（遗传学专业论文）骨形态发生蛋白7bmp7在小鼠蜕膜细胞的表达及功能研究.pdf

重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名： 缝益套 日期： 丝应：龟墨旦 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 目录 英汉缩略语名词对照1 摘要3 a b s t r a c t 5 骨形态发生蛋白7 ( b m p 7 ) 在小鼠蜕膜细胞的表达及功能研究8 前言。8b 玎置”葛 第一部分b m p 7 在妊娠小鼠子宫内膜的表达9 1 材料与方法。9 2 结果1 4 3 讨论。1 6 参考文献1 8 第二部分b m p 7 在小鼠子宫蜕膜细胞中的表达及作用探讨2 0 1 材料与方法2 0 2 结果。2 s 3 讨论3l 参考文献3 3 第三部分b m p - 7 基因表达的调控。3 5 1 材料和方法3 5 2 结果4 0 3 讨论4 2 参考文献。4 4 总结与展望4 6 文献综述：骨形态发生蛋白研究进展。4 7 致谢。5 6 攻读硕士期间发表文章及参加会议，。5 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 a b s a b p c d n a 8 b r c a n m d d e p c d m e m d n a d n t p e 2 e d l a f 1 2 f b s h k d k g l m m m m o l m l m l n m g p f u 英汉缩略语名词对照 英文全称 a b s o r b a n c e b o v i n es e r u ma l b u m i n b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a 8 - b r o m o - c y c l i c3 ，5 a m p d a y d i e t h y i p y r o c a r b o n a t e 中文全称 吸光度 牛血清白蛋白 碱基对 互补脱氧核糖核酸 8 一溴一环磷酸腺苷 天数 焦碳酸二乙酯 d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m d 甚u l b e c c 。改良e a g l e 培养 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 e s t r a d i o l 雌二醇 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 n u t r i e n tm i x t u r ef 1 2h a m sf 1 2 培养基 f e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 h o u r 小时 k i l o d a l t o n 千道尔顿 k i l o g r a m 千克 l i g h t 光照 m i l l i m e t e r 毫米 m i l l i m o l 毫摩尔 m i l l i l i t e r 毫升 m i n u t e 分钟 m i l l i g r a m 毫克 p l a q u ef o r m i n gu n i t 空斑形成单位 l p c r p b s p 4 p m s f 叩m r n a r t s e c s d s t r i s t b e t e l 峙 v w p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p h o s p h a mb u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲液 p r o g e s t e r o n e 孕酮 p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 r o t a t i o n sp e rm i n u t e r i b o n u c l e i ca c i d r e v e r s et r a n s c r i p t i o n s e c o n d 转| 贪 核糖核酸 逆转录 秒 s o d i u md o d e c y l s u l f o n a t e 十二烷基硫酸钠 t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 t r i s b o r a t e e d t a t r o p h e c t o d e r m m i c r o l i t e r m m r o g r a m v o l t w e e k 2 t r i 一硼酸e d t a 缓冲液 滋养外胚层 微升 微克 伏 周龄 重庆医科大学硕士研究生学位论文 骨形态发生蛋白7 ( b m p 7 ) 在小鼠蜕膜细胞的 表达及功能研究 摘要 目的：胚胎着床是胎生哺乳动物及人类生殖生理的重要环节，是 母体子宫与胚胎同步发育、在特定时期即“着床窗 开放期间精确调 节、快速完成的生理现象。妊娠需要子宫组织发生广泛的重建，子宫 内膜细胞生长和分化，即发生蜕膜化。子宫内膜的蜕膜化过程对于成 功的着床和妊娠的维持是必需的。蜕膜化过程涉及黏附分子、蛋白水 解酶、生长因子、细胞因子、血管活性因子以及多种基因的相互作用 和调节。