以上，b o d 达4 0 0 0 m g l 以上，s s 达2 0 0 0 m g l ，n h 3 一n 为1 5 0 m g l ； 鸡粪污水c o d 达2 0 0 0 m g l 以上，b o d 达1 0 0 0 1 5 0 0 m g l 以上，s s 达4 5 0 m g l 。 在一些城市郊区，禽畜废物已对水源、空气和区域环境造成了严重污染，个别 地区还造成人畜共患疾病的发生【2 】。 秸秆由有机物、少量矿物质及水分构成，其有机物主要是木质素、纤维素 和半纤维素，营养价值低。农作物成熟后，秸秆中的维生素几乎已全部被破坏， 胡萝卜素含量仅为2 5 9 k g ，在农业生产中的应用面较窄。我国是一个农业大国， 农作物播种面积居世界第一。据估计，每年我国农作物秸秆总产量大于7 1 0 8 t a ， 其中稻草2 3 1 0 8 t ，玉米秸秆2 2 1 0 8 t ，豆类和秋杂粮作物秸秆1 o 1 0 8 t ，花生、 薯类藤蔓和甜菜叶等1 o 1 0 8 t ，具有数量大、分布广、种类多等特点。充分、有 效地利用这类资源却相当困难，这是由于秸秆产量随季节变化，且产量大、价 值低、体积大、不便运输，秸秆的自然降解过程又极其缓慢，导致大量的秸秆 以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，中国常年燃烧的秸秆量约为5 l o7 7 1 07 t ， 占秸秆产生总量的1 0 一1 5 ，造成极大的环境污染和严重的物质资源浪费【3 ，4 l 。 农业废物不仅是引起环境污染的物质，更是资源利用过程中物质和能量的 流失份额，是物质和能量的载体，从环境生态学角度看，农业废物是错位的资 源。从能量利用来看，秸秆和畜禽废物分别是生态系统中第一、二营养级所产 生的废物，含有能量较多。资料表明，秸秆和畜禽粪便的总氮、磷、钾贮量达 农林废物堆肥化中木质素生物降解研究及接种剂开发 4 8 7 2 x 1 0 6 t ，占农业废物总氮磷铡i 的8 1 8 5 ，囚此对秸秆和畜禽废物的利用具有 实际意义p j 。 1 2 农业废物堆肥化研究进展 党的十六届五中全会提出了建设社会主义新农村的重大历史任务。2 0 0 6 年 的中央一号文件强调：要统筹城乡经济社会发展，加快发展循环农业，大力开 发节约资源和保护环境的农业技术，重点推广废物综合利用技术、相关产业链 接技术和可再生能源开发技术。显然，农业废物特别是畜禽废物、秸秆的循环 利用，既可取得良好的经济效益，又可实现清洁生产，改善农村卫生状况，防 止环境污染，使村容整洁，是发展农业循环经济的重要方面。 近年来，国内外农业废物资源化利用技术和相关的研究项目有了较大的发 展，农业废物的资源化利用正进入科学化的新阶段。秸秆类废物资源化利用技 术主要有废物还田、加工饲料、固化碳化、气化、制复合材料、制化学品等； 畜禽废物资源化利用技术目前主要有肥料化技术、饲料化技术和燃料化技术等 【5 】 a 堆肥化处理技术是肥料化技术的一种。该技术既可实现畜禽粪便的除臭， 同时又能达到脱水、无害化的目的。秸秆作为重要的面状污染源，具有有机质 含量高、有害成分少的优点，是堆肥的理想原料【6 】。将农作物秸秆经堆肥化处理 后，将其作为有机肥料或无土栽培有机基质，是处理农作物秸秆的有效方法之 一o 1 2 1 原理与优势 放置在任一场所的有机固体废物在湿度、通风条件满足的情况下，会自动 产生热量( 如秸秆堆垛、垃圾堆垛) ，尤其在冬季这种现象更为明显，会产生大 量热蒸汽。堆肥化是环境工程中的一种利用自然界中天然存在的、或经过人类 某些改编的微生物对有机固体废物的氧化、分解能力，在一定温度、湿度和p h 值条件下使可降解有机固体废物发生生物化学降解，形成类似腐殖质土壤的物 质，达到有机固体废物处理无害化和资源化的技术方法。堆肥化的产物称为堆 肥。