（生物化学与分子生物学专业论文）秀丽线虫脂肪积累的感知调控.pdf

中文摘要 秀丽线虫脂肪积累的感知调控 东南大学 摘要 对秀丽线虫脂肪积累调控机制的研究已经取得了一定的进展。在线虫对环境信号的 感知过程中，纤毛结构( c i l i u m ) 起了重要作用。以往研究暗示纤毛结构与功能相关基 因可能参与了线虫脂肪积累的调控。本研究旨在详细阐明纤毛在线虫脂肪积累中的作 用，同时对温度感知在线虫脂肪积累调控中的作用进行研究，从而加深我们对于线虫脂 肪积累感知调控的深层次理解。 该研究工作分成两部分： ( 1 ) 纤毛结构与功能相关基因在线虫脂肪积累中的调控作用； ( 2 ) 温度感知在线虫脂肪积累中的调控作用 针对第一部分工作，首先，通过分析参与纤毛结构与功能调节的具代表性的1 8 个 基因突变后线虫脂肪积累情况，发现其中七种基因突变后线虫脂肪积累显著增加，这七 种基因分别为：d a f - 1 9 、c h e 一1 3 、o s t n j ，、o s m 一6 、d a f - l o 、t a x - 2 和f 辨4 。同时，基因c h e 一1 1 和o s m 3 突变后，线虫脂肪积累明显减少。d a f - 1 9 、c h e 一1 3 、o s m j 、o s m 6 、d a f - l o 、c h e 一1 1 和o s m 一3 分别参与维持纤毛的整体、中部、末梢结构以及币常形态，t a x 2 和t a x 4 参与 纤毛信号的传递。继而，分析这几种基因突变对于控制脂肪酸合成或降解关键步骤的限 速酶等编码基因转录表达水平的影响，发现这些基因突变后，部分脂肪酸代谢过程可能 受到了影响，如脂肪酸的重新合成、脂肪酸的转运、不饱和脂肪酸的合成、乙醛酸途径、 线粒体d 氧化、糖异生或糖酵解等。进一步确定所鉴定遗传位点与已知脂肪积累核心调 控基因之间的遗传关系，发现所鉴定遗传位点与d a f - 2 、d a f - 1 6 、d a f - 7 、n h r - 4 9 、s 6 p 一，、 m d t - 1 5 、t u b j 、b b s ，以及k a t - 1 存在不同程度的遗传关系，受到这些基因不同程度的遗 传调控或不同程度地调控这些基因的功能。进而，分析所鉴定九种基因之间的遗传关系， 发现d a f - 1 9 处于d a f - l o 上游，t a x - 2 和t a x 一4 位于d a f - l o 下游，c h e 一1 1 处于t a x - 2 和觚4 下游。 此外，我们发现，r n a i 降低d a f - 1 9 、t h e 一1 1 、d a f - l o 、o s m 一3 的表达后，a s e 神经 元纤毛变短。t a x - 2 、t a x 一4 及脂肪积累核心调控基因表达降低后，对a s e 神经元纤毛结 构基本无影响。b b s j 、c h e 一1 1 和d a f - l o 表达降低后，a f d 神经元纤毛木端荧光密度变 小，尺寸变大。t a x - 2 、t a x - 4 及其它脂肪积累核心调控基因表达降低后，对a f d 神经元 纤毛结构基本无影响。九种纤毛结构与功能相关基因突变后，对水溶性物质氯化钠和生 物素的趋向性均表现出较严重的缺陷；脂肪积累核心调控基因突变后，趋向性与野生型 类似。九种纤毛结构与功能相关基因突变后，对挥发性物质丁二酮和苯甲醛的趋向性趋 向性均表现出较严重的缺陷；b b s j 、t u b j 以及s b p 一表达量降低后，趋向性也产生缺 陷；但b b s j 、t u b j 以及s b p j 分别与九种纤毛结构与功能相关基因同时突变后，趋向 性与九种基因单独突变时类似；其它脂肪积累核心调控基因突变后，趋向性与野生型类 似。九种纤毛结构与功能相关基因突变后，对n a c l 形成的渗透压基本无回避反应。以 上数据暗示，脂肪积累的感知调控是一个相对独立的过程。 鉴于d a f - 1 9 、c h e 1 3 、o s m 一、o s m 一6 、d a f - l o 、c h e 一1 1 和0 8 1 7 1 3 分别参与维持纤毛的 中文摘要 整体、中部、末梢结构以及正常形态，t a x - 2 和t a x - 4 参与纤毛信号的传递，而这些基因 突变后脂肪积累会发生明显变化，因此纤毛结构的完整性、纤毛的正常形态以及正常的 信号传递功能对维持线虫正常的脂肪积累是必需的。 针对第二部分工作，首先，通过分析参与温度感知的1 8 种基因突变后线虫脂肪积 累情况，发现其中六种基因突变后，线虫脂肪积累显著增加，这六种基因分别是：t t x - 1 、 d g k - 1 、t a x - 2 、t a x - 4 、t t x - 3 和t i c s j 。t a x - 6 基因突变后，线虫脂肪积累明显减少。这些 基因分别参与a f d 或a 神经元温度趋向性功能的发挥。继而，分别分析这几种基因 突变对于控制脂肪酸合成或降解关键步骤的限速酶等编码基因转录表达水平的影响，发 现这些基因突变后，部分能量代谢过程可能受到了影响，如脂肪酸的重新合成、脂肪酸 的转运、不饱和脂肪酸的合成、乙醛酸途径、线粒体d 氧化、糖异生或糖酵解等。