（茶学专业论文）茶氨酸生物合成基因工程菌发酵工艺的研究.pdf

摘要 对本实验室构建并保存的具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌p e t 3 2 a - g g t 进行了小试 发酵培养基和培养条件的优化；重组质粒p e t - g g t 稳定性的鉴定；细胞固定化生物合成茶氨酸的 研究；在3 0 l 发酵罐扩大生产工艺的初步研究。主要研究结果如下： l 、利用p i a c k e t t b u r m a n 实验设计和响应面法进行了小试发酵的优化实验：优化培养基为葡 萄糖1 0 3 9 9 l 、酵母提取物6 8 8 9 ，l 、k 2 h p 0 47 1 0 9 l 、蛋白胨1 0 9 l 、n a c i1 0 e , l 、m g s 0 4 7 h 2 0 l g l ；优化培养条件为初始p h7 3 2 、培养时问6 6 7 h 、i p t g 诱导温度3 1 5 1 、装液量5 0 m l 2 5 0 m l 、接种量1 、i p t g 诱导时间4 h 。丫- g g t 活性为4 6 4 u m l ，茶氨酸的产量为3 5 1 9 9 l ，l 谷 氨酰胺的转化率为5 7 。7 。 2 、该基因工程菌在连续传代1 0 0 代后，质粒的目的基因片断没有缺失，具有结构稳定性； 但在无抗生素选择压力下，连续传代2 0 代后开始出现质粒丢失的细胞，连续传代1 0 0 代后1 8 的细胞含有正常质粒，表现出一定的分裂不稳定性。该基因工程菌在优化培养基和优化条件下的 整个发酵过程中，始终表现出良好的结构和分裂稳定性。 3 、确定了海藻酸钠( 2 0 9 l ) 固定化后0 0 5 戊二醛交联的固定化方法，固定化细胞酶活同 收率为7 9 2 。细胞经同定化后操作稳定性与贮存稳定性较游离菌显著提高。构建了固定化细胞 填充床反应器，茶氨酸连续生物合成的平均产量为2 5 4 0g l ，平均体积产率为6 3 5 9 l h 。 4 、初步确立了该基因工程菌发酵罐扩大培养的相关参数和培养方法：3 0 l 发酵罐中加入1 2 l 优化培养基，5 的接种量，加消泡剂磷酸丁酯5 m l ，转速2 5 0 r m i n ，3 7 发酵培养，并根据溶氧 变化补料添加葡萄糖，当溶氧低于4 0 # f 料1 0 0 m l 葡萄塘( 1 0 9 l ) ，滴加5 m o l l n a o h 控制发 酵p h 在7 3 左右，6 h 后用0 0 5 m m o l l i p t g 诱导，3 1 5 c 诱导4 h 。3 0 l 发酵罐扩大培养后该基因 工程菌的细胞密度( o d 6 0 0 值) 可以达到1 9 2 ，但y - g g t 活性仅为1 2 2u m l ，茶氨酸产量为 8 0 6 9 l ，l 谷氨酰胺的转化率仅为1 3 2 2 。 关键词：茶氨酸，基因工程菌，丫- 谷氨酰转肽酶，发酵工艺 a b s t r a c t t h i sp a p e rs t u d i e dt h eo p t i m i z a t i o no fc u l t i v a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni nf l a s k , t h e s t a b i l i t yo f t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 3 2 a - g g t ，b i o s y n t h e s i so f t h e a n i n eb yi m m o b i l i z e dc e l l s ， s c a l e u pf e r m e n t a t i o np r o c e s si n3 0 lf e r m e n t o ro f t h eg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e de s c h e r i c h i ac o l is t r a i no f 1 p g l t a m y l t r a n s p e p t i d a s ef o rt h eb i o s y n t h e s i so ft h e a n i n e t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： l 、p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w a su s e di nt h i ss t u d y ，t h e o p t i m u mc u l t i v a t i o nm e d i u mw e r eg l u c o s e10 3 9 9 l ，y e a s te x t r a c t6 8 s g n 。