（农产品加工及贮藏工程专业论文）利用真空冷冻干燥技术制备高效浓缩型酸奶发酵剂的研究.pdf

摘要 随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展，积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶发酵 剂，对于推动我国乳酸菌发酵剂产业化进程、促进我国发酵乳制品工业的发展，具有重 要意义。本文对优良乳酸菌种进行了分离选育和优化搭配；优化筛选出适合工业化生产 的廉价增殖培养基和冻干复合保护剂；研究y - 酸菌增殖培养、细胞浓缩分离、真空冷 冻干燥的工艺技术；初步探索了乳酸菌在冷冻干燥过程中存活的适宜条件；制备出高效 浓缩型乳酸菌混合菌种冻干发酵剂，并对冻干发酵剂在乳中的发酵活力进行了检测。 从国内外优质发酵酸奶制品或商业发酵剂中分离出的乳酸菌中，初步筛选出4 株保 加利亚乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s b u l g a r i c u s ) 和4 株嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ) ； 通过研究菌株在乳中的发酵特性及混合搭配比例，选育出发酵性能优良的1 株保加利亚 乳杆菌1 。b - d r 和l 株嗜热链球菌s t - 3 ，确定了二者在乳中混合发酵的最佳比例 为1 ：1 。 选择原料易得、价格低廉、易于分离细胞的菊芋汁培养基、番茄汁培养基、胡萝b 汁培养基，通过细胞生长试验，确定了菊芋汁培养基是保加利亚乳杆菌l b - d r 的最适 基础培养基，同时也是嗜热链球菌s t - 3 的最佳增菌培养基；嗜热链球菌s t - 3 在菊芋汁 培养基中3 7 培养1 6 h ，活菌数高达2 8 1 1 0 9 c f i d m l ；研究了在菊芋汁培养基中添加1 5 种不同营养因子对保加利亚乳杆菌l b - d r 细胞生长量的影响，结果表明：番茄汁、乳 糖、蛋白胨、碳酸钙，可显著促进保加利亚乳杆菌l b d r 的细胞生长；利用1 9 3 4 正交 试验筛选出保加利亚乳杆菌l - b d r 的最佳增菌培养基，其配比为：在菊芋汁培养基中 添加7 5 番茄汁、1 5 乳糖、1 蛋白胨、o 3 碳酸钙；在菊芋汁复合增菌培养基中保 加利亚乳杆菌l b d r 经3 7 c 培养1 6 h ，活菌数可达1 5 0 x1 0 f u m l ，较对照菊芋汁培 养基的活菌数提高2 3 9 6 倍，较实验室使用的m r s 培养基的成本可降低1 6 0 0 元吨。 研究了培养条件和营养基质对保加利亚乳杆菌l b - d r 细胞抗冷冻性的影响，结果 表明：3 7 。c 培养、培养基的起始p h 值为6 0 、对数末期或稳定初期收获菌体、保护剂 p h 值调至6 0 左右、在菊芋汁复合增菌培养基中添加1 甘油或l v e ，可显著提高保 加利亚乳杆菌l b d r 的冷冻存活率。 通过研究离心力、离心时间对乳酸菌离心损失率影响，确定了菌体细胞浓缩分离的 最适离心条件：保加利亚乳杆菌l b d r 和嗜热链球菌s t - 3 分别采用3 6 7 2 9 ( 6 0 0 0 r m i n ) 1 0 m i n 离心，杆菌和球菌的离心损失率分别降低为0 0 0 5 和0 0 2 9 。 研究了冻于厚度与干燥时间、冻干发酵剂含水量的关系，确定了冷冻干燥工艺的基 本技术参数：筛选出4 种优良冻干复合保护荆配方，冷冻干燥后，保加利亚乳杆菌l b - d r 的冻干存活率均达6 0 以上、活菌数均在l x l 0 9c f u g 以上，嗜热链球菌s t - 3 的冻干存 活率均达8 0 以上、活菌数均在1 x 1 0 9 c f u g 以上；其中，保加利亚乳杆菌l b d r 利用 ( 3 7 ) 号复合保护剂冻干后的细胞存活率达6 8 o 、活菌数达4 9 9 x 1 0 e f u g ，嗜热链球菌 s t 3 采用( 4 6 ) 号复合保护剂冻干后的细胞存活率达9 8 o 、活菌数达1 2 5 x 1 0 ”e f - u g 。 通过检测冻干发酵剂在乳中的发酵活力，结果表明：利用筛选出的4 种优良冻干复 合保护剂制成的混合菌种冻干发酵剂，活菌含量均达l x l 0 1 0e f u g 以上；发酵性能良好， 以万分之一以下的接种量进行4 2 。c 酸奶发酵，4 h 即可凝乳；其发酵的酸奶制品，酸度 达到8 0 0 t 9 0 叮、p h 值为4 5 左右，而且感官风味俱佳；接种量较传统人工发酵剂降低 1 0 0 倍以上。 本研究为高效浓缩型酸奶发酵剂在我国的推广应用提供科学依据。 