已有研究表明b m p s 家族在小鼠胚胎发育过程中都有表达， 为进一步研究其家族中b m p 7 在小鼠子宫中的表达规律和作用，本实 验采用细胞原代培养、荧光定量p c r 、免疫组织化学、免疫细胞化学、 w e s t e r nb l o t t i n g 等方法从m r n a 和蛋白水平检测b m p - 7 在妊娠小鼠子 宫中的表达，探索其在子宫内膜蜕膜化过程中的作用。 方法：1 r t p c r 和免疫组织化学技术分别观察b m p 7 的m r n a 和 蛋白在妊娠第5 8 日小鼠子宫中的表达情况；2 原代培养小鼠子宫基质 细胞，用孕酮、雌二醇和c a m p 诱导蜕膜化，并在诱导蜕膜化的同时分 另1 j j 1 ) k 1 0 n g m l 、1 0 n g m l 、1 0 0 n g m lb m p - 7 重组腺病毒，于2 4 h 、4 8 h 、 7 2 h 、9 6 h 检测催乳素的表达；3 去卵巢小鼠随机分3 组，分别皮下注射 芝麻油( 0 1 m l 只) 、孕酮( 2 0 m g 只) 、r u 4 8 6 ( 2 0 m g 只卜孕酮( 2 0 m g 只) ， 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 于注射后o h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 处死小鼠收集子宫，提取子宫i a 和总蛋 白，荧光定量p c r 、w e s t e r nb l o t t i n g 检测b m p 7 的表达情况。 结果：1 妊娠第5 8 日，b m p 7m r n a 在小鼠子宫着床位点的表达 高于着床旁组织( 尸 o 0 1 ) ，且在着床点的表达随着妊娠天数的增加 逐渐增强( p 0 0 5 ) 。妊娠第5 日、第6 日，b m p 7 蛋白分别表达于植入 胚胎周围的基质细胞和初级蜕膜带；第7 日、第8 日，主要表达于次级 蜕膜带以及植入位点系膜侧基质细胞。2 在小鼠子宫基质细胞的蜕膜化 过程中，b m p 7 重组腺病毒组催乳素的m r n a 和蛋白表达均显著增加 ( p o 0 1 ) ，其中1 0 n g m l 组增加最明显( p o 0 1 ) 。3 去卵巢小鼠模 型研究显示：孕酮上调了小鼠子宫组织b m p 7 的表达( 氏o 0 1 ) ，孕酮 受体拮抗剂i w 4 8 6 能有效阻断孕酮对b m p - 7 的上调作用( 尸 o 0 5 ) 结论：b m p 7 基因在小鼠子宫内的表达受孕酮调控，具有促进小 鼠子宫内膜蜕膜化的效应。 关键词：骨形态发生蛋白- 7 ( b m p 一7 ) ，子宫内膜，蜕膜化 4 s p a t i o t e m p o r a le x p r e s s i o n a n df u n c t i o no f b o n em o r p h o g e n e t i c p r o t e i n7i nd e c i d u a l c e l l si nm i c e a b s t r a c t o b j e c t i v e s ：e m b r y oi m p l a n t a t i o n i sa ni m p o r t a n ta n dc o m p l i c a t e d p h y s i o l o g i c a lp r o c e s si nv i v i p a r o u sm a m m a l i a na n dh u m a n r e p r o d u c t i o n ， w h i c hi sa l s oap r e c i s e l yr e g u l a t e da n dq u i c k l ya c c o m p l i s h e dp h y s i c a l p h e n o m e n o ns y n c h r o n i z e d w i t h d e v e l o p m e n t o fm a t e r n a lu t e r u sa n d e m b r y oa t a p a r t i c u l a r t i m en 锄e d i m p l a n t a t i o nw i n d o w p r e g n a n c y n e e d se x t e n s i v er e c o n s t r u c t i o n o fu t e r u sa sw e l l a s g r o w t h a n d d i 仃e r e n t i a t i o no fe n d o m e t r i a lc e l l ，w h i c hi sd e c i d u a l i z a t i o n i na d d i t i o n ，t h e d e c i d u a l i z a t i o np r o c e s si n v o l v e st h ei n t e r a c t i o na n dr e g u l a t i o no f a d h e s i o n m o l e c u l e s ，p r o t e o l y t i ce n z y m e s ，g r o w t hf a c t o r s ，c y t o k i n e s ，v a s o a c t i v e f a c t o r sa n dm u l t i p l eg e n e s c