进一 步确定所鉴定遗传位点与已知脂肪积累核心调控基因之间的遗传关系，发现所鉴定遗传 位点与d a f 0 2 、d a f - 1 6 、d a f - 7 、n h r - 4 9 、s b p j 、m d t - 1 5 、t u b j 、b b s j 以及勋扣j 存在不同 程度的遗传关系，受到这些基因不同程度的遗传调控或不同程度地调控这些基因的功 能。 并且发现，部分温度感知相关基因会对a f d 神经元胞体结构产生影响。t a x - 2 、t a x - 4 和t t x - i 表达降低后，a f d 神经元胞体荧光密度有显著降低，同时荧光斑点尺寸变小。 部分温度感知相关基因在调控温度趋向性时与d a f - 2 、和d a f - 7 之间存在相互作用。除去 d a f - 2 和d a f - 7 ，其它脂肪积累核心调控基因对温度趋向性不产生影响。以上数据暗示， 脂肪积累的温度感知调控是一个相对独立的过程。 部分温度感知相关基因在调控永久性幼虫形成时与d a f - 2 、d a f - 1 6 和d a f - 7 存在相互 作用。 所鉴定温度感知相关基因的组织特异性恢复实验进一步确认了它们对脂肪积累的 调控很大程度上依赖于其在a f d 或a i y 神经元中的表达。所以，对温度的正确感知对 于脂肪积累的正常状态也是必需的。 因此，纤毛结构及其功能调节体系( 温度感知) 参与了秀丽线虫脂肪积累的分子调 控过程。 关键词：脂肪积累；纤毛结构；温度感知；遗传关系；代谢；秀丽线虫 i i 英文摘要 s e n s o r yc o n t r o lo f fa ts t o r a g ei n c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s s o u t h e a s tu n i v e r s i t y a b s t r a c t c i l i u ms t r u c t u r e sf u n c t i o ni nt h es e n s a t i o no fe n v i r o n m e n t a ls i g n a l si nc a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s p r e v i o u ss t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a tg e n e sa s s o c i a t e dw i t hs e n s o r yp e r c e p t i o nm a y b ei n v o l v e di nt h ec o n t r o lo ff a ts t o r a g ei nce l e g a n s i nt h ep r e s e n ts t u d y w ea r ea i mt o c l a d f yt h ef u n c t i o n a lr o l e so fc i l i u ms t r u c t u r ea n dt h e r m o s e n s o r yp e r c e p t i o ni nt h er e g u l a t i o n o ff a ts t o r a g e f o rt h ef u n c t i o n a lr o l e so fc i l u ms t r u c t u r e ，f i r s to fa l l ，s e v e ng e n e s ( d a f - 1 9 ，c h e 一1 3 ， o s m 1 ，o s m 一6 ，d a f - lo ，t a x 一2 ，a n dt a x - 4 ) w h o s em u t a t i o nw o u l dc a u s es i g n i f i c a n ti n c r e a s eo f 1 i p i da c c u m u l a t i o na n d t w og e n e s ( c h e 一1 1a n do s m 一3 1w h o s em u t a t i o nw o u l dr e s u l ti n s i g n i f i c a n td e c r e a s eo fl i p i da c c u m u l a t i o nw e r ei d e n t i f i e df r o me i g h t e e nr e p r e s e n t a t i v eg e n e s a s s o c i a t e dw i t hc o n t r o lo fc i l i as t r u c t u r ea n ds e n s o r yt r a n s d u c t i o n t h eg e n e so fd a f - 1 9 ， c h e 一1 3 ，o s m 一1 ，o s m 一6 ，o s m 一3 ，c h e 1 1a n dd a f - l op a r t i c