关键词：乳酸菌；真空冷冻干燥；浓缩型发酵剂；酸奶；增殖培养基：保护剂；存活率 t h e s t u d y o i lp r e p a r i n g h i g h e f f e c tc o n c e n t r a t e dy o g h o u ts t a r t e rb yt h et e c h n o l o g yo f v a c u u m l y o p h i l i z a t i o n a u t h o r ：s h 舭l i j i e m a j o r ：f o o d p r o c e s sa n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g t u t o r ：t i a n h o n g - t a o ( v i c - p r o f e s s o r ) a b s t r a c t w i t ht h er a p i d l yd e v e l o p m e n to ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c ti n d u s t r y , i t so f s i g n i f i c a n tf o r p r o m o t i n gt h ei n d u s t r i a lp r o c e s so fl a c t i ca c i db a c t e r i as t a r t e r , i m p r o v i n gd e v e l o p m e n to f f e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t ；i nt h i sp a p e r , i th a si s o l a t e ds 缸a l n sa n d o p t i m i z a l i o nc o l l o c a t i o nf o r f i n el a c t i ca c i db a c t e r i a n ec h e a pe n r i c h m e n tm e d i u ms u i t e df o ri n d u s t r i a lp r o c e s s i n ga n d f r e e z e d r y i n gp r o t e c t a n tw e r es c r e e n e d n l et e c h n o l o g yo f e n r i c h m e n tc u l t u r ef o rl a c t i ca c i d b a c t e r i a 、c e l l c o n c e n h a t i o n 、l y o p h i l i z a t i o n w e l es t u d i e d t h es u i t a b l es u r v i v a lc o n d i t i o nf o r l a c t i ca c i db a c t e r i ai nt h ep r o c e s so f f r e e z e d r y i n gw e r ee x p l o r e di n i t i a l l y h i g he f f i c i e n c y c o n c e n t r a t e dl a c t i ca c i dm i x e df r e e z e d r y i n gc u l t u r ew e r ep r e p a r e d a n dt h ef e r m e n t a t i o n a c t i v i t yo ff r e e z e d r y i n gs t a r t e ri nm i l kw e r e e x a m i n e d h u n d r e d so fl a c f i ea c i db a c t e r i as t r a i n si s o l a t e df r o mf i n ey o g u r t p r o d u c t o rc o m m e r c i a l s t a r t e ri no u rc o u n t r yo ra b r o a d l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u sf o u ri s o l a t e sa n ds t r e r p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u sf o u ri s o l a t e sw e r ei n i t i a l l ys c r e e n e d b ys t u d y i n go nf e r m e n t a t i o nn a t u r ea n d m i x e d p r o p o r t i o ni nm i l k l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u sl b - d ra n ds t r e r p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s s t - 3w i t hg o o df e r m e n t a t i o nn a t u r ew e r es c r e e n e d n 玲o p t i m u m p r o p o r t i