，。k 2 h p 0 47 10 9 l ，t r y p t o n e 1 0 9 r c ，n a c l10 e g l ，m g s 0 4 。7 h 2 0l g l ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r e ：i n i t i a lp h 7 3 2 ， c u l t i v a t i o nt i m e6 6 7h ，i p t gi n d u c t i o nt e m p e r a t u r e31 51 ，m e d i u mi o a d a g e5 0 m l 2 5 0 m l ，i n o c u l u m p e r c e n t a g e1 ，i p t gi n d u c t i o nt i m e4 h t h ee x p e r i m e n t a l7 - g g ta c t i v i t yo b t a i n e dw a s4 6 4 u m l t h e y i e l do f t h e a n i n ef r o ml - g i na n de t h y l a m i n ew a s3 5 18 9 l ，c o n v e r s i o nr a t eo fl - g i nw a s5 7 7 2 、t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dd i d n ta p p e a ro b v i o u sg e n ed e l e t i o n , s h o w e ds t r u c t u r a ls t a b i l i t ya f t e r 1 0 0g e n e r a t i o n s h o w e v e r , t h ep l a s m i dw a ss h o w e ds e g r e g a t i o n a li n s t a b i l i t y ，t h ep l a s m i d - f r e ec e l l s a p p e a r e da f t e r2 0g e n e r a t i o n s ，a n dl8 c e l l sw a sp l a s m i d - h a r b o r i n gc e l l sa f t e r10 0g e n e r a t i o nu n d e rn o a m ps e l e c t i o np r e s s u r e i tw a ss t r u c t u r a la n ds e g r e g a t i o n a ls t a b i l i t yu n d e ro p t i m i z i n gc u l t u r em e d i u m a n dc o n d i t i o nd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s 3 、1 1 1 ec e l l so ft h eg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e de s c h e r i c h i ac o l iw e l - ee n t r a p p e db ys o d i u ma l g i n a t e s o l u t i o n ( 2 0 9 l ) a n dw e r et r e a t e db y0 0 5 g l u t a r a l d e h y d ea f t e ri m m o b i l i z a t i o n t h ea c t i v i t yy i e l do f t h ei m m o b i l i z e dc e l l sw a s7 9 2 t h es t o r a g es t a b i l i t ya n dt h eo p e r a t i o n a ls t a b i l i t yw e r eg r e a t l y i m p r o v e da f t e ri m m o b i l i z a t i o n c o n t i n u o u st h e a n i n ep r o d u c t i o nw a sc a r r i e do u ti nap a c k e rb e dr e a c t o r ( p b r ) ，t h ea v e r a g ey i e l do ft h e a n i n ew a s2 5 4 0g l ，a n dt h ea v e r a g ep r o d u c t i v i t yw a s6 3 5 9 l h 。 