i p a t ei nt h em a i n t e n a n c eo fc i l i a r y i n t e g r i t ya n dt h er e g u l a rs h a p eo fc i l i u m ，a n dg e n e so ft a x - 2a n dt a x - 4a r ei n v o l v e di ns e n s o r y t r a n s d u c t i o nc o n t r 0 1 i na d d i t i o n a l t e r e dt r a n s c r i p t1 e v e l so fg e n e se n c o d i n ge n z y m e st o c o n t r o ls y n t h e s i so rb r e a k d o w no ff a t t ya c i ds u g g e s tt h a tm u t a t i o no ft h e s ei d e n t i f i e dn i n e g e n e sw o u l da f f e c tr e l a t i v em e t a b o l i s ms t e p so ff a t t ya c i ds y n t h e s i s ，f a t t ya c i dd e s a t u r a t i o n ， m i t e c h o n d r i a l1 3 - o x i d a t i o n ，a n dg l y c o l y s i s m o r e o v e r , w ee x a m i n e dt h eg e n e t i ci n t e r a c t i o n o ft h e s ei d e n t i f i e dn i n eg e n e sw i t hc e n t r a ls i g n a l i n gp a t h w a y sc o n t r o l l i n gf a ts t o r a g e ，a n do b r d a t as u g g e s tt h a tt h e s ei d e n t i f i e dn i n eg e n e sg e n e t i c a l l yi n t e r a c tt od i f f e r e n td e g r e e sw i t ht h e c e n t r a ls i g n a l i n gp a t h w a y sm e d i a t e db yd a f - 2 ，d a f - 1 6 ，d a f - 7 , n h r - 4 9 ，s b p 一1 ，m d t - 1 5 ，t u b 一1 ， b b s 1 。a n dk n t j f u r t h e r m o r e ，w ei n v e s t i g a t e dt h eg e n e t i ci n t e r a c t i o n sa m o n gt h e s e i d e n t i f i e dn i n eg e n e s ，a n df o u n dt h a td a f - 1 9a c t e du p s t r e a mo f d a f - l o , d a f - l oa c t e du p s t r e a m o ft a x - 2a n dt a x 4 。a n dc h e 一11a c t e dd o w n s t r e a mo ft a x - 2a n dt a x 一4 i na d d i t i o n ，w ef o u n dt h a tm u t a t i o no fs o m eg e n e ss u c ha sd a f - 1 9 ，c h e 一1 1 ，d a f - l o , a n d o s m 一3i n f l u e n c e dt h es t r u c t u r e so fc i l i u me n d i n g so fa s en e u r o n m u t a t i o no fg e n e ss u c h a st a x - 2 a n dt a x - 4a n dk n o w nc e n t r a lc o n t r o l l i n gg e n e sf o rf a ts t o r a g ed i dn o ta f f e c tt h e s t r u c t u r e so fc i l i u me n d i n g so fa s es e n s o r yn e u r o n s i m i l a r l y ，m u t a t i o no fs o m eg e n e s s u c ha sb b s 一1 c h e - l la n dd a f - l oi n f l u e n c e dt h es t r u c t u r