o m p a r a t i v er e s e a r c h s h o w sb m p sw e r e e x p r e s s e dd u r i n ge m b r y od e v e l o p m e n ti n m i c e t of u r t h e rs t u d yt h e e x p r e s s i o np a t t e r n a n dr o l e so fb m p - 7i nu t e r u s ， w eu s ev a n o u s a p p r o a c h e s i n c l u d i n gp r i m a r y c e n c u l t u r e ，q u a n t i t a t i v e p c r , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，i m m u n o c y t o c h e m i s t r y , w e s t e r nb l o t t i n g w ed e t e c t t h el e v e l so fb m p 7m r n aa n dp r o t e i n i nt h ep r e g n a n tm o u s eu t e r i n e e n d o m e t r i ai no r d e rt oe x p l o r et h er o l e o fb m p 一7i nd e c i d u a l i z a t i o n 5 p r o c e s s m e t h o d s ：1 r t - p c ra n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw e r ea p p l i e d t o a n a l y z eb m p 7m r n aa n dp r o t e i ni n m o u s eu t e r i n ee n d o m e t r i u mf r o m d a y5t o8o fp r e g n a n c y 2 m o u s eu t e r i n es t r o m a l c e l l sw e r ei s o l a t e df r o m u t e r u so fp r e g n a n td a y4a n dc u l t u r e di nd m e mc o n t a i n i n g 10 f e t a l b o v i i l es e r u m d e c i d u a l i z a t i o no fs t r o m a l c e l l sw a si n d u c e du s i n g p r o g e s t e r o n e ，e s t r a d i o l ，a n dc a m p f o l l o w e db yt r a n s f e c t e dw i t h1 0n g m l ， 10n g m l ，10 0n g m lr e c o m b i n a n tb m p 一7a d e n o v i r u s ，r e s p e c t i v e l y a f t e r7 2 ho fc u l t u r e ，t h ee x p r e s s i o no fp r o l a c t i n ，at y p i c a lm a r k e ro fd e c i d u a lc e l l s ， w a sd e t e c t e db yr t - p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g 3 o v a r i e c t o m i z e dm i c e w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o3g r o u p s e a c hg r o u pw e r es u b c u t a n e o u s l y i n j e c t e d w i t hs e s a m e o i l ( o 1m l m o u s e ) ，p r o g e s t e r o n e ( 2 m g m o u s e ) ， r u 4 8 6 ( 2 m g m o u s e ) a n dp r o g e s t e r o n e ( 2 m g m o u s e ) ，r e s p e c t i v e l y a l lm i c e w e r ek i l l e da to h ，6 h ，12 h ，2 4 ha f t e ri n j e c t i o nt oc o l l e c tt h eu t e r as a m p l e s i n o r d e rt oa c h i e v eu t e r i n er n aa n dt o t a lp r o t e i nf r o mw h i c hb m p 7l e v e l s w a sl a t e re x a m i n e db yq u a n t i t a t i v ep c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s ：1 