4 、t h ef e r m e n t a t i o np r o c e e si n3 0 lf e r m e n t o rw e r e 3 0 lf e r m e n t o rc o n t a i n i n g12 lo p t i m u m c u l t i v a t i o n , i n o c u l u mp e r c e n t a g e5 ，s u p p l e m e n t i n gw i t h5 m la c i db u t y lp h o s p h o r i c 笛f o a mk i l l e r , s h a k i n ga t2 5 0 r m i n ，c u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r e3 7 c ，a d d i n g10 0 m ig l u c o s e ( 10 9 l ) w h e nd i s s o l v e d o x y g e n ( d o ) u n d e r4 0 ，c o n t r o l l i n gf e r m e n t a t i o np ha t7 3 w i t h5 m o l l n a o h ，a d d i n g0 0 5 m m o l l i p t g a f t e r 6 h f e r m e n t a t i o n ，i n d u c t i o n t e m p e r a t u r e3 1 5 。c f o r 4 h t h e o d 6 0 0 w a s1 9 2 ，? - g g t a c t i v i t y w a s 1 2 2 u m 1 t h ey i e l do f t h e a n i n ew a s8 0 6 9 l ，a n dc o n v e r s i o nr a t eo f l g i nw a s1 3 2 2 k e yw o r d s ：t h e a n i n e ，g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e de c o l ib a c t e r i as t r a i n ，丫- g l u t a m y i t r a n s p e p t i d a s e ， f e r m e n t a t i o np r o c e s s 英文缩略表 英文缩写 t - g g t l b a m p h p l c i p t g l - g l n o d r s m d o p b r 英文全称 g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e l u r i a - b e r t a n i a m p i c i l l i n h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y l s o p r o p y l t h i o - 1 3 - d - g a l a c t o s i d e g l u t a m i n e o p t i c a ld e n s i t y r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y d i s s o l v e do x y g e n p a c k e db e dr e a c t o r v i 中文名称 t 一谷氨酰转肽酶 l b 培养基 氨卞青霉素 高效液相色谱 异丙基硫代1 3 d 半乳糖苷 l 谷氨酰胺 光密度 响应面法 溶氧量 填充床反应器 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 签哗友杈 时阃2 归擎事毛只i 毛b 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者 导师签名 时间：7 佃乡年多月，日 时同；乡o 。争年名a | 6 耋璧耋些坌茎垦錾圭茎堡兰耋茎；耋堑善 第一章绪论 1 1茶氨酸的特性、功能及发展前景 1 1 1 茶氪酸的特性 c 文：卢 一。c ”广 112 茶氨酸的功能 母1 1 茶氲酸分子培拇 1im o h 2 u c m u c 血 o f m e ( 5 州t 崛i g l u a t m 如) 茶氨酸自发现雌米，一直是被作为茶叶的主要品质成分广为研究。