e so fc i l i u me n d i n g so fa f dn e u r o n m u t a t i o no fg e n e ss u c ha st a x - 2 ，a n dt a x 一4a n do t h e rk n o w nc e n t r a lc o n t r o l l i n gg e n e si n f a t s t o r a g ed i dn o ta f _ f e c tt h es t r u c t u r e so fc i l i u me n d i n g so fa f ds e n s o r yn e u r o n w e r m s w o u l ds h o ws e r i o u sd e f e c t so fc h e m o t a x i st on a c la n db i o t i na f t e rt h en i n ec i l i as t r u c t u r ea n d f u n c t i o nr e l a t e dg e n e sw e r ek n o c k e dd o w n ，b u tm u t a t i o n so fk n o w nk e yc o n t r o l l i n gg e n e sf o r f a ts t o r a g ew o u l di n d u c es e v e r ed e f e c t so fc h e m o t a x i st on a c la n db i o t i n a f t e rt h en i n e c i l i as t r u c t u r ea n df u n c t i o nr e l a t e dg e n e sa n dg e n e so fb b s 1 ，t u b 一1a n ds 助一1w e r ek n o c k e d d o w n ，m u t a n t ss h o w e dr e l a t i v e l ys e v e r ed e f e c t so fc h e m o t a x i st od i a c e t y la n db e n z a l d e h y d e ， l i l 英文摘要 b u tt h ep h e n o t y p e so fc h e m o t a x i st od i a e e t y la n db e n z a l d e h y d ei nd o u b l em u t a n t so fb b s - 1 m 6 - 1a n ds b p - 1 w i t hn i n ec i l i as t r u c t u r ea n df u n c t i o nr e l a t e dg e n e sw e r es i m i l a rt ot h o s eo f s i n g l em u t a n t so fn i n ec i l i as 缸u c t u r ea n df u n c t i o nr e l a t e dg e n e s s i m i l a r l y , m u t a t i o n so f k n o w nk e yc o n t r o l l i n gg e n e sf o rf a ts t o r a g ew o u l di n d u c es e v e r ed e f e c t so fc h e m o t a x i st o d i a c e t y la n db e n z a l d e h y d e t h e s ed a t as u g g e s tt h a ts e n s o r yr e g u l a t i o no ff a ts t o r a g em i g h t r e p r e s e n tar e l a t i v e l yi n d e p e n d e n tp r o c e s si nc o n t r o l l i n gl i p i da c c u m u l a t i o ni nn e m a t o d e s t h e r e f o r e ，c o n s i d e r i n gt h ef a c tt h a tg e n e so f d a f - 1 9 ，c h e 1 3 ，o s m 1 ，o s m 6 ，o s m - 3 ，c h e - 1 1 a n dd a f - l op a r t i c i p a t ei nt h em a i n t e n a n c eo f c i l i a r yi n t e g r i t ya n dt h er e g u l a rs h a p eo fc i l i u n l a n dg e n e so ft a x - 2a n dt a x - 4a r ei n v o l v e di