t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fb m p 一7m r n a w a sh i g h e ri nt h e i m p l a n t a t i o ns i t e st h a nt h a ti ni n t e r - i m p l a n t a t i o ns i t e sd u r i n gd a y 5t o8o f p r e g n a n c y ( p o 01 ) ，a n dt h el e v e li n c r e a s e dg r a d u a l l y a sd a y sp a s s e db yi n t h ei m p l a n t a t i o ns i t e s ( p o 0 5 ) b m p 一7p r o t e i n w a se x p r e s s e di nt h e d e c i d u a l i z i n gs t r o m a lc e l l st i g h t l ys m r r o u n d i n gt h eb l a s t o c y s ta td a y5 a n d i nt h ep r i m a r yd e c i d u a lz o n ea td a y6 6 p r o g e s s i v e l y , t h ep o s i t i v ed e t e c t i o n lr【rl a p p e a r e dm a i n l yi n t h es e c o n d a r yd e c i d u a lz o n ee s p e c i a l l yi nt h es t r o m a l c e l l so fm e s o m e t r i a lp o l ea td a y7a n dd a y8 2 d u r i n gd e c i d u a l i z a t i o no f s t r o m a lc e l l s ，t h ee x p r e s s i o no fp r o l a c t i np r o t e i ni nr e c o m b i n a n tb m p - 7 a d e n o v i r u sg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( 尸 o o1 ) ，e s p e c i a l l yi n 10 n g m lg r o u p ( p o 01 ) 3 p r o g e s t e r o n e w a sd e m o n s t r a t e d w i t h o v a r i e c t o m i z e dm o u s em o d e l st ou p r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fb m p - 7 m r n a ( p o 01 ) r u 4 8 6 ，a ns p e c i f i ca n t a g o n i s to fp r o g e s t e r o n er e c e p t o r , i sc a p a b l eo fa b r o g a t i n gp r o g e s t e r o n ee f f e c to nb m p - 7 c o n c l u s i o n s ：b m p 7g e n ew a sd e m o n s t r a t e dt ob ei n v o l e d i ni n d u c i n g t h ed e c i d u a l i z a t i o no fu t e r i n es t r o m a lc e l l si ne a r l yp r e g n a n tm i c ea n d t h i s e f f e c tw a sr e g u l a t e db yp r o g e s t e r o n e k e yw o r d s ：b m p 一7 ，e n d o m e t r i u m ，d e c i d u a l i z a t i o n 7 p r 重庆医科大学硕士研究生学位论文 骨形态发生蛋白7 ( b m p 7 ) 在小鼠蜕膜细胞的 表达及功能研究 丽昌 啮齿类动物和灵长类动物胚胎植入过程包括子宫腔上皮细胞的粘附和入侵。 成功的胚胎植入要求子宫基质细胞的快速重构，即发生蜕膜化。蜕膜化过程中， 子宫基质细胞增殖和分化为大量的上皮样蜕膜细胞。这一过程在胚胎植入中对于 建立母胎界面的信息交流是非常关键的。子宫内膜的这些变化受多种因素调控。 近年来，细胞因子对着床前后子宫内膜的调节成为人们的研究热点【l 】，b m p s 家族 就是其中一种重要的细胞因子。 人类b m p 7 基因定位于2 0 号染色体上，基因全长1 2 9 3 b p ，编码含有4 31 个氨基 酸的蛋白质，b m p 7 受体属于t g f d 受体超家族的成员，是一种膜蛋白受体。b m p 7 在骨、肾、肾上腺、膀胱和脑组织以及某些骨肉瘤细胞中都有表达，其生物学功 能不只限于其诱导成骨活性，而且涉及全身许多器官的发育和形成【2 ，3 1 。目前关于 b m p 7 基因在胚胎植入过程中的作用还属未知，相关研究报道很少。研究证实 b m p 2 、b m p - 4 、b m p 7 在孕鼠子宫中的时空表达对整个妊娠过程有很重要的作用。 