堆肥过程可以简单用以下反应方程式表达： 新鲜的有机废物+ 0 2丝尘望垡堂堡塑，稳定的有机残渣+ c 0 2 + h 2 0 + 能量 在堆肥化过程中，可溶性有机物质可透过微生物的细胞壁和细胞膜被微生 物直接吸收；而不溶的胶体有机物质，先被吸附在微生物体外，依靠微生物分 泌的胞外酶分解为可溶性物质，再渗入细胞。微生物通过自身的生命代谢活动， 进行分解代谢( 氧化还原过程) 和合成代谢( 生物合成过程) ，把一部分被吸收 的有机物氧化成简单的无机物，并放出生物生长、活动所需要的能量，把另一 2 硕十学位论文 部分有机物转化合成新的细胞物质，使微生物生长繁殖，产生更多的生物体。 农业废物的堆肥处理已有几千年历史，但作为一门科学技术发展却是始于 2 0 世纪，该技术在经历了一段兴衰演变后，近年来又出现了蓬勃发展的势头。 它具有运行费用低、二次污染小、符合可持续发展要求等优点，在世界各国尤 其是发展中国家大有发展前途。 农业废物堆肥化处理技术既有传统的制作方法，又有现代科学技术介入的 制作方法，两者的有效结合使用能为“三农”服务做出重要贡献，首先，提供优质 的有机肥料；再者这项技术应用显现出多方面的特点： ( 1 ) 各类有机废物或污染物得到充分利用，减轻环境污染，同时除去恶臭， 大大改善农村环境卫生条件，有益于健康； ( 2 ) 这种高温堆肥可杀灭一般的有害的致病生命体，也是防病、防疫的有 力措施； ( 3 ) 所获优质有机肥料可替代某些化肥，有利于土壤结构的改善，增加土 壤养分和提高土壤活性等作用，有益于农业增产增收； ( 4 ) 在堆肥熟化过程中所产生的热能可以充分利用，如传统方法制作酱油 笙【7 】 寸 。 农作物秸秆经堆肥化处理后有以下优点：易分解的有机物大部分分解；施 入土壤后不产生氮的生物固定；通过降解除去酚类等有害物质；消灭病原菌、 害虫卵和杂草种子。目前在世界农业提倡有机农业的前提下，通过堆肥化处理 农作物秸秆是应该大力倡导并推广的有效方法【8 】。 1 2 2 存在的主要问题 自上世纪3 0 年代以来堆肥化研究取得了长足的进展，适于不同原料、不同 地区的堆肥化设备和工艺不断出现。但总的来说堆肥法处理技术大规模应用仍 然受到限制，首要原因在于技术本身存在的诸多问题：( 1 ) 发酵时间长。农业 废物，尤其是农作物秸秆中含有大量的木质纤维素，其成分复杂，难以被充分 利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用；( 2 ) 肥效低。由于腐殖 质转化不完全，致使堆肥产品中有机物含量低；( 3 ) 产生二次污染。包括产生 臭气、堆肥渗滤液以及堆肥产品中的重金属、病原菌等不利因素。 为了解决上述问题，达到提高堆肥效率、提升产品质量的目的，国内外研 究者就堆肥设备、堆肥化工艺、堆肥微生物学、堆肥化控制( 包括过程控制和 污染控制) 以及堆肥技术和产品的应用等方面开展了大量研究工作。其中微生 物学研究是热点，因为堆肥化成功的关键是使微生物正常繁衍，一切堆肥化技 术的研究工作，如工艺、设备、腐熟评价等均需基于生物学机理【9 】。 农林废物堆肥化中木质素生物降解研究及接种剂开发 1 2 3 限速有机物的生物降解 目前堆肥化中微生物学研究主要有三方面：( 1 ) 采用传统的基于生理功能 的筛选方法从堆肥或其他生态系统中选育高效菌株，并可能通过菌种的遗传变 异或基因重组寻找高效菌株，开发适应性强、高效的堆肥菌剂；( 2 ) 进一步研 究堆肥化中某些有机质的微生物降解机理，特别是限速有机物，如木质纤维素， 为菌剂开发、过程控制、腐熟度快速检测及堆肥技术的推广应用打下生物学基 础；( 3 ) 改善固体废物颗粒问隙微生物生长繁殖以及生化降解反应的生态微环 境，使之更有利于微生物对有机垃圾的分解反应，如微生物在代谢过程中产生 的一种自我调节生物微环境的物质生物表面活性剂在堆肥化中的应用【9 j 。 堆肥化中限速有机物的降解一直被认为是快速堆肥的关键，也是高效复合 菌剂丌发的理论基础。农业废物堆肥化中的限速有机物主要是指木质纤维素， 其主要结构形式是纤维素约占4 0 ，半纤维素约占2 0 一3 0 ，木质素约占2 0 一3 0 。 