ns e n s o r yt r a n s d u c t i o nc o n t r o l ，m a i n t e n a n c eo f n o r m a lc i l i u ms t r u c t u r e sa n df u n c t i o n si se s s e n t i a lf o rt h ef a ts t o r a g ec o n t r o li nce l e g a n s f o rt h ef u n c t i o n a lr o l e so f t h e r m o s e n s o r yp e r c e p t i o n , s i xg e n e s ( t t x - 1 ，d g k - 1 ，t a x - 2 ， t a x - 4 、t t x - 3a n db c s j ) w h o s em u t a t i o nw o u l dc a u s e s i g n i f i c a n ti n c r e a s eo fl i p i da c c u m u l a t i o n a n dt a x - 6w h o s em u t a t i o nw o u l dr e s u l ti ns i g n i f i c a n td e c r e a s eo f l i p i da c c u m u l a t i o nw e r e i d e n t i f i e df r o me i g h t e e nr e p r e s e n t a t i v eg e n e sa s s o c i a t e dw i t ht h e r m o s e n s a t i o n t h e s eg e n e s p a r t i c i p a t ei nt h ec o n t r o lo ft h e r m o t a x i sf u n c t i o nm e d i a t e db va f da n da i yn e u r o n s i n a d d i t i o n , a l t e r e dt r a n s c r i p tl e v e l so fg e n e se n c o d i n ge n z y m e st oc o n t r o ls y n t h e s i so r b r e a k d o w no ff a t t ya c i ds u g g e s tt h a tm u t a t i o no ft h e s ei d e n t i f i e dn i n eg e n e sw o u l da l s oa f f e c t r e l a t i v em e t a b o l i s ms t e p so ff a t t ya c i ds y n t h e s i s ，f a t t ya c i dd e s a t u r a t i o n ，m i t o c h o n d r i a l 1 3 - o x i d a t i o n ，a n dg l y c o l y s i s f u r t h e r m o r e ，w ee x a m i n e dt h eg e n e t i ci n t e r a c t i o no ft h e s e i d e n t i f i e dn i n eg e n e sw i t hc e n t r a ls i g n a l i n gp a t h w a y sc o n t r o l l i n gf a ts t o r a g e ，a n do u rd a t a s u g g e s tt h a tt h e s ei d e n t i f i e ds e v e ng e n e sa l s og e n e t i c a l l yi n t e r a c tt od i f f e r e n td e g r e e sw i t ht h e c e n t r a ls i g n a l i n gp a t h w a y sm e d i a t e db yd a f - 2 ，d a f - 1 6 , d a f - 7 , n h r - 4 9 ，s b p 一1 ，m d t - 1 5 ，t u b 1 ， b b s 一1 ，a n dk a t - 1 i na d d i t i o n ，w ef o u n dt h a tm u t a t i o no fs o m e g e n e s ，s u c ha st a x - 2 ，t a x 一4 ，a n dt t x - 1 w o u l d i n f l u e n c et h ep a t t e r n so f s e n s o r y e n d i n g so fa f ds e n s o r yn e u r o n s o m et