b m p 2 是近年来在小鼠子宫蜕膜化进程中研究的热点基因，对其基因的表达和功 能的研究已较为详细，但对b m p 家族其他成员的研究甚少，因此本实验从m r n a 和蛋白水平检测b m p 7 在妊娠小鼠子宫内膜的表达情况，并用b m p 7 重组腺病毒感 染原代培养的小鼠子宫基质细胞，观察蜕膜化进程标志物催乳素( p r o l a c t i n ，p r l ) + 表达情况，从而了解b m p 7 在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用。 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分b m p 7 在妊娠小鼠子宫内膜的表达 为了确认b m p 7 在胚胎着床后小鼠子宫中是否有表达，本文应用r t - p c r 和 免疫组织化学方法检测b m p 一7 m r n a 和蛋白在妊娠第5 8 天小鼠子宫的表达情况。 1 材料与方法 1 1 实验动物及其处理 清洁级昆明小鼠，6 8 周龄，体质量2 0 2 5 9 ，由重庆医科大学实验动物中心提 供，合格证号：s c x k ( 渝) 2 0 0 7 0 0 0 1 。选择动情前期未交配的雌鼠于傍晚按2 ： l 与雄鼠合笼，次日晨发现阴栓者记为妊娠第一天( d 1 ) 孕鼠。随机将孕鼠分为4 组，每组3 只。分别于妊娠d 5 、d 6 、d 7 、d 8 天处死小鼠取子宫组织。妊娠d 5 小 鼠处死前1 0 1 5 m i n ，需经尾静脉注射0 5 台盘蓝0 1 2 5 m l 只，以显示胚胎植入点 ( 蓝染带) ( 图1 1 ) 。妊娠d 6 、d 7 、d 8 天，小鼠胚胎着床点肉眼可见，则无需注 射台盘蓝。所有小鼠子宫经无菌p b s 洗涤3 次后，用眼科剪分离着床点及旁组织， 分别用于提取总r n a 和石蜡切片。 图1 - 1 胎盘兰显示妊娠d 5 小鼠子宫着床点 a ：着床旁点b ：着床点 f i g1 - 1i d e n t i f i c a t i o no fi m p l a n t a t i o ns i t e so nd a y5o fp r e g n a n c yb yt r y p a nb l u ed y e a ：i n t e r - i m p l a n t a t i o ns i t eb ：i m p l a n t a t i o ns i t e 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 主要试剂与仪器 1 2 1 主要试剂 无菌磷酸盐缓冲液：购自上海生工技术有限公司 t r i z o i 组织细胞总r n a 提取试剂盒：购自美国i n v i t r o g e n e 公司 p c r 相关试剂：购自成都天泰公司 琼脂糖：购自成都天泰公司 兔抗小鼠b m p 7 多克隆抗体( b a 0 6 6 5 ) ：购自武汉博士德公司 兔抗小鼠p r l 多克隆抗体( b a 0 3 8 0 ) ：购自武汉博士德公司 s p 免疫组织化学试剂盒：购自北京中杉公司 d a b 显色试剂盒：购自北京中杉公司 1 2 2 主要仪器设备 低温高速离心机 低速离心机 p c r 仪 一踟低温冰箱 琼脂糖电泳仪 凝胺教字成像钗 紫外分光光度计 电子天平 普通显微镜照相系统 一2 0 低温冰箱 1 3 实验方法 s i g m a ( 美国) h e r m l e ( 日本) b i o r a dg r a d i e n tc y c l e r ( 美国) s a n y o ( 日本) b i o r a d ( 美国) b i o r a d ( 美国) g e n e q u a n t p r o ( 美国) j a 5 0 0 3 ( 上海天平仪器厂) 0 i y m 呼u s ( 日本) s a n y o ( 日本) 1 3 1 引物设计 运用p r i m e r5 0 软件设计b m p 一7 ( n m = 0 0 7 5 5 7 ) 和内参f 3 - a c t i n ( n m = 0 0 7 3 9 3 ) 的引物序列，由t a k a r a 公司合成： 1 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 3 2 组织总r n a 提取 ( 1 ) 取1 0 0 m g 组织在盛有1 0 0 9 lt r i z o l 的匀浆器中冰上匀浆； ( 2 ) 加t r i z o l 至l m l ，混匀，室温放置5 m i n ； ( 3 ) 加氯仿2 0 0 9 l ( 1 ：5 0 0 t r i z 0 1 ) ，混匀，室温放置5 m i r a ( 4 ) 在4 c 下，1 2 0 0 0 9 离心1 5 m i n ； ( 5 ) 取上清( 4 0 0 9 l 左右) 于1 5 m l e p 管中； ( 6 ) 加入等体积异丙醇( 4 0 0 9 1 ) 混匀室温10 m i r a ( 7 ) 在4 c t ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 m i r a ( 8 ) 弃上清，保留沉淀； ( 9 ) 加冰预冷7 5 z - 醇i 0 m l ，振荡重悬沉淀物。4 0 下1 2 0 0 0 9 离心5 m i r a ( 1 0 ) 弃上清( 尽量除尽乙醇) 保留沉淀，室温干燥2 5 m i n ； ( 11 ) 溶于2 0 “ld e p c 水中，沉淀完全溶解后，一8 0 c 保存。 