o no f t w os t r a i nf o r m i x e df e r m e n t e di nm i l ki sd e t e r m i n e da tt h er a t eo f1 ：1 j e r u s a l e ma r t i c h o k ej u i c e ( j a j ) 、t o m a t oj u i c e ( t j ) a n dc a r r o tj u i c e ( c j ) w h i c ha r ea p tt o g a i na n ds e p a r a t e b yc e l lg r o w t he x p e r i m e n t e d r e g a r d3 a 3m e d i u m a so p t i m a lb a s em e d i u m f o rl b d r a tt h es a m et i m e i ti sg o o df o rs t - 3a sw e l l “um e d i u mi n o c u l a t e dw i t hs t 3 c u l t i v a t e da t3 7 cf o r1 6 h n l eh i g h e s tc o u r t sw e r e2 8 x 1 0 9 c f u m 1 a d d i n g1 5k i n d so f d i f f e r e n tn u t r i t i o n a lf a c t o r si n 】蛐m e d i u m 脯u s e dt os t u d yt h ee f f e c t so nl b - d rc e l l g r o w t h t h er e s u l ti n d i c a t e dt j 、l a c t o s e 、p e p t o h e 、c a c 0 3 c a nh a v eas i g n i f i c a n te f f e c to n l b - d rg r o w t h 1 1 1 eo r t h o g o n a l i t yt e s tw e r eu s e dt os c r e e nt h eo p t i r e a le n r i c h m e n tm e d i u m f o rl b d r 1 1 1 ep r o p o r t i o no f m e d i u mi sj a j c o n t a i n i n g7 5 t j 、1 5 l a c t o s e 、l p e p t o n e a n d0 _ 3 c a c 0 3 丑uc o m p o u n de n r i c h m e n tm e d i u mi n o c u l a t e d 讯ml b - d rc u l t i v a t e da t 3 7 f o r1 6 h t h el i v ec o u n t sr e a c h1 5 x 1 0 9 c f u m 1 c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 1 i v ec o u n t si n 丑u w e r ei n c r e a s e db y2 3 9 3t i m e s t h ec o s ti sd e c r e a s e d 1 6 0 0 y u a n tc o m p a r e dw i t l lm r s m e d i u mu s e di nl a b t h ee f f e c t so fc u l t u r ec o n d i t i o na n dn u t r i t i o n a lm e d i u mo nr e s i s t a n tf r e e z eo fl b - d r w e r es t u d i e d ，1 1 1 er e s u l t ss h o w s ：c u l t i v a t e da t3 7 ，i n i t i a l p h a t6 0 ，c e l lg a i n i n ga tt h ee n do f l o g a r i t h ma n db e g i n n i n go fs t a b l e ，p hi np r o t e c t a n ta t6 0 ，a d d e dg l y c e r i no 1 o rv e0 0 1 c a l ld r a m a t i c a l l yi n c r e a s et h ef r e e z e d r y i n gs u r v i v a lr a t eo f l b - d r i nt h es t u d yo ft h ee f f e c to fc e i 曲 向2 血窑f o r c et i m eo i lt h el o s sr a t e so fl a c t i ca c i d b a c t e r i a , t h eo p t i m