这类有机物结构坚硬，分解困难，与腐殖质产生有密切联系。 纤维素是植物残体中最丰富的部分，它是由p ( 1 4 ) 键的葡萄糖单元所组成的 长链状大分子。通常一条链中含有l o o o o 多个葡萄糖分子，其葡萄糖亚基排列紧 密有序，形成类似晶体的不透水的网状结构，以及分子间结合不甚紧密、排列 不整齐的无定形区域。纤维素易与半纤维素、木质素等难分解的物质相复合， 因此，纤维素不能溶于水，难以水解。微生物利用纤维素之前，必须把它从木 质素和半纤维素包裹中释放出来，因此，纤维素的分解和木质素的分解是紧密 相关的1 1 0 】。 目前，对堆肥化中纤维素的降解已经有了多年的研究和一定的进展，但是 对更难攻击的木质素的降解研究却因木质素结构的过于复杂而徘徊不前。 1 3 堆肥中木质素生物降解 1 3 1 木质素的存在、结构与性质 1 8 3 8 年，法国农学家p p a y e n 从木材中分离纤维素时发现了一种含碳量较 高的化合物，后来f s c h u l z e 仔细分离出这种化合物并命名为“l i g n i n ”，中文译 为“木质素”。 木质素是植物经光合作用产生的一种含量仅次于纤维素的生物多聚体，广 泛存在于植物细胞壁中，是针叶树类、阔叶树类和草类植物的基本化学组成之 一，还存在于所有的维管植物之中( 桫椤除外) 。其中，在木本植物中，木质素 的含量约为2 0 3 5 ，在草本植物中含量约为1 5 2 5 】。据估测，全球每年可 产生约6 1 0 1 4 t 木质素，主要以造纸工业废水和农作物秸秆形式存在1 2 1 。常见秸 秆类农业废物中木质素比例见表1 1 【i 川。 4 硕士学位论文 表1 1 木质素、纤维素、半纤维素在农作物残留物中的比例 在植物体内，细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素三种成分构成，它 们对细胞壁的物理作用分工有所区别，纤维素是细胞壁的骨架结构，半纤维素 是基体物质，而木质素是给壳物质或硬固物质，木质素的存在给植物组织以强 度和硬度，防止过多水分和有害菌类渗入细胞壁。 由于木质素的结构复杂，目前完整的结论还没有最终得出，但对其基本的 结构框架众多科研工作者己达成共识。一般认为木质素是由苯丙烷单元通过醚 键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，其中醚键约占 6 0 7 5 ，碳键约占2 5 3 0 。在植物体内，苯丙烷单元先组装成三种基本结构 愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构( 图1 1 ) 。这三种基本结构在植 物体内的生物合成，首先是由葡萄糖发生芳环化反应形成莽草酸( s h i k i m i c a c i d ) ，然后由莽草酸合成上述三种木素的基本结构。最后再由这三种基本结构 聚合形成植物体内分子量更大的一些基本成分。最常见的有六种】，见图1 2 。 c c _ c c c c 对羟苯基结构愈创木基结构紫丁香基结构 图1 1 苯丙烷单元基本结构 这些基本成分再通过任意组合、共聚化后，形成了具有不均匀的，无旋光 性的、交差键和与高度分散结构的聚合物木质素( 图1 3 ) 【l4 1 。它包围着纤 维素，和半纤维素一起填充于微原纤维之间，与细胞壁成分紧密结合，构成一 体，防止过多水分和有害物质渗入植物的细胞壁，对植物有支持和保护作用。 但由此带来的问题就是由于木质素与细胞壁紧密结合使其结构非常稳定，不易 降解。 木质素的物化性质会因提取得方法不同而有差异。原本木质素是白色或接近无 色的物质但由于在分离、制备的过程中采用的方法不同，因此会呈现深浅不同 的颜色，例如由重氯甲烷甲基化后得到的木质素颜色呈白色，而酸木质素、铜 氨木质素、过碘酸盐木质素的颜色较深，呈浅黄褐色或深褐色等。原本木质 5 农林废物堆肥化中木质紊生物降解研究及接种剂开发 岍。导 h ( 一c i i h 譬 c h i o 国 h o 肛俨 o 忏1 卜c h 2 0 h 拈 孰。 