近年来，茶氨酸具有的一 些特殊生理功能不断地被发现从而成为茶叶功能性成分合成和提取、应用韵_ ) 己一大热点，研究 表明茶氨酸具有许多有价值的药用保健功效： 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 ( 1 ) 降血压作用( y o k o g o s h ih e ta l ，1 9 9 8 ) 。 ( 2 ) 增强抗肿瘤药物的疗效( s a d z u k a ye t a l ，1 9 9 8 ；s u g i y a m a t e t a l ，1 9 9 9 ；s a d z u k a y e l a ， 2 0 0 1 ：s a d z u k a ye t a l ，2 0 0 2 ：z h a n g ge t a l ，2 0 0 2 ) 。 ( 3 ) 松弛神经紧张、焦虑等作用( 木村良平等，1 9 7 5 ；k a k u d a t e t 口，2 0 0 0 ) 。 ( 4 ) 对脑神经细胞保护作用( 凌关庭，2 0 0 2 ) 。 ( 5 ) 促进大脑功能作用( 杜荣茂等，2 0 0 2 ) 。 ( 6 ) 改善经期综合症作用( 吕毅等，2 0 0 3 ) 。 ( 7 ) 减肥作用( 吕毅等，2 0 0 3 ) 。 ( 8 ) 抗疲劳作用( 王小雪等，2 0 0 2 ；李敏等，2 0 0 5 ) 。 ( 9 ) 提高免疫力，防御病毒( b u k o w s k ijfe l 耐，1 9 9 9 ；k a m a t h abe t a ，2 0 0 3 ；林智，2 0 0 3 ) 。 茶氨酸除了具有以上药用保健功效外，在食品领域也有很好的应用价值，目前，茶氨酸作为 食品添加剂已被广泛应用，其安全性和稳定性也得到了肯定。 1 1 3 茶氨酸的发展前景 茶氨酸是一种安全、无毒的茶叶天然产物，具有重要的生理、生化和药理、保健作用，食品 安全性高，有着广阔的应用开发前景。总的来说，在技术方面，通过利用生物技术获得更多的茶 氨酸，其中利用微生物，特别是构建基因工程菌发酵生产茶氨酸具有很好的发展前景；在应用方 面，除作为食品添加剂外，应开发功能性食品，拓宽茶氨酸在食品领域的应用；在开发方面，利 用茶氨酸的特殊生理功能，开发功能性药物，降低血压、治疗肿瘤、预防老年痴呆症等。 1 2 茶氨酸的人工合成 1 2 1 化学合成 茶氨酸传统的化学合成制法是谷氨酸的吡咯烷酮化。1 9 4 2 年以色列人l i c h t e n s t e i n 首次在实 验室中用乙胺和吡咯烷酮酸在水溶液中反应得到茶氨酸。1 9 5 1 年，日本的桥爪斌改进了合成方法， 即用l 吡咯烷酮酸与纯乙胺( 而不是在水溶液中) 放置，以提高茶氨酸产率( 桥爪斌，1 9 5 1 ) 。 1 9 6 1 年y a m a d ey 等利用反应物与生成物之间溶解性的差异，将l 吡咯烷酮酸先形成铜盐，再与 纯乙胺反应合成了茶氨酸，大大提高了反应的收率( y a m a d eye ta l ，1 9 6 1 ) 。2 0 0 3 年，y a ns h o u h e 等报道了一种改进的茶氨酸( y 谷酰基乙胺) 的合成方法，包括l 谷氨酸的去氢成为吡咯烷 酮羟酸( p c a ) ，然后再加纯的乙胺( 9 9 ，气液) 反应，得率9 2 6 ，再在8 4 乙醇溶液中重结 晶后，高纯度茶氨酸( a 型) 的得率3 7 4 。b 型茶氨酸从l - p c a 合成，用h p l c 分析证明，a 和b 型茶氨酸是混合异构体，a 型含4 7 9 的l 二茶氨酸，b 型含9 0 9 的l 一茶氨酸( y a ns h o uh e p ，口，2 0 0 3 ) 。 谷氨酸的吡咯烷酮化并非是合成茶氨酸的唯一方法，t f u r u y a m a 等于1 9 6 4 年采用二硫化碳 保护a 氨基而合成了茶氨酸。1 9 6 5 年，n l i c h t e n s t e i n 改用谷氨酸乙醛为原料，用钯碳催化还原 合成茶氨酸，并在以色列申请了专利( n l i c h t e n s t e i n ，1 9 6 5 ) 。2 0 0 1 年王三永等先将l 谷氨酸与 无水乙醇反应生成l 谷氨酸y 乙基酯，再用三苯基氯甲烷保护氨基后，与乙胺反应生成n 一三苯 2 中目农业科学院硕十学位论文 第一荦绪论 一i i _ i 一_ _i 曼曼! 曼! 曼! ! 曼曼曼! 曼! 曼曼 甲基l 谷氨酸y 乙酰胺，最后除去三苯甲基得到茶氨酸。此法的特点为反应中间产物无需分离 提纯就可进行下一步操作，比较简便( 王三永等，2 0 0 1 ) 。目前，日本从简化生产流程考虑，仍然 采用l 一谷氨酸加热脱水生成l 吡咯烷酮酸，然后再与无水乙胺反应生成茶氨酸。 化学合成手段制各茶氨酸成本低、操作复杂、反应条件苛刻。化学合成制造的都是d l 型消 旋体，需要进行拆分才能得到l 型产品。