u mc e n t r i f u g a lf a c t o ro nc e l lc o n c e n t r a t i o nw e r ed e c i d e d ：c e n t r i f u g a t i n g f o rl b - d ra n ds t - 3a t3 6 7 2 9 ( 6 0 0 0 r m i n ) f o r1 0m i n t h el o s sr a t eo fl b - d ra n ds t - 3 s e p a r a t e l yw e r e d e c r e a s e dt oo 0 5 0a n d0 2 8 o t h e r e l a t i o n o f f r e e z e - d r y i n g t h i c k n e s s a n d d r y i n g t i m e 、w a t e rc o n t e n t o f f r e e z e - d r y i n g c u l t u r ew e r es t u d i e d t h eb a s i cf a c t o ro ff r e e z e - d r y i n gt e c h n o l o g yw e r ed e t e r m i n e d t h e p r e s c r i p t i o nf o r4k i n d so ff i n em i x e dp r o t e c t a n tw e r es c r e e n e d a f t e rf r e e z e d r y i n g ，t h e s u r v i v a lr a t eo fl b d ra n ds t - 3a t t a i n e da b o v e6 0 a n d8 0 r e s p e c t i v e l y t h en u m b e ro f l i v ec e l l so f t h e mw e r eo v e rl x l 0 c f u g l b - d r w i t hm i x e d p r o t e c t 【a n t ( 3 7 妁w e r ef r o z e n , t h e s u r v i v a lr a t eo fc e l lr e a c h6 8 0 t h ev i a b l ec o u n t sg e tt o4 9 9 ) ( 1 0 9 c f i g g s t - 3w i t hm i x e d p r o t e c t a n t ( 4 甜) w e r ef r o z e n ，t h es u r v i v a l r a t eo fc e l lr e a c h9 8 o ，t h ev i a b l ec o u n t sa t t a i n e d 1 2 5 1 0 1 0 c f u g 脚e x a m i n i n gt h ea c t i v i t yo ff r e e z e - d r y i n gc u l t u r e si n 挝l k ，t h er e s u l ti n d i c a t e s ：t h e m i x e df r e e z e d r y i n gc u l t u r e sw e r e p r e p a r e db y4k i n d so f f i n dc o m p o u n d p r o t e c t a n t ；w h i c h v i a b l ec o u n t sr e a c ha b o v el x l 0 1 0 c u f f g t h ef e r m e n t a t i o nn a t u r ei sb e t t e r i n o c u l a t e dw i t h 0 0 1 a n dc u l t i v a t e da t4 2 cf o r4 h t h ef e r m e n t e dd a i r ya c i d i t yc a nr e a c h 8 0 。t - - 9 0 。t p h i sa b o u t4 5 t h e y o g h u r th a sn i c ef l a v o ra n dt a s t e c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a ly o g h u r t ， i n o c u l a t i o nw e r ed e c r e a s e db y1 0 0t i m e s t h es t u d yp r o v i d eas c i e n t i f i cf o u n d a t i o nf o ra p p l i e di nh i g he f f i c i e n c yc o n c e n t r a t i o n y o g u r t s t a r t e ra n di no b r c o u n t r yp