h e r m o t a x i sr e l a t e d g e n e sc o u l dg e n e t i c a l l yi n t e r a c tw i t hd a f - 2a n dd a f - 7i nr e g u l a t i n gt h et h e r m o t a x i sb e h a v i o r e x c e p td a f - 2a n dd a f - 7 , m u t a t i o n so fk e yc o n t r o l l i n gg e n e sf o rf a ts t o r a g es h o w e dn oe f f e c t s o nt h e r m o t a x i sb e h a v i o r s t h e s ed a t as u g g e s tt h a tt h e r m o s e n s o r yc o n t r o lo ff a ts t o r a g e m i g h ta l s or e p r e s e n tar e l a t i v e l yi n d e p e n d e n tp r o c e s si nc o n t r o l l i n gl i p i da c c u m u l a t i o ni n n e m a t o d e s s o m e g e n e sa s s o c i a t e dw i t ht h e r m o s e n s a t i o ng e n e t i c a l l yi n t e r a c e dw i t hd a f - 2 ，d a f - 1 6a n d d a f - 7i nt h ec o n t r o lo fd a u e rf o r m a t i o n t h ee x p r e s s i o no fi d e n t i f i e dg e n e si na f d s e n s o r yn e u r o no ra i yi n t e m e u r o n c o n t r i b u t e dl a r g e l yt ot h ea c q u i s i t i o no f s p e c i f i cp a t t e r n so ff a ts t o r a g e ，f u r t h e rc o n f i r m i n gt h e i m p o r t a n tf u n c t i o n so ft h e r m o s e n s o r yp e r c e p t i o ni nt h ef a ts t o r a g ec o n t r 0 1 t h e r e f o r e ，t h ec o n t r o lm a c h i n e r yf o rc i l i as t r u c t u r ea n dt h et h e r m o s e n s a t i o nf u n c t i o n p a r t i c i p a t ei nt h er e g u l a t i o no ff a ts t o r a g ei nce l e g a n s k e yw o r d s ：f a ts t o r a g e ，c i l i u ms t r u c t u r e ，t h e r m o s e n s o r yp e r c e p t i o n ，g e n e t i ci n t e r a c t i o n , m e t a b o l i s m ，c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s i v 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生签名：盗皇盘 e l期：毫q 亟：乡 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：i 笙至捂导师签名： 前言 前言 脂肪是生物体能量的主要储存形式。生物体对能量产生、储存和释放的调控能力对 自身的健康和生存是至关重要的。秀丽线虫具有非常清晰的解剖和遗传背景，对它的脂 肪进行标记非常简单，脂肪颗粒的定量也较方便，从而线虫成为研究脂肪积累调控机制 的良好模型。对线虫脂肪积累的研究成为近十年来的研究热点。 已经发现，d a f - 2 介导的胰岛素信号通路和d a f - 7 介导的t g f p 信号通路在线虫的 脂肪积累中发挥重要作用。d a f - 2 是胰岛素受体家族的唯一成员，与胞外胰岛素类似配 体结合后，将信号传递到胞内，在靶基因d a f - 1 6 的作用下对线虫的脂肪积累进行调控。 a a f - 2 突变后，线虫积累较多脂肪。d a f - 7 在与d a f - 2 平行的通路上调控线虫的脂肪积累， d a f - 7 突变后，同样使线虫脂肪积累增加。