日本学者在这方面进行了大量工作，他们采用微生物阎 化酶分离d l 型氨基酸取得了成功。 1 2 2 植物组织培养 植物组织培养合成茶氨酸是采用茶树细胞或茶树愈伤组织培养来产生茶氨酸，然后通过离子 交换法提取茶氨酸。1 9 9 0 年o r i h a r ay 等采用茶树细胞培养生产茶氨酸和其他y 谷氨酰衍生物， 发现在2 5 下，黑暗中振荡培养能获得最高的茶氨酸含量。同年m a t s v v r at 等研究了合成前体、 光照和温度对茶树愈伤组织中茶氨酸积累的影响，发现在培养基中加入浓度为2 5 m m 的盐酸乙胺， 2 5 黑暗条件下，能增加茶氨酸积累。据日本报道，采用3 0 0 9 新鲜细胞在5 0 l 培养液中，2 5 悬 浮培养4 7 天，培养液经提取、浓缩和干燥，可得纯度8 0 左右租茶氨酸4 8 1 9 ，产量比愈伤组织 培养法提高约l 倍( f u m y ate la l ，1 9 9 0 ) 。 1 9 9 2 年m a t s u u r at 等利用茶树愈伤组织培养生产茶氨酸，发现在b i e 琼脂培养基中加入2 5 r a m 的h c ! 乙胺可使茶氨酸的积累明显增加( m a t s u u r a t e t a l ，1 9 9 2 ) 。钟俊辉等对不同培养条件下愈 伤组织生长及茶氨酸积累情况进行了研究发现，不同碳源对愈伤组织生长及茶氨酸积累相近，增 加糖浓度有利于次生代谢物的积累，愈伤组织的最适培养温度和茶氨酸积累温度都是2 5 c ，暗培 养更有利于茶氨酸的积累( 钟俊辉等，1 9 9 7 ) 。1 9 9 8 年陈瑛等研究了多种激素对愈伤组织合成茶氨 酸的影响，试验证明，以4 m g l 6 - b a + 2 m g l i a a 或3 m g l 6 - b a + i 5 m g l i a a + 2 m g l t a 的组合， 添加于m s 培养基上，茶愈伤组织生长和茶氨酸积累均良好，茶氨酸含量最高可达1 7 0 m g g ( 陈瑛 等，1 9 9 8 ) 。 组织培养合成茶氨酸由于产量低( 最高达1 9 4 1 6 m g g 干细胞重) ( m a t s u mt ，1 9 9 4 ) ，产 品分离纯化过程复杂及生产工艺的控制难度大等限制了该方法的工业化。 1 2 3 微生物发酵合成 随着生物技术的发展和应用，利用微生物发酵来生产酶，进而利用酶的提取物来进行目的物 的生产越来越被广泛地应用。与化学合成法相比，微生物发酵法生产茶氨酸具有完全不同的特色。 由于酶促反应所具有的高度专一性，所以无需对a 氨基进行乙胺基化。但是由于生物体内合成茶 氨酸需要a t p 水解成a d p 来提供能量，而a t p 的获得与再生要靠葡萄糖的降解来推动。因此，茶氨 酸的合成反应必须与葡萄糖的降解反应相偶联。微生物发酵合成茶氨酸的反应，实际上是运用微 生物中的谷氨酰胺酶在特殊的条件下( 高乙胺浓度和特定的p h 值) 进行的非特异反应，而该酶在 通常情况下对氨的亲和力比乙胺大得多。 1 9 9 3 年日本报道了已应用于实际生产的酶促合成茶氨酸的反应，利用的是细菌中的谷氨酰胺 酶在特殊条件下( 高乙胺浓度和特定的p h 值) 进行的非特异反应( a b e l i a nv he ta l ，1 9 9 3 ) 。具 体方法是先将一种硝基还原假单胞z 细菌i f 0 1 2 6 9 4 ( p s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s ) 培养物悬浮在 3 中国农业科学院顾十学位论文第章绪论 0 9 n a c i 溶液中，将4 5 k 角叉菜胶在8 0 下溶解并冷却至4 5 时与细菌悬浮液混匀，使细菌 固定成直径3m i l l 的颗粒，填充于四根1 7 x 4 0 c m 的柱型反应器中，以0 7 r a m 乙胺和0 3 r a ml 谷 氨酰胺为底物，在0 0 5 r a m 硼酸缓冲液( p h 9 s ) 中，3 0 条件下，底物以0 3 个床体积每小时通 过反应器。该方法制备的反应器活性可持续几个星期以上，预计生产半衰期可达1 2 0 次反应。第 5 1 次反应，茶氨酸的产量仍可达到4 0 m m o l h 。粗产物用离子交换柱层析就可分离出茶氨酸，得率 可达所消耗谷氨酸的9 5 左右。而此法严格而言为半生物合成，并因底物试剂乙胺和谷氨酰胺的 消耗及反应周期较长提高了成本，同时该酶在通常情况下对氨的亲和力比乙胺大得多。 h i d e y u k is u z u k i 等报道了利用从细菌中得到的谷氨酰转肽酶作催化剂，将2 0 0 m m 谷氨酰胺 和1 5 m 乙胺在p h 为1 0 ，温度为3 7 的条件下，保持2 小时，获得1 2 0 r a m 茶氨酸，转化率为 6 0 ( h i d e y u k is u z u k ie ta l ，2 0 0 2 ) 。