o p u l a r y 、 k e yw o r d ：l a c t o b a c i l l u s ；l y o p h i l i z a t i o n ；c o n c e n t r a t e ds t a r t e r ；y o g h u r t ；p r o l i f e r a t e dc u l t u r e ； p m t e c t a n t ；f r e e z e d r y i n gs u r v i v a l r a t e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得泣j e 壅墼太堂或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名； 止、衲彦，签字目期：形妒年g 月a 2 f 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解趣韭盛些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阅。本人授权翘j 盛些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名：止1 询痔，导师签名： 田法瞎 签字日期：山砷驴年f 月0 f 日 签字日期：扣一z 年月上日 利用真空冷冻干燥技术制备高效浓缩型酸奶发酵剂的研究 1 引言 自从2 0 世纪初俄国诺贝尔生理学和医学奖获得者梅契尼柯夫提出“酸奶长寿说”一个世纪 以来，酸奶促进人体健康的机制逐渐被人们所揭示，酸奶及乳酸菌饮料产业在世界范围内得到迅 速发展。特别是近年来，随着人民生活水平的提高和健康意识的增强，我国的酸奶及乳酸菌饮料 产量以每年2 5 甜”的速度递增。我省是国内乳业发展最快的省份之一，奶牛头数和乳制品产量已 跃居全国第3 位，乳制品消费水平在各类食品中居第2 位，其中，酸奶及乳酸菌饮料产业的发展 居乳制品产业发酵之首。这对酸奶发酵剂的品质、特性、种类提出了新的要求。 1 1 传统人工型发酵剂制备中存在的主要问题 酸奶发酵剂一般系指生产酸奶及乳酸菌饮料接种使用的保加利亚乳杆菌b u l g a r i c u s ) 和嗜 热链球菌哂t h e r m o p h i l u s ) 之培养物。发酵剂制备的技术水平和质量优劣直接影响酸奶及乳酸菌 饮料的产品质量。目前，我国酸奶发酵荆的制备技术大都停留在传统人工型发酵剂的水平，生产 方式一般需要经过菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂等工艺过程。其主要弊端是： “叫活菌含量低( 1 07 1 0 5 c 如，g ) ；接种量大( 2 3 ) ；保藏期短( 4 ，i 2 d ) ；生产工序多、周期 长；在发酵剂制备过程中，菌种经过多级扩大培养和繁衍极易退化和污染。这将直接导致酸奶 及乳酸菌饮料产品质量不稳和生产效率低下，阻碍了我国酸奶及乳酸菌饮料产业的发展。因此， 积极研制并开发商品化新型发酵荆势在必行。 1 2 酸奶发酵剂的国内外研究及应用进展 人类制作酸奶的历史可以追溯到数千年以前。据史料记载：公元前2 0 0 0 年，印度、埃及和 古希腊人已掌握了酸奶的手工制作方法：公元8 世纪土耳其语中出现“y o g h u r t ”一词，英语“酸 奶”( y o g h 叭，y o g u r t ) 的称谓由此演变而来；后来酸奶的制作方法由土耳其传播到保加利亚； 保加利亚入最早研究出一套比较完善的酸奶制作技术；之后传播到世界各地；第二次世界大战以 后酸奶风靡欧洲各国，成为大众营养保健食品。我国制作酸奶的历史也很悠久，后魏贾思勰编 著的齐民要术中记载了酸奶的制作方法；公元6 4 1 年，唐朝文成公主进藏时，已有酸奶的记 载；1 9 11 年，上海可的牛奶公司( 上海乳制品二厂的前身) 开始生产酸奶，是我国第一家机械化 生产酸奶的厂家。 随着酸奶生产技术的提高，酸奶发酵剂的制各技术也相应得到提高，酸奶发酵荆的发展大致 经历了天然型发酵剂、传统人工型发酵剂、高效浓缩型发酵剂三个阶段删。 1 2 1 天然型酸奶发酵剂 天然型酸奶发酵剂是利用原料乳中的微生物自然发酵而制成的液体发酵产物。其特点是鲫： 发酵剂中微生物区系复杂，除乳酸菌之外，还包含酵母菌等其它微生物。这一时期，人们通过经 验选择的方法，将发酵性能优良的发酵剂世代相传，除用于制作酸奶之外，还用来发酵生产干酪、 酸制奶油、乳酒等产品。但发酵条件不易控制。 河北农业大学硕士学位论文 1 2 2 传统人工型酸奶发酵剂 传统人工型酸奶发酵剂又称普通发酵剂，首先由l i s t e r 从酸奶中分离出乳酸链球菌，对其进 行了研究，随后将分离纯化的乳酸菌作为发酵剂用于发酵生产乳制品，引起了人们的广泛兴趣。 美国、丹麦和德国发表了这方面的文章。传统人工型发酵剂的特点是：菌种纯正；发酵性能较 为稳定；发酵条件易于控制：发酵产物除乳酸之外，还有一定量的风味物质及维生索和抗菌物质 等。但发酵荆制各需要经过多级扩大培养和繁衍，生产工序多、周期长，菌种容易变异退化和污 染，不能适应现代大规模酸奶及乳酸菌饮料发酵生产的要求。 