核激素受体n h r - 4 9 、固醇反应元件结合蛋白 s b p j 、转录共激活子m d t - 1 5 、色氨酸羟化酶t p h j 以及t o r 和氨基己糖信号通路也参 与了线虫脂肪积累的调控。 已有研究暗示，部分纤毛结构与功能相关基因可能参与了线虫脂肪积累的调控。 t u b j 在所有带纤毛的神经元中表达，t u b 一突变体线虫的脂肪积累是野生型的1 5 倍。k a t - 1 编码3 酮基辅酶a 一硫解酶，t u b j 与k a t - 1 的作用是相互增效的。在对k a t - 1 的遗传分析中， 发现b b s j 也调控了线虫的脂肪积累。b b s j 表达于1 5 种带纤毛的神经元。c h e 2 、o s m 一5 和d a f - 6 单突变后对脂肪积累基本无影响；t a x - 2 、t a x - 4 突变后，线虫脂肪积累有少量增加， 但当它们与妇扣j 双突变后，线虫脂肪积累却有明显地增加。秀丽线虫主要是靠带纤毛的 感觉神经元感知外界的环境信号，纤毛是作为感觉的受体发挥作用的。若纤毛结构发生 缺陷，线虫对环境的感知便会受到影响。因此，目前我们正面对着这样一些问题需要回 答：纤毛在线虫脂肪积累中究竟起到了一种怎样的作用? 纤毛结构与功能相关基因在调 控脂肪积累时与其他已知通路及重要遗传位点之间的遗传关系是怎样的? 它们之间又 有怎样的关系? 为此，本论文中对纤毛结构与功能调节体系与脂肪积累之间的关系进行 了系统的研究，旨在揭示脂肪积累感知调控的内在分子机制。 同时，鉴于线虫脂肪积累调控基因与其它物种之间的高度保守性，这部分工作也将 对其他高等动物与人肥胖疾病研究起到重要的启示作用。 东南大学硕士学位论文 文献综述 秀丽线虫脂肪积累调控的生理与分子机制 生物体对能量产生、储存和释放的调控能力对自身的健康以及生存是至关重要的。 能量的主要储存形式之一是脂肪，但是脂肪不正常地积累也会引起许多种疾病。鉴于近 些年随着人们生活方式的改变，肥胖病等代谢疾病的发病率逐年增高，深入揭示脂肪积 累的内在生理与分子调控机制对于临床上治疗与预防肥胖病等代谢疾病具重要意义。 秀丽线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 是当前国际上研究脂肪积累生理与分子机制的重要 模型之一【l 。3 j 。线虫之所以能够成为研究脂肪积累的重要模式动物，原因在于：其一、 线虫的脂肪颗粒主要存储于肠道细胞及皮下细胞，且线虫身体通体透明，利用整体动物 便可观察到肠道细胞及皮下细胞脂肪的堆积。其二、方法上，线虫中的脂肪颗粒标记很 简单。苏丹黑b 可以使固定好的线虫脂肪着色，肠道内的脂肪颗粒可以用n i l er e d 荧 光探针来标记。其三、线虫中具体脂肪酸的组分可以利用气相色谱或气相色谱质谱分 析( g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y , g c m s ) 联用的方法进行考察。其四、线虫 中脂肪酸合成与降解的代谢与其他动物以及人体中的生化通路是相同或相似的，尤其是 线虫脂肪代谢各关键代谢步骤的限速酶与其他物种中是基本相同的。其五、线虫脂肪积 累的核心调控通路已经基本鉴定出来，例如d a f - 2 介导的胰岛素信号通路及d a f - 7 介导 的t g f b 信号通路平行地调控线虫的脂肪积累，n h r - 4 9 、s b p j 、m d t - 1 5 、t u b j 和b b s j 也参与了线虫脂肪积累的调控，在对t u b j 的遗传分析中发现妇扣j 在线虫的脂肪积累 中也起到重要的调控作用。最后，线虫具有模式动物所应该具有的诸多研究优势，具有 丰富的遗传资源与详尽的遗传背景。因此，近十年来，线虫已经成为目前备受重视的研 究脂肪积累的模型动物。 本篇综述将对线虫脂肪积累的生理与分子调控机制进行系统的介绍与分析。具体而 言，将从如下几个方面进行阐述：( 1 ) 线虫脂肪颗粒的标记，( 2 ) 脂肪积累的代谢调 节，( 3 ) 脂肪积累的核心信号调控通路， ( 4 ) 脂肪积累的神经调控，与( 5 ) k a t - 1 在 脂肪积累中的调控作用。 一、线虫脂肪颗粒的标记 针对线虫中脂肪颗粒的标记，一种比较传统的方法是利用脂溶性的染料苏丹黑b ( s u d a nb l a c kb ) 来使脂肪着色。操作程序上，首先用多聚甲醛将线虫固定，脱水，然 后加入亲脂性的苏丹黑b 染色( 1 5 c 培养箱处理6 小时) ，再进行逐级分色，便可在 光学显微镜下直接观察到清晰的脂肪颗粒【4 ，5 】。通过这种标记方法，不仅可以分析脂肪 颗粒的分布区域，还可以比较清晰地观察到脂肪颗粒的各种类型。并且，结合这些特点， 基于标记颗粒颜色的深浅与颗粒的数目进行相对地定量。即，该种技术是一种可以同时 进行定性与定量分析的方法。用一种活体染料n i l er e d 可以将活体线虫肠道内的脂肪染 色。将n i l er e d 均匀涂布于有食物的n g m 培养基表面，线虫摄取食物的同时也会将 n i l er e d 摄入体内，从而肠道内的脂肪着色。n i l er e d 与苏丹黑b 染色的结果类似。