y a m a m o t os 等将硝基还原假单胞菌( p s e u d o m o n a st a e t r o l e n s y - 3 0 ) 的谷氨酰胺合成酶与酵母的a t p 再生系统相耦联，从谷氨酸和乙胺合成茶氨酸，但是由于 反应体系复杂，茶氨酸产量不高，4 8 h 反应仅生成1 7 0 m m 茶氨酸( y a m a m o t ose ta l ，2 0 0 5 ) 。 目前已经发现的可以催化茶氨酸合成的酶主要有3 种：茶氨酸合成酶( t h e a n i n es y n t h e t a s e 。e c 6 3 1 6 ) 、谷氨酰胺酶( l g l u t a m i n a s e ，e c3 5 1 2 ) 、丫谷氨酰转肽酶( 7 g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e ， ? - g g t ) 。其中，茶氨酸合成酶是茶叶中的生物合成酶，但一直未能将其基因克隆出来；其它两种 酶来自微生物，比较方便进行利用。1 9 9 3 年i s h i y em 等就纯化了a 1 4 的y 一谷氨酰转肽酶，将纯 化的y 谷氨酰转肽酶抗体进行w e s t e r n 检测表明假单孢菌g g t 基因在e c o l i 中得到表达( i s h i y em e ta ，1 9 9 3 ) 。2 0 0 3 年张新民等从土壤中筛选分离到一株产y 一谷氮酰转肽酶的菌株，经生理生化 特性鉴定为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i 2 l i s ) n x 2 2 。研究了其产酶条件，该菌体产y 谷氨酰转 肽酶活力达到3 2 u m l 。分析n x 2 2 菌生长和产酶的进程，发现y 谷氨酰转肽酶的合成与菌体生 长是同步的( 张新民等，2 0 0 3 ) 。2 0 0 5 年郭亮等报道了将大肠杆菌j m l 0 9 的g g t 基因接入两种不 同的质粒中后，转化大肠杆菌j m l 0 9 ，发现在强启动子t a e 的控制下，y 谷氨酰转肽酶的表达量 提高至出发菌株的2 3 倍，将构建的工程菌用于生物转化法生成茶氨酸，底物转化率相应地提高 至出发菌株的1 7 倍( 郭亮等，2 0 0 5 ) 。2 0 0 6 年王娜等利用p c r 技术以b a c i l l u ss u b t i l i ss y u2 0 0 1 6 基因组d n a 为模板，扩增出1 8 k b 编码7 谷氨酰基转肽酶的基因g g t ，将其连接到温控表达载体 p b v 2 2 0 ，得到重组载体p b v 2 2 0 g g t ，重组载体在大肠杆菌j m l 0 9 中得到表达。并对该基因工程 菌进行表达研究表明，在4 2 诱导4 h 后，重组菌的哥谷氨酰基转肽酶酶活力达到6 u m l ( 王娜 等，2 0 0 6 ) 。 采用微生物发酵法可直接得到l - 茶氨酸，可大量生产茶氨酸，适合工业化生产，但设备规模 较庞大，成本相对较高( 李平等，2 0 0 4 ) 。 1 3 基因工程与发酵工程进展 基因工程( g e n ee n g i n e e d n g ) 是指对携带遗传信息的分子进行操作，即把基因进行改造，插 入载体中，导入宿主细胞，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物的技术，其核心是重组d n a 技术。1 9 7 7 年，h i r o s e 和l t a k u r a 首次利用基因工程技术在大肠杆菌中表达了生长激素释放抑制素， 之后，随着基因工程技术的完善和发展，不断地有新的基因工程产品面市，目前至少有5 0 以上 的重组蛋白药物是用基因工程技术生产的，如人胰岛素、干扰素、白细胞介素一2 、生长激素、粒 4 中国农业科学院硕七学位论文第帚绪论 细胞集落刺激因子、干细胞因子、表皮生长因子等等。大肠杆菌是最早开发的功能蛋白表达系统， 目前对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究得已经相当彻底，具有不同抗性、不同营养依赖性和 不同校正突变性的菌种可供研究者选择，可以根据不同的载体选择不同的菌种。大肠杆菌相对较 小，繁殖能力强，适于大规模发酵，外源基因在大肠杆菌中的表达量可达到总蛋自的5 - 3 0 ， 表达水平一般较真核系统高。鉴于以上原因，大肠杆菌是基因工程中应用较多的系统( m e e n ar a i p ，a l ，2 0 0 1 ：p e rj o n a s s o ne ta l ，2 0 0 2 ) 。 随着基因工程技术的发展。基因重组蛋白的高表达策略逐渐成为近二十年的生物工程研究热 点。