1 3 3r n a 纯化 ( 1 ) d n a 消化体系： c o m p o m e n t s v o l u m ( m ) 1 0 x b u l l e r d t t ( 溶于d e p c 7 7 0 ，删1 山) 5 o 1 0 重鏖垦型奎兰堡主堕茎竺兰篁笙奎 一。 一 r n a 液 3 0 d e p c 水 r n a s ei n h i b i t o r 1 0 1 5 d n a s cf r e eh 2 0 4 0 ( 2 ) r n a 抽提 1 ) 将消化液5 0 p 1 + 1 5 0 i _ t ld e p c + 2 0 0 1 t l 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 摇匀，放置； 2 ) 4 * c - f1 2 0 0 r p m 离心1 0 m i n ； 3 ) 将上清液转移至另一个e p 管中，加5 0 0 1 x l 无水乙醇+ 2 2 肛ln a a c ，混匀静置， 7 0 。c 沉淀过夜； 4 ) 4 c - f1 2 0 0r p m 离心1 5 m i n ，去上清液； 5 ) 3 5 0 斗i7 5 乙醇洗涤沉淀后，4 条件下1 2 0 0 r p m 再次离心5 m i n ，去上清液； 6 ) 用2 0 1 t ld e p c 水或甲酰胺彻底溶解沉淀物； 7 ) 测o d 2 6 0 值，稀释至l “山，- 7 0 保存备用。 1 4r t - p c r 1 4 1 逆转录根据t a k a r ab c a b e s t t m r n ap c rk i tv e r 1 1 试剂盒方法 一 c o m p o m e n t s v o l u m ( p d 一 1 0 x r tb u f f e r m g c l z ( 2 5 m m ) d n t pm i x t u r e ( 1 0 m m ) r n a s ei n h i b i t o r a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e r a n d o m9m e r s m r n a 1 2 1 o 5 加 加 皑 帖 帖 m 重壅墨型奎兰堡主婴窒竺兰丝笙奎 - - - 一一 r n a s ef r e ed h z o 3 7 5 t o t a l 10 0 s a m p l e 循环条件：3 0 。c ，1 0 m i n ；4 2 。c ，3 0 m i r a 9 9 。c ，5 m i n ；5 。c ，5 m i n ，一个循环。 1 4 2p c r 扩增 v o l u m ( 2 0 l d ) c o m p o m e n t s b m p - 7睁a c t i n 一一 d d h 2 0 1 2 1 1 1 l z l d 1 0 x b u f f e r d n t p 酶 模板 s e n s ep r i m e r 2 0 l d 2 0 l d 2 0 l d 0 1 3 i i l 1 o l d 1 0 1 d 2 0 l d 0 1 3 i l i 1 o l d 1 o l d a n t i n s ep r i m e r1 0 l d 1 o l d 一 循环条件：9 4 。c ，3 0 s e c ，5 3 5 。c ，3 0 s e c ，7 2 。c ，2 m i n ，3 0 个循环，7 2 。c 延 伸5 r a i n 。1 3 - a c t i n 除退火温度为5 5 。( 2 外，其余条件与b m p 一7 相同。 1 4 3 电泳及半定量分析 取p c r 产物5 肛l 加6 xl o a d i n gb u f f e r1 0 1 1 1 ，2 0 琼脂糖凝胶电泳，用b i o - r a d 凝胶成像系统摄像，再加q u a n t i t yo n e4 0 分析各条带密度值，b m p - 7 与1 3 - a c t i n 的相对比值即为b m p 7 相对表达量。 1 5 免疫组织化学 ( 1 ) 石蜡切片经常规脱蜡、水化； ( 2 ) 3 0 h 2 0 2 室温下处理1 5 m i n ，以消除内源性过氧化物酶的活性； ( 3 ) 3 0 t r i t o n 1 0 0 封闭1 5 m i n ，以增加膜的通透性： 1 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ( 4 ) 蒸馏水冲洗，p b s 冲洗3 次，每次5 m i n ，在p h 值为6 0 的枸橼酸缓冲液 中热修复抗原l5 m i n ： ( 5 ) 自然冷却后，p b s 冲洗3 次，每次5 m i n ； ( 6 ) 滴加5 o t h 羊血清工作封闭液，室温孵育2 0 m i r a ( 7 ) 滴加抗b m p 7 蛋白一抗工作液( 1 ：1 0 0 稀释) ，4 4 c 孵育过夜； ( 8 ) p b s 冲洗3 次，每次5 m i r a ( 9 ) 滴加生物素标记羊抗小鼠l g g 二抗工作液，室温孵育3 0 m i r a ( 1 0 ) p b s 洗3 次，每次5 m i r a ( 1 1 ) 滴加辣根酶标记链亲和素工作液，室温孵育2 0 m i n ； ( 1 2 ) p b s 洗3 次，每次5 m i n ； ( 1 3 ) d a b 显色：a 液、b 液、c 液各一滴3 1 , h 1 0 m l 水中，混匀，显色反应在 光镜下进行，直至显色充分为止； ( 1 4 ) 苏木精复染，分色、脱水、透明，中性树脂封片； ( 1 5 ) 显微镜下观察结果、拍照并图像分析。 