1 2 3 高效浓缩型酸奶发酵剂 高效浓缩型酸奶发酵剂系指不需要经过菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂的扩 大繁殖过程而直接应用于生产的一类新型发酵剂。其主要优点是【1 _ 4 】：活菌含量高( 1 0 9 1 0 “c f u g ) ；保藏期长( 冻藏发酵剂， 9 0 d ；冻干发酵剂4 ， 1 年) ；可以直接向专业生产厂家 购买作为生产发酵剂使用；接种量较传统人工型发酵剂降低1 0 0 1 0 0 0 倍；在酸奶及发酵乳生产 中省略了发酵剂的制备工序；减少了菌种车间的投资和空间；防止了菌种的退化和污染；可使发 酵乳制品工业的劳动生产率和产品质量大大提高。 西方发达国家早在2 0 世纪初开始研究浓缩型乳酸菌发酵剂，1 9 6 3 年开始商品化生产，7 0 年 代初期开始研制真空冷冻干燥发酵剂，目前已形成一定的商业化生产规模。1 9 8 8 年，处于技术领 先水平的丹麦汉森中心实验室研制成功浓缩型冻干发酵剂，活菌含量高达1 0 9 1 0 ”c f u g 。1 9 9 4 年，丹麦汉森公司生产的浓缩型冻干发酵剂系列产品推向中国市场。目前，法国、德国和日本等 国家生产的冻干发酵剂相继进入我国市场【1 一。 我国对浓缩型乳酸菌发酵剂的研究起步较晚，1 9 9 1 年，内蒙古轻工研究所高松柏等首次发表 了高效嗜酸乳杆菌发酵荆的研究报告，作者利用缓冲盐进行了嗜酸乳杆菌的增殖培养，使培养液 中的细胞总数达到6 5 l o 弋f u m l ，再经离心分离和真空冷冻干燥制成浓缩型冻干发酵剂，活菌 含量达8 , 3 1 0 ”c f i d g 6 j ；1 9 9 5 年，黑龙江应用微生物研究所刘宇峰等在脱脂乳培养基中利用碳酸 钙作为缓冲盐进行乳酸菌的增殖培养，菌体浓度达5 6 9 x1 0 9 e f u m l ，再经离心分离和真空冷冻干 燥制成浓缩型冻干发酵剂，活菌数达4 2 1 0 ”c f u g 6 】；此外，无锡轻工业大学的吕兵等还对冻干 过程中乳酸菌保护剂的作用机理进行了研究和探索【7 】，为筛选高效保护剂提供了理论依据；随后， 在内蒙、黑龙江等地相继建立了发酵剂研究中心，研制井开发出酸奶粉和商品发酵剂。近年来， 随着发酵乳制品工业的迅猛发展，浓缩型发酵剂的研究报道陆续出现 6 - “1 ，取得了可喜的进展。 但从全国来看，还刚刚起步，基础工作仍很薄弱，与西方发达国家相比尚有很大差距，应充分利 用我国资源优势，加快发展。 1 3 高效浓缩型酸奶发酵剂的种类 高效浓缩型酸奶发酵剂根据制各工艺和保藏技术不同可分为高效浓缩型冻藏发酵剂和高效 浓缩型干燥发酵荆2 种。 2 利用真空冷冻干燥技术制备高效浓缩型酸奶发酵剂的研究 1 3 1 高效浓缩型冻藏发酵剂 高效浓缩型冻藏发酵剂系乳酸菌种经液体增殖培养，浓缩分离，与冷冻保护介质混溶，再经 冷冻，制成浓缩型冻藏发酵剂。 冷冻温度有2 0 c 、4 0 c 8 0 c 和1 9 6 c ，分别称为冷冻、低温冷冻和超低温液氮冷冻1 3 , 4 , 1 4 。 其中，超低温液氮冷冻效果最好。吕加平等人( 1 9 9 7 ) 对浓缩型冻藏发酵剂进行了2 0 。c 和一4 0 ( 2 的冻藏试验，结果表明，冻藏3 个月后，- 2 0 c 与- 4 0 c 的活菌数无显著差异，但对- 4 0 以下的低 温并未进行相应的研究。 冷冻保护介质的主要作用是：防止乳酸菌在冷冻过程中胞内冰晶的形成而造成细胞损伤或死 亡。其配方一般属于商业秘密。乔发东等人( 1 9 9 8 ) 研究发现，由甘油、脱腊乳、蔗糖、酵母膏、 蛋白胨、v c 、和谷氨酸钠组成的冷冻保护介质，可使浓缩型发酵剂在冻藏期间保持较高的活菌数 目犯1 1 。 浓缩型冻藏发酵剂在应用中，维持冷冻费用较高，运输不方便，需要配备专用冷藏车，对发 酵剂中心的依赖性过强。 1 3 2 高效浓缩型干燥发酵剂 高效浓缩型干燥发酵剂系乳酸菌种经液体增殖培养，浓缩分离，与保护介质混溶，再经一定 方式进行干燥，制成浓缩型干燥发酵剂。 干燥工艺有：真空低温干燥法、喷雾干燥法和真空冷冻干燥法( 简称：冻干法) 4 1 。其中，真 空低温干燥法和喷雾干燥法制各的浓缩型发酵荆，一般括菌含量相对偏低；而冻干法制备的浓缩 型发酵剂，不仅活菌含量高，而且保藏和运输方便，机械化程度高，便于工业化批量生产，是今 后浓缩型发酵剂的主要发展方向。 1 4 影响高效浓缩型冻干发酵剂活力及贮藏稳定性的主要因素 真空冷冻干燥简称冻干，其基本原理是z 菌体与保护介质混溶，在共溶点以下预冻，然后， 在低于三相点压力的高度真空状态下，使菌品中的冰晶升华，除去菌品中的多余水分，获得一定 含水量的干燥发酵剂 1 4 , 1 9 l 。影响高效浓缩型冻干发酵剂细胞存活率及贮藏稳定性的主要因素有： 菌种或菌株特性、营养基质、培养条件、收获期、起始细胞浓度、冻干保护介质、冷冻速度、干 燥过程、残留水分、包装形式、保藏温度等。 1 4 1 菌种或菌株特性 筛选并培育具有优良性状的乳酸菌菌种或菌株是制备高效浓缩型冻干发酵剂的基础，优良的 乳酸菌具有以下特性： ( 1 ) 产酸特性 乳酸菌代谢产生乳酸能力的大小对于酸奶的风味以及凝固状态均有极其重要的影响。乳酸可 使乳中酪蛋白胶粒中的胶体磷酸钙转变为可溶性磷酸钙，促进酸奶凝块的形成：同时，乳酸也赋 予了酸奶爽口的酸味。