h 一。一 h c 一0 、) 一o h i = ：， h c o h j 取。 愈创木基甘油- p 一松柏醇 b 愈创木基三聚物 f h 2 0 l 严hi 。i 。 h o c h i h ? c l l i m 。肛孰m 。 f h 2 u h h 。h 一沪 弋h = c 卜c h ：伽 拈 c h 2 0 h 愈创木基甘油p 松柏醇一p 一苯基一p - 愈创木基丙三醇四聚物 图1 2 木质素的六种基本结构】 素的相对分子量一般为几十万，而分离木质素因为在分离过程中会产生降解、 缩合和变性等变化，因此它的相对分子量就要低的多，一般能达到几千到几万。 木质素的相对密度大约在1 3 5 1 5 0 之问，测定是用不同的液体得到的数值也会 略有差异。木质素的光学特性是目前研究木质素结构较常用、较为有效的物理 学方法。在红外光谱上有明确的特征峰，波峰集中在1 6 lo 1 6 0 0 c m 叫和 1 5 2 0 1 5 0 0 c m ，属芳香环骨架结构；在紫外光谱上有明显的芳香环、共轭烯键 等吸收带；核磁共振法在研究木质案的结构方面也显示了巨大的威力，可以对 木质素上各种基团进行准确的定性和定量分析。 木质素分子结构中存在有芳香基、酚羟基、醇羟基、羰基、甲氧基、羧基、 用木质素提供了良好的指导作用。另外利用可降解木质素微生物所产生的生物 6 硕士学位论文 图1 3 软木木质素结构片断 酶活性的化学反应机理的研究有了长足、深入的进展。例如目前已发现的能有 效降解木质素的生物酶，主要是白腐真菌在降解木质素过程中产生的木素过氧 化物酶( l i g n i np e r o x i d a s e ，即l i p ) 、锰过氧化物酶( m n d e p e n d e n tp e r o x i d a s e ， 即m n p ) 及漆酶( l a c c a s e ，) 它们所产生的胞外酶作为高效催化剂参与反应， 借助自身形成h 2 0 2 ，靠酶触启动一系列的自由基链反应，先形成高活性的酶中 间体，将木质素等有机物( r h ) 氧化成许多不同的自由基( r ) ，其中包括氧化 能力很强的羟基自由基( o h ) ，实现对木质素的生物降解【l5 1 。 1 3 2 堆肥化中木质素降解研究的重要性及相关研究 在植物内部，由于纤维素受到木质素的保护【l 酬，要在堆肥过程中迅速达到 良好的腐熟度，加快木质素纤维转化为腐殖质的就成为了关键。近几十年来， 国内外学者一直在寻找降解木质纤维素的最佳途径，但利用微生物降解木质纤 7 农林废物堆肥化中木质素生物降解研究及接种剂开发 维素国内报道不多，特别是在木质纤维素作为堆肥原料，其生物可降解性方面 的研究则更少。 我国作为下个农业大国，每年约有7 亿吨农作物秸杆由于木质素复杂的理 化特性难以利用，最终作为固体废物被丢弃；同时，因为没有很好的处理方法， 木质素作为木材水解工业和造纸工业的副产品，是污染环境的有害物质。如散 稚在淮河流域周围大大小小的造纸厂排出的大量黑液，主要成分是得不到利用 的木质素，这些废液排入淮河，严重污染了当地的地表水和地下水，导致该流 域附近众多城镇居民生活用水困难、健康水平下降、农业生产下滑。堆肥中生 物降解木质素作为一种降解木质素的比较低成本方法，不断研究完善它，对我 国经济建设十分有好处。 早在1 9 3 9 年w a k s m a n 就提出了堆肥中木质素生物降解研究的重要性，并对 此作了一系列试验，研究发现堆肥化中温度对木质素降解影响较大( 见图1 4 ) ， 最高的降解发生在5 0 ，在7 5 时没有发现木质素的生物降解，但是12 的木 质素是由于高温和堆肥中的碱性反应被增溶【i7 ，1 8 】。 o 5 o 婚 笛3 0鹁街档鞠 翻y # 研l n 伽h 佣 图1 4 堆肥化中不同温度。f 木质素的降解 h o r w a t h 等【1 9 】用黑麦草为原料堆肥4 5 天，一个堆体温度为2 5 ，一个为 5 0 ，用k l a s o n 方法测定木质素含量，木质素降解率分别为7 和2 7 。