n i l e r e d 不会对线虫的生长速率、产卵数量、咽泵运动、永久性幼虫形成、复苏以及生命周 期产生负面影n a t l 6 ，。 2 文献综述 二、脂肪积累的代谢调节 线虫中脂肪酸代谢的基本通路如图1 所示。参与秀丽线虫脂肪酸代谢重要遗传位点 及其编码的酶和参与的生理过程如表1 所示。 盾肪酸 合成乙 乙黼童a 脂肪酸者泡和酶 啦工j 白r - 民a t - 力 脂肪酸结合蛋白 ( 1 印- j 、印? ) 丘裔髓翻l 莓 t 图l ：线虫脂肪酸代谢通路及相关重要调控基因 乙酰辅酶a 作为脂肪酸重新合成的底物，经乙酰辅酶a 羧化香劬d 正2 等作用，生成游离脂肪酸。磷脂 在磷脂酶作用下，同样也可生成游离脂肪酸。游离脂肪酸同时参与线粒体p 氧化、过氧化物酶体p 氧 化以及不饱和脂肪酸的合成。游离脂肪酸经过线粒体p 氧化和过氧化物酶体p 氧化重新生成乙酰辅酶 a ，参与乙醛酸途径；生成草酰乙酸盐( 或酯) 后，进入糖质新生途径；生成葡萄糖后，进入糖酵 解途径。 ( 一) 脂肪酸的分解途径 通常情况下，细胞分解脂肪并最终产生a t p ，其中储存备用的三酸甘油脂的利用是 由脂肪酶来实现的。分解得到的脂肪酸在酰基辅酶a 合成酶的作用下生成对应的酰基辅 酶a ，并在过氧化物酶体或线粒体内p 氧化酶的作用下，脂肪酰辅酶a 逐渐被分解为乙 酰基辅酶a 【8 1 。在线虫过氧化物酶体p 氧化过程中，e c h 一3 、e e h 一8 、e c h 一9 编码羟脂酰辅酶 a 脱氢酶烯脂酰辅酶a 水化酶，k a t - 1 编码硫解酶。在线虫线粒体p 一氧化过程中，g c s 一2 编 码酰基辅酶a 合成酶，e c h j 编码羟脂酰辅酶a 脱氢酶烯脂酰辅酶a 水化酶。 ( 二) 脂肪酸的合成和储存途径 脂肪酸合成的重要底物是乙酰辅酶a ，乙酰辅酶a 在羧化酶的作用下生成单酰辅酶 a ，然后在脂肪酸延长酶的作用下逐步延长生成不同长度的脂肪酸，饱和脂肪酸经去饱 和酶作用生成不饱和脂肪酸。内源或外源的脂肪酰基辅酶a 首先转化成磷脂酸、甘油二 酯，最终生成甘油三酯储存起来【7 1 。在线虫脂肪酸合成过程中，p o d - 2 编码乙酰辅酶a 3 样酵 二上去卫土 东南大学硕士学位论文 表1 ：参与线虫脂肪酸代谢重要遗传位点及其编码的酶和参与的生理过程 遗传位点基因编码的酶参与的生理过程 p o d - 2 w 0 9 8 6 1乙酰辅酶a 羧化酶 脂肪酸合成 一 c 0 3 h 5 4磷脂酶 磷脂合成 一 c 0 7 e 3 9磷脂酶 磷脂合成 t b p j f 4 0 f 4 3脂肪酸结合蛋白脂质运输 l b p - 8 t 2 2 g 5 6脂肪酸结合蛋白 脂质运输 向t - 5w 0 6 d 1 2 3棕榈酰辅酶a 去饱和酶 十六烯酸合成 廊t - 6 v z k 8 2 2 l 1硬脂酰辅酶a 去饱和酶 十八烯酸合成 庙扣7 f 1 0 d 2 9硬脂酰辅酶a 去饱和酶 十八烯酸合成 a c s - 2f 2 8 f 8 2酰基辅酶a 合成酶 线粒体d 氧化 e c h jc 2 9 f 3 1烯脂酰辅酶a 水化酶线粒体d 氧化 k a t - 1t 0 2 g 5 8硫解酶 过氧化物酶体d 氧化 g e i - 7 c 0 5 e 4 9苹果酸合成酶 乙醛酸途径 w 0 5 g 11 6磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶糖异生 一 r 11 a 5 4磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶糖异生 g p d - 3 k 1 0 8 3 7 3 磷酸甘油醛脱氢酶糖酵解、糖异生 羧化酶。在线虫不饱和脂肪酸合成中，廊乒又廊扣6 、廊f - 7 编码脂肪酸去饱和酶，t b p j 、 t b p 一8 编码脂肪酸结合蛋白。 在线虫脂肪酸的代谢中，若代谢相关的酶发生遗传变化，线虫体内脂肪的积累水平 也会发生明显变化。例如，若降低磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和3 。磷酸甘油醛脱氢酶 ( g p d - 3 ) 的表达，线虫的脂肪积累减少；编码酰基辅酶a 合成酶的a c s 一2 和编码羟脂酰辅 酶a 脱氢酶的e c h 一表达量降低后，线虫脂肪积累增加；编码硫解酶的k a t - 1 表达量降低后， 线虫会积累较多的脂肪；脂肪酸合成( 如乙酰辅酶a 羧化酶，脂肪酸合成酶) 、磷脂合 成( 如丝氨酸棕榈酰转移酶) 、甘油三酸酯合成( 如磷酸甘油酰基转移酶) 通路上的基因 失活后，脂肪积累减少；某些有关脂肪酸氧化的基因失活后，线虫脂肪积累也会发生变 化，如2 ，4 二烯酰辅酶a 还原酶和长链酰基辅酶a 硫酯酶【1 , 9 , 1 0 。 另外，脂肪酸延长酶e l o 一2 f 11 e 6 5 参与棕榈酸的延长和多不饱和脂肪酸的合成。 r n a i 使e l o 2 表达降低后，线虫脂肪积累减少【l 】，棕榈酸盐增多，多不饱和脂肪酸减少。 且这种脂肪酸组成的失衡导致多种表型缺陷，如生长变慢、体长变小、生殖缺陷、排泄 周期变化 11 1 。 向t - 5 、f a t - 6 矛l f a t -