1 6 统计处理 所有实验数据以i s 表示，采用s p s s l 5 0 软件进行单因素方差分析。两两比 较用l s d 法，p 0 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1r t p c r 产物定性与半定量分析 经2 0 琼脂糖凝胶电泳分析，b m p 7 m r n a 在d 5 。8 天孕鼠胚胎着床点和着床 旁组织均有表达( 图4 2 ) 。b m p 7 以及1 3 - a c t i n 基因的r t p c r 产物与理论长度 相一致。妊娠d 5 8 ，b m p 7m r n a 在小鼠胚胎着床点的表达逐渐升高，不同时间 两两相比，差异均有显著性( p o 0 5 ) 。妊娠各天的b m p 7m r n a 在着床旁组织 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 也有一定表达，但与着床点组织相比，其表达均显著降低( p 0 0 1 ) ( 图4 - 3 ) 。 图1 - 2 妊娠d 5 - 8 天小鼠植入位点与植入旁组织中b m p - 7 m r n a 的表迭 1 ，3 、5 ，7 分别代表d 5 、d 6 、d 7 、d 8 天的植入旁组织 2 ，4 、6 ，8 分别代表晒d 6 、d 7 、d 8 天植入点 f i g 1 - 2t h ee x p r e s s i o n so fb m p - 7m r n a i ni m p l a n t a t i o na n di n t e r - i m p l a n t a t i o ns i t e s f r o md 5 - 8o fp r e g n a n c y l a n e so f1 , 3 , 5 ，7i n d i c a t e di n t e r - i m p l a n t a t i o ns i t e so fd 5 - 8 ，r e s p e c t i v e l ya n dl a n e s2 , 4 ，6 , 8 ， 羹 萎 重 塞 1 2 1 o 0 8 0 6 o 唾 0 2 o o i m p l a n t a t i o ns i t e so fe a c hd a y d5(16由越 h 和h 单m - h 蕾曲 如叩h 瞳嘶m 图1 - 3b m p 7m r n a 在妊娠d 5 - 8 小鼠子宫组织的相对表达量p 0 o l ，同天的植入位 点与植入旁组织相比纛p o 0 5 ，植入位点组间相比 f i g 1 - 3r e l a t i v el e v e l so fb m p - 7m r n a i nt h em o u s eu t e r u so nd 5 - 8o fp r e g n a n c y ( 靠p o 0 1c o m p a r e dw i t hi n t e r - i m p l a n t a t i o ns i t ea tt h es a m ed a y ；p 0 0 5c o m p a r e da m o n g i m p l a n t a t i o ns i t e s ) z唔甘白王鼍_譬鱼呈皇_圣 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 2b m p 7 蛋白在妊娠d 5 - 8 天小鼠子宫内膜的表达情况 b m p 7 蛋白在妊娠d 5 8 小鼠子宫内膜均有表达，但表达规律不同( 图4 3 ) 。 在d 5 时，b m p 7 表达于植入胚胎周围的基质细胞( 图2 a ) ，d 6 时表达于初级蜕 膜带( 图2 b ) ，d 7 、d 8 时主要表达在次级蜕膜带以及植入位点系膜侧基质细胞( 图 2 c 、d ) 。以大鼠气管石蜡切片为阳性对照( 图2 f ) 。 i t t l 4b m p 7 蛋白在妊娠d 5 8 小鼠子宫中的表达a d 分别代表d 8 妊娠子宫横切面( 4 0 ) ， e 和f 分别为阴性( 4 0 ) 和阳性( t o o ) 对照m ：系膜侧；a m ：系膜对侧；p d z ：初级蜕膜带； s d z ：次级蜕膜带；b l ：胚泡 f i g 1 - 4e x p r e s s i o n so fb m p - 7p r o t e i ni nt h em o u s eu t e r u so nd 5 - 8o fp r e g n a n c y p a n e lat odi n d i c a t e dd 5 - 8u n t e r i n ec r o s ss e c t i o n sw i t he j 嬲n e g a t i v ea n dp o s i t i v ec o n t r o l s m ：m e s o m e t r i a lp o l e ；a m ：a n t i m e s o m e t r i a lp o l e ；p d z ：p r i m a r yd e c i d u a lz o n e ； s d z ：s e c o n d a r yd e c i d u a lz o n e ；b l ：b l a s t o c y s t 3 讨论 胚胎植入能否正常发生，一方面需要早期胚胎发育形成囊胚并获