一般情况下，基因重组蛋白的高表达研究包括：合适宿主的选择，重组蛋白表达位点的确定， 重组基因最大表达的分子策略，细胞生长和环境的优化，发酵条件的优化后处理过程的优化等 六个方面。其中后三项内容是发酵 程( f e r m e n t a t i o n e n g i n e e r i n g ) 研究的内容( f r a n c o i sb a n e y s ， 1 9 9 9 ) 。 发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理结合起来，利用微生物的生长和 代谢活动来生产各种有用物质的科学。按最终产物区分，发酵过程有五类，即把微生物细胞作为 最终产品的发酵过程：微生物代谢体系中酶的发酵过程；把微生物的代谢产物作为产品的发酵过 程；利用微生物对某种物质进行特定修饰的转化过程；基因工程细胞的发酵。不同的发酵过程虽 然具有不同的特点，但基本上都包括培养基组成的确定、培养基和发酵罐及辅助设备的灭菌、种 子培养、发酵罐中的大规模生产、产物的提取和纯化以及废液处理等几个过程。发酵： 业具有很 长的历史，2 0 世纪4 0 年代初抗生素工业的兴起标志着现代发酵工业的开始，从此发酵工业在产 品更新、新设备和新技术的应用上都达到了前所未有的水平。随着时间推移和新产品、新技术的 不断涌现，人们对发酵的本质和过程的认识不断加深。1 9 5 4 年h a s t i n g 指出，发酵要解决的十大 问题是深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、冷却方式、设备及培养基除菌、过 滤和公害。6 0 年代中期，研究人员在发酵及与之相关的管路网络设计、操作中推行了无菌的概念， 推出了无菌操作的一整套技术。1 9 6 4 年，a i b a 认为通气搅拌与放大是发酵的核心，其中放大是发 酵过程研究的焦点。1 9 7 3 年，他进一步指出，在大规模培养方面，除了无菌操作、通气搅拌等物 理现象的解析和设备的开发外，应当进一步开展对微生物反应本质的研究。其后，发酵工程的研 究重点就从过程的物理特性过渡到对微生物反应的定性、定量研究方面。1 9 7 4 年，阿特金森提出 生物反应工程( b i o r e a c t i o ne n g i n e e r i n g ) 的概念，生物反应过程就是要提供合适的描述微生物体 系的动力学表达式，并通过实验求出半实验常数。1 9 7 9 年，山根恒夫提出生物反应工程是- - f - j 以 速度为基础，研究酶反应和微生物反应的合理设计、操作和控制的工程学。1 9 8 5 年，卡尔许格 尔提出生物反应过程的研究应当包括两个方面的内容，一个是宏观动力学，它涉及生物反应过程 中生物、化学、物理几方面的性质及它们之间的关系，另外是生物反应器工程，它涉及不同的反 应器对生物的化学和物理过程的影响。上个世纪8 0 年代以来，随着基因重组技术的发展，越来越 多的外源基因在微生物中表达，而重组蛋白的生产水平，不但取决于基因重组菌的构建，也取决 于发酵过程的工艺控制( m i c h a e lje ta l ，1 9 9 6 ) 。因此，发酵工程面临着新的课题，即如何以经济 有效的方式发酵生产基因工程菌。一般来说，基因工程菌发酵的基本目的是要以较低的成本获得 较高产率的外源蛋白。高密度发酵就是为了这个目的而产生的细胞培养技术，它以提高外源蛋白 的生产水平为目的，在相对较小的生物反应器中进行重组菌的高密度培养，从而使外源蛋白的产 量大幅度提高。除了可以提高产量外，高密度发酵可以减少培养体积，有利于产品的进一步分离 5 中国农q p 科学院硕卜学位论文第一章绪论 i _i iiio i 曼! 曼! 曼曼皇! 曼曼! ! ! 曼曼曼曼! 曼 纯化，便于实施发酵过程的除菌与密封，降低废水排放，强化下游加工过程，降低固定成本投资 规模( g e r h a r dh a r m i n g e l a l ，1 9 9 8 ) 。它是对原有的发酵过程研究的补充和完善，其要解决的问题 中有很多是传统发酵过程中所没有遇到的问题。比如，实现菌体的高密度培养要解决发酵过程中 的底物及产物抑制的问题，这要求人们在对微生物的代谢机制有较全面掌握的基础上，确定影响 菌体生长的关键因素及相互间的联系利用工程学方法，构建模拟菌体生长的动力学模型，最后 实现对菌体生长的最优控制。关于代谢、发酵条件、动力学和控制论等方面的研究一直是高密度 发酵领域的热点问题，对于这些方面的研究极大地丰富了人们对于发酵过程的认识，也带动了近 二十年发酵工程的蓬勃发展。除了在发酵工程过程控制方面外，高密度发酵还推动了生物反应器 工程的发展。为了实现高密度发酵，在反应器的设计水平上，要充分地考虑到高密度发酵的特点， 优化反应器的传质传气效果。新型反应器不断涌现，比如，专门用于高密度培养的膜反应器，利 用膜的通透性，将发酵和分离过程偶合在一起，在发酵过程中，代谢产物被排除出反应器外。