以2 的接种量将乳酸菡接入灭菌的复原脱脂乳中，4 2 c 发酵，凝乳时间 为3 h 左右、滴定酸度达9 5 1 0 0 。t 为宣。如果菌株产酸能力太强，将使菌体增殖的对数生长期 3 河北农业大学硕士学位论文 缩短，细胞生长量降低，还会影响发酵乳制品的风味p q 。 研究表明：保加利亚乳杆菌在乳中发酵产生1 7 1 8 的d f 一1 一乳酸，嗜热链球菌在乳中发 酵产生0 6 o 8 的h + 1 一乳酸。酸奶通常含有4 0 5 5 的q 一1 一乳酸和4 5 6 0 的l + 1 一 乳酸。b l u m e n t h a l 和h e l b l i n g 认为；d ( 一1 一乳酸和h + ) 一乳酸的比例为1 ；1 时，酸奶的品质最佳。 如果杆菌比例增高、发酵温度超过4 5 、发酵时间过长，d f 一、一乳酸含量增大，则酸奶的酸度升 高；如果球菌比例增高、发酵温度低于4 0 ( 2 、k 一乳酸含量增大，则酸奶的酸度下降。 ( 2 ) 产香特性 酸奶的风味物质主要是乳酸和羰基化合物。天然酸奶的风味与羰基化合物特别是乙醛、2 一 羟基丁酮、丁二酮有关，这些物质取决于乳酸菌在生长过程中产生的各种代谢酶，包括乙醛脱氢 酶、乙醇脱氢酶、脱氧核糖醛缩酶等，其含量因菌种、菌株不同而有差异，嗜热链球菌和保加利 亚乳杆菌产生这些物质的能力存在差别。 乙醛是酸奶风味的重要成分，它主要来自保加利亚乳杆菌在代谢过程中水解蛋白产生苏氨 酸，而苏氨酸是乙醛生成的前体物【8 0 l 。一般认为：乙醛在酸奶中的最佳风味值为2 0 m g k g 4 0 m g k g 。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌可产生微量丁二酮，但它们不分解柠檬酸，糖代谢产生 的丙酮酸是丁二酮生成的唯一前体物，酸奶中丁二酮的含量为0 8m g k g 1 5m g k g 。因此，所 选菌株应有产生这些香气物质的能力。 ( 3 ) 产生粘性物质特性 原料乳经发酵后粘稠度增加，这除了酪蛋白凝固外，主要是因为乳酸菌能产生粘性物质即胞 外粘多糖，可形成酸奶的细腻外观。 各种乳酸菌产生胞外粘多糖的种类和粘度不同，有人认为：它是由半乳糖和其他糖苷构成的 “：h o f i s b c r g e r 和d e n t a n 认为：保加利亚乳杆菌产生的粘多糖主要是由阿拉伯糖、甘露糖、葡 萄糖和果糖通过直链或支链连接构成的。 ( 4 ) 水解蛋白和脂肪特性 乳酸菌具有弱的蛋白水解性和脂肪水解性。相比之下，保加利亚乳杆菌具有较强的分解酪蛋 白能力。嗜热链球菌具有较高的肽酶活性，这些特性可提高酸奶中多肽和氨基酸含量，并促进两 者的共生。保加利亚乳杆和嗜热链球菌可分解长链的脂肪，其中杆菌分解能力高于球菌。 ( 5 ) 后熟特性 蕴株的后熟特性系指发酵乳在保藏期间的酸度变化特性。一般发酵乳在7 c 条件下，贮藏3 周，滴定酸度增加幅度应在7 5 1 0 0 t 范围内为宜。这对于保持酸奶风味十分有利。 1 4 2 乳酸菌的增殖培养 ( 1 ) 增殖培养基 获得乳酸菌大量生长的培养基是制备浓缩型发酵剂的前提。研究表明：乳酸菌对营养要求苛 刻。实验室使用的乳酸菌培养基，一般成分复杂、价格昂贵1 1 4 。适合工业化生产浓缩型发酵剂的 乳酸菌培养基必须基于原料易得、价格低廉、菌体产量高、容易浓缩分离细胞。传统的乳酸菌增 殖培养基一直采用全脂奶、脱脂奶、1 2 脱脂奶粉，但是全脂奶、脱脂奶、1 2 脱脂奶粉培养基 粘度大，菌体不易浓缩分离。乳和乳清基质混合培养基是近年来发展起来的新型增菌培养基， s l m t c h e l l ( 19 8 3 ) 研究肽化甜乳清培养基对嗜酸乳杆菌的促生长作用时发现：菌体在低固形物 利用真空冷冻干燥技术制备高效浓缩型酸奶发酵剂的研究 组分( 2 5 、5 ) 中生长的效果优于高固形物组分( 7 5 ) 剐；s l w r i g h t ( 1 9 9 2 ) 运用多元回 归分析确定了以乳清和脱脂乳为基质的最佳配方删；美国专利u s 0 0 5 0 9 8 ，7 2 1 报道了应用超滤 浓缩乳作为发酵帮培养基，其较高的缓冲能力可使乳酸菌活菌数高达2 5 1 0 c f u m l ； l p c h a m p a g n e 等( 1 9 9 1 ) 比较了保加利亚乳杆菌在乳清，酶解乳清( 经木瓜蛋白酶和胃蛋白酶 处理) 和牛乳中生长情况，结果表明：酶解乳清效果优于乳清；而牛乳和牛乳、乳清混合( 1 ：i 比例) 两组培养基差别不大明。增菌培养基除原料基质外，各种糖类( 葡萄糖、乳糖、麦芽糖等) 、 水解蛋白类( 酪蛋白水解物、胰蛋白胨等) 、氨基酸及维生素类( 酵母提取物、丝氨酸、甲硫氨 酸维生素c 等) 、缓冲盐类( 碳酸钙、磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸锌、硫酸镁、b - 磷酸甘油二钠 等) 等乳酸菌增殖因子也是增菌的关键因素。因此，根据我国国情和资源优势，积极寻求来源广 泛、经济易得的廉价原料，优化筛选适合乳酸菌大量生长的增殖培养基，是今后实现我国大规模 工业化生产浓缩型发酵剂的重要研究课题之一。 