两种 温度下都发现残余k l a s o n 木质素的标准比率发生变化，据测堆肥化后只有6 的残余k l a s o n 木质素未被改变。 根据t o m a t i 等【2 0 】的研究，当堆肥温度保持在5 0 时，3 5 天的堆制可使木 质素降解7 0 ，而腐熟阶段的木质素降解可以忽略。 v i k m a n 等【2 1 】研究木质素浓度对堆肥物料( 含木质素的纸浆和纸产品) 降解 的影响。发现木质素抑制堆肥物料的生物降解，5 8 下木质素浓度与物料的生 物降解之间存在线性关系1 2 。 d i m i t “s 等【2 2 】通过研究也发现初始较高的木质素含量将会限制原料的有效 硕二i ：学位论文 降解程度。并通过实验得到了木质素浓度与降解程度( 有机质减少来衡量) 的 线性相关关系。并将这个方程( 线性关系式) 与c h a n d l e r 等在厌氧环境下研究 得到的方程比较，发现好氧环境下木质素对整个堆料的降解的抑制作用要比厌 氧环境下小得多。 厌氧环境下方程：b = 0 8 3 一o 0 2 8 疋 其中，b 代表挥发性固体中生物降解的分数( 0 b 1 ) ，x l 代表初始木质素 浓度( 挥发性固体的百分比) ，该等式r 2 = o 9 4 。 好氧环境下方程：b = 0 8 5 ( o 0 8 4 ) 一o 0 1 9 ( o 0 0 2 7 ) 一 其中，b 、蜀意义如上述，该等式r z = o 5 0 。 除了上述研究外，对木质素降解的生物学研究也作了一些工作。w a k s m a n 等【 】研究了从堆肥化中筛选出来的一些微生物的木质素降解能力。在5 0 下， 4 2 d 内两种高温放线菌降解o 7 2 5 木质素。高温真菌砌p ，_ 研d ，缈c p j ，口刀昭砌d j “s 降解4 2 ，实验所用两株细菌均不能单独降解木质素。 k l u c z e k t u r p e i n e n 等【2 3 】从以城市固废、纸、木花组成的堆肥体系中筛选到 尸口p c ，d 所) ，c p sf 胛| ，7 a ，甜s 。研究灭过菌的堆肥物料固态发酵体系中，在该菌作用下 1 4 c b - l a b e l e dl i g n i n ( s i d e c h a i nl a b e l e dd e h y d r o g e n a t i o np o l y m e r ，d h p ) 的降解情况， 发现大约6 5 木质素被矿化，1 5 5 被转化为水溶性片断。漆酶是该菌唯一的木 质素降解酶，并研究了漆酶活性的生理调控。 其它许多纯种能降解木质素的微生物被陆续从堆肥化中筛选出来。这些菌 有丝状真菌( 霉菌) ，属于子囊菌或半知菌。作为腐生降解者，这些真菌普遍存 在且数量巨大。表现出较高生物多样性又表现出较好降解能力的代表微生物包 括：曲霉属似印p 曙f ，“s ) 、青霉属( p p 胛f c f ，f “聊) 、镰刀霉属( f 甜s 口厂f “聊) 、毛壳菌属 ( c 办口p f d 朋f 材优) 、木霉属( 乃f c 办d 比r 所以) 以及拟青霉属( 尸口p c f 肠，缈c p s ) 【2 3 1 。 g a l l i 等【2 4 】还尝试研究堆肥化过程中木质素降解的生物化学过程。他们将橄 榄树加工厂废水与麦草混合堆肥，发现高温阶段结束，酚类化合物与木质素减 少了大约7 0 。嗜温细菌强烈的代谢活性使堆体温度不断升高，产生高温期，期 间高温微生物开始降解木质素类化合物。木质素在高温阶段持续降解，堆制3 个 星期后，大约7 0 的木质素被降解。 对堆制中样品进行1 hn m r 分析，如图1 5 所示：在7 5 6 5 p p m 范围内的 峰可显著表明低分子量的木质素片断物质的存在。这些物质在高温期不断增加， 3 5 d 时达到最大值，腐熟阶段时又开始下降。腐熟阶段可溶木质素片段的降低可 能是由于该阶段腐殖化过程丌始( 木质素不再进一步降解) 。显然木质素素降解 开始