用 这种反应器培养基因工程菌，菌体密度可以达到接近于理论计算的最大值水平( 陈坚等，2 0 0 2 ) 。 1 4统计学优化方法在发酵工程中的应用 一个优良的生物产品开发成功后，为了将其应用于实际生产中，首先遇到的问题是生物过程 的优化。以发酵过程为例，影响发酵过程的因素包括培养基组成、p h 值、培养温度、摇床转速、 装液量、接种量、种龄、搅拌与通气等条件，这些条件往往不独立影响发酵过程，而是常常存在 交互作用的。生物过程是一个复杂的相互作用过程。生物过程的优化就是将影响过程的所有因素 达到最优值，从而使产率最大，它通常涉及普通微生物学、生物化学、生理、数学及计算机方面 的知识，一般包括以下几个步骤： 所有影响因子的确认； 影响因子的筛选，以确定各个因子的影响程度： 根据影响因子和试验目的的要求，选择优化策略； 实验结果的数学或统计分析，以确定其最佳条件； 最佳条件的验证。 从此可看出，生物过程优化是一个复杂的过程，它往往影响产物的生产效率和成本，常常决 定生物过程能否产业化( p e d r ow 鲥a l ，1 9 9 6 ) 。因此，生物过程优化在生物技术产业化中具有非 常重要的意义。随着计算机技术的发展，新的优化方法不断涌现( t o m a sge ta l ，2 0 0 0 ；欧宏宇 等2 0 0 1 ；b a l a r a m a nm a n o h a re ta l ，2 0 0 4 ) 。下面对常见的优化方法及其发展状况作一介绍： 1 4 1 非统计优化技术 传统的优化方法是单次单因子法( o n ef a c t o ra to n et i m e ) ，即每次只改交一个因子而其它因子 保持不变的优化方法，日常实验中经常被采用，但是这种方法存在一些缺点。当考察的因子较多 时，使用这种方法，需要较多的实验和较长的实验周期，而且还可能导致不可靠的甚至是错误的 结论。当因子之间具有交互作用时，无法找出因子间的相互关系。但由于不需要数学统计方面的 知识，操作简单，结果也能直观地用图表显示，单次单因子法仍然是常用的方法之一。 6 中同农业科学院硕十学位论文 第一章绪论 1 4 2 统计优化技术 为了弥补传统的单次单因子法的缺陷，近年来许多生物过程优化已采用了统计优化法。通常 统计优化法包括下面几个步骤： 实验设计； 实验结果的数据分析，以得到合适的数学模型： 数学模型的检验，即方差分析； 求解最优化值及其校验。 常见的优化技术包括响应面法( r e s p o n s e ss u r f a c em e t h o d o l o g y ) 、最陡爬坡法( s t e e p e s ta s c e n t ) 、 进化操作法( e v o l u t i o n a r y o p e r a t i o n ) 、典型分析法( c a n o n i c a la n a l y s i s ) 、g a u s s s e i d e l 法、n e l d e r - m e a d 单纯形法等，其中响应面法是近年来应用最多的一种优化技术( 胡永红等，2 0 0 2 ；郝学财等，2 0 0 6 ) 。 p l a c k e t t b u r m a n 设计法是一种两水平的实验设计方法( p l a c k e t tr la n db u r m a njr 1 9 4 6 ) ，适 用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，它用最少的实验次数从多个因 子中找到影响结果的关键因子，使因子的主效果得到尽可能精确的估计，供进一步优化研究。但 该法不能考察各因子的交互作用。因此，它通常作为过程优化的初步实验，用于确定影响过程的 重要因子。p l a c k e t t - b u r m a n 设计法采用h a d a m a r d 矩阵。对于n 个因子，进行n + 1 次试验，每个 因子采用高低两个水平，根据实验设计方案进行试验，分析实验结果，计算出各因子的t 值和显 著水平。一般选择显著水平大于9 0 或8 0 以上的因素作为重要因素。p l a c k e t t b u r m a n 被广泛应 用于微生物培养时的主要影响因素的筛选试验中。 响应面法是1 9 5 1 年b o s - w i l s o n 开发的用于化学过程因子优化的一种综合性方法( b o xg e p a n db e h n k e ndw ，1 9 5 1 ) 。响应面法的目的就是用数学模型来描述实验的影响因子与目标响应值 间的关系。并以此为根据，确定其最佳条件。该法能在设计合理的有限次数实验下，评价各因子 对生物过程的影响，探清其交互作用的程度，最后求得其最优化条件。 1 5 微生物发酵 1 5 1 影响微生物发酵的因素 1 5 1 1