对乳酸菌的冷冻干燥试验表明【l q ：在番茄汁培养基中加入o 0 1 吐温8 0 和油酸，可改善细 胞活性，增加菌体细胞膜不饱和脂肪酸( c 1 9 环丙烯脂肪酸) 含量。提高乳酸菌在冻干过程中的 存活率；在营养肉汤培养基中添加o 0 0 6 m o f l 的c 矿，可促进乳杆菌形成短棒状形态，提高对干 燥的抵抗力。上述研究结果可望对高效浓缩型冻干发酵剂的制备提供参考。 ( 2 ) 控制混合培养中杆菌和球菌的增殖比例 保加利亚乳杆菌和嘈热链球菌混合培养时具有共生效应。这是由于保加利亚乳杆菌分解蛋白 质产生的氨基酸( 主要是丝氨酸) 可促进嗜热链球菌的生长；而嗜热链球菌通过丙酮酸代谢产生 甲酸可促进保加利亚乳杆菌的生长1 1 5 , 1 6 。两菌的发酵特性对发酵乳制品的品质影响也不尽相同， 一般来说，保加利亚乳杆菌对发酵乳制品中有机酸的形成起主导作用；而嗜热链球菌在发酵过程 中，除进行产酸代谢外，还产生2 ，3 一丁二酮( 双乙酰) 等发酵乳制品特有的风味物质” ”j 。因 此，在发酵剂的制各中，杆菌和球菌的混合比例对酸奶品质影响很大。常见的杆菌和球菌的混台 比例为1 ：1 或l ：2 i l ”。然而。我们在实际研究工作中发现，杆菌和球菌混合培养时，球菌的比例 往往逐渐减小，说明球菌的生长繁殖能力相对弱于杆菌。所以，如何促进混合培养中球菌的生长， 控制杆菌和球菌特定的增殖比例，是制备浓缩型乳酸菌发酵剂中混合培养技术的一个关键因素。 研究表明，适当减小接种蠡和降低培养温度，有利于混合培养中嘈热链球菌的生长；培养前 期，嗜热链球菌生长旺盛，培养后期，保加利噩乳杆菌生长旺盛i 1 0 1 “。目前，某些研究者还对不 同营养物质促进嗜热链球菌的生长进行了研究。吕加平等人( 1 9 9 9 ) 试验表明，由酪蛋白水解物、 乳糖、番茄汁、b 磷酸甘油二钠组成的培养基，3 7 c 培养2 4 h ，嗜热链球菌活菌数可达5 7 6 1 0 9 c f u m l ：张兰威等人( 1 9 9 9 ) 研究发现，2 5 啤酒液可显著促进嗜热链球菌在乳清培养基中 混合培养的生长日】；张兰威等人( 2 0 0 0 ) 在含有蛋白酶的脱脂乳培养基中加入麦芽汁、番茄汁、 c a c 0 3 后，促进嗜热链球菌增殖的效果十分明显【l j ：田洪涛等人( 2 0 0 1 ) 研究表明，在m r s 培 养基中添加o 3 玉米浆、7 5 番茄汁、5 0 啤酒液、1 0 乳糖后，经3 7 培养2 4 h ，嗜热链球 菌的活菌数较对照培养基提高了4 0 倍【1 2 1 。可见，对于促进嗜热链球菌生长、保持混合培养中杆 菌和球菌比例平衡的问题已经开始受到关注。然而，在这方面的研究中，如何利用廉价原料，降 低培养基成本，仍有待继续深入。 ( 3 ) 浓缩培养的方法 制各浓缩型乳酸菌发酵剂，需要获得高浓度的细胞培养物；因此，必须对乳酸菌进行浓缩培 河北农业大学硕士学位论文 养。浓缩培养的基本原理是：在乳酸菌培养过程中，通过追加营养物质、排除代谢产物、调节p h 值等措施，解除代谢产物一乳酸对细胞生长的抑制作用。延长乳酸菌的对数生长期，获得高浓 度的细胞培养物。目前，国内外浓缩培养乳酸菌的方法有以下几种p “1 a 化学中和法；在乳酸菌培养过程中自动向培养液中添加n a o h 或n i - 1 3 h 2 0 等碱类物质，不断 中和乳酸菌产生的乳酸，促进乳酸菌和大量繁殖。 缓冲盐法：向乳酸菌的培养液中加入缓冲盐，调节培养液的酸度在一定范围内不升高，促进乳 酸菌生长繁殖。 膜渗析法：向乳酸菌的培养液中不断添加营养物质，代谢产物通过膜而除去，促使乳酸菌生长 繁殖。 在上述浓缩培养乳酸菌的方法中，膜渗析法是目前国内外最先进的方法，但该法对膜材料和 操作技术耍求较高，而化学中和法和缓冲盐法的研究及应用相对普遍。在缓冲盐法浓缩培养研究 领域中，美国和意大利处于领先水平，但其缓冲盐配方属于专利保密。t i n e k e h 等人( 1 9 9 0 ) 曾 用2 0 2 9 的超滤浓缩奶和脱脂乳作为培养液，利用高浓度的蛋白和磷酸盐达到缓冲效果1 4 ； 我国高松柏等人( 1 9 9 1 ) 曾在5 脱脂乳水解液培养基中和1 2 脱脂乳培养基中分别加入缓冲盐 a 和缓冲盐b ，4 0 c 培养8 h 和6 h ，乳酸菌活菌数分别达到2 2 x 1 0 f u m l 和6 5 1 0 9 c f u m l ， 是不加缓冲盐培养基的3 倍和6 倍p 】：吕兵等人( 2 0 0 1 ) 在含有0 3 酵母膏、o 1 吐温8 0 的1 2 脱脂乳培养基中，加入0 5 k z h t k ) 4 作为缓冲盐，4 2 ( 3 培养4 h 。乳酸菌活菌数达到2 9 5 x 1 0 9 c f u m l ，是起始培养基的2 倍以上，在此基础上，添加3 0 n a 2 c 0 3 作为中和剂，控制基质p h 值为6 3 ，4 2 ( 2 培养6 h ，乳酸菌活菌数达到5 8 9 xi 0 9 c f u m l ，较起始培养基的活菌数提商4 5 倍 1 0 1 。由此看出，利用缓冲盐法和化学中和法进行乳酸菌的浓缩培养，菌体的增殖效果显而易见。 今后，尚应对适合培养乳酸菌不同原料的中和剂和缓冲盐配方进行积极研究。 ( 4 ) 培养条件 对乳酸菌的冷冻干燥试验表明f 1 8 1 ：培养温度诧最适温度低1 0