（环境科学专业论文）光散射技术在食品安全检测及生化药物分析中的应用.pdf

西南大学硕士学位论文 摘要 散射增强更加明显。因此，可以推断，配合物与d n a 的作用主要是通过t 碱基进行结合的。 也就是说，通过实验我们进一步找到了配合物与d n a 的结合位点，这对于基因诊断及分析具 有非常重要的意义。 关键词：共振光散射等离子共振光散射苏丹红肝素碳纳米管 i i 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a p p l i c a t i o n so fl i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e i na n a l y s i so ff o o d s e c u r i t ya n d b i o c h e m i c a l m e d i c a m e n t m a j o r e n v i r o n m e n t a ls c i e n c em a s t e rc a n d i d a t e l i p i n gw u s u p e r v i s o rp r o f c h e n g z h ih u a n g a b s t r a c t r l st e c h n i q u ea t t r a c t e da t t e n t i o na n dd e v e l o p e dr a p i d l yd u et oh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l e m a n i p u l a t i o na n dc o n v e n i e n te x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s n o w , r l sh a sb e e nas t r o n ga n de f f e c t i v e t e c h n i q u e i n a n a l y t i c l ec h e m i s t r y i nt h i sp a p e r , w eq u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l yd e t e c t e n v i r o n m e n t a lh e a v ym e t a li o na g + a n dc a r c i n o g e ns u d a ni nf o o dp r o d u c t i o nw i t hp l a s m o n r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( p p l s ) s i g n a l s ，d e t e r m i n eb i o c h e m i c a ld r u gh e p a r i n ，a n ds t u d yt h e s e l e c t i v ei d e n t i f i c a t i o no ftb a s eb yc o ( i oa n d5 - c i - p a d a b ，a n da n a l y s et h ep o s i t i v ee f f e c to f c a r b o nn a n o t u b e ( c n t ) ，w h i c hc a r lp r o v i d eu s e f u li n f o r m a t i o ni nt h e o r ya n de x p e r i m e n tr e s e a r c h o fa p p l i c a t i o n si nc l i n i c a ld i a g n o s i s ，e n v i r o n m e n ts c i e n c e ，f o o di n d u s t r y , e t c t h em a i nc o n t e n ti sa s f o l l o w s ：。 ( 1 ) an o v e lm e t h o do fd e t e c t i n gs u d a nb a s e do nt h ef o r m a t i o no fs i l v e rn a n o p a r t i c l e so 岬s ) i n f o n dp r o d u c t si sr e p o s e d s u d a ni ，i i ，i i ia n di vh a v er e d u c i b i l i t yd u et ot h ef u n c t i o n a lg r o u p so f n i t r o g e n - n i t r o g a nd o u b l eb o n da n dh y d r o x i d e ，a n do x i d a t i o n - r e d u c t i o n ( o x - r e d ) r e a c t i o nc o u l d o c c u ru s i n ga g n 0 3 ，f o r m i n gs i l v e rn a n o p a r t i c l c s c o l o rc h a n g e so fs u d a nc o u l d b eo b s e r v e df r o m r e dt ob r o w nd u r i n gt h eo x r e dr e a c t i o n s , r e s u l t i n gi ng r e a t l yp l a s m o nr e s o n a l l c el i c i ts c a t t e r i n g ( p r l s ) s i g n a l sc h a r a c t e r i z e da t4 5 2n n lt h ep r l s i n t e n s i t i e sa r ei np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o n s o v e rt h er a n g eo f 0 2 2 4p a n o l ls u d a ni ，o 1 - 2 4i x m o l ls u d a ni i ，0 1 - 2 4p a n o l ls u d a n1 1 1a n d 0 2 - 3 0l a m o l ls u d a ni v , w i t ht h ec o r r e s p o n d i n gl i m i t so fd e t e r m i n a t i o n ( 3 0 ) o f3 2n m o l l ，3 0 n m o l l ，3 2n m o l la n d2 9n m o l l ，r e s p e c t i v e l y u s i n gh o tc h i l ia sam o d e le x a m p l e ，d e t e c t i o n s c o u l d b em a d ew i t ht h er e c o v e r yo f 9 0 8 1 0 3 3 a n dr s do f 4 o _ 4 9 a n dt h er e s u l t sa r ei d e n t i c a l w i t ht h a to fh p l c m e c h a n i s mi n v e s t i g a t i o n ss h o wt h a tt h ef u n c t i o n a lg r o u po fs u d a no x i d i z e db y a g n 0 3i st h eh y d r o x i d e ，n o tt h ef u n c t i o n a lg r o u p so f n i t r o g e n - n i t r o g e nd o u b l eb o n d ( 2 ) h e p a r i ni s ak i n do fa m y l o s e ，a n dt h em a i nm e d i c a lf u n c t i o n sa r ea n t i - c m o r , r e s t r a i n i n g 1 1 1 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t b l o o dp l a t e l e t ，c o n t r o l l i n gb l o o dw e s s e lr e b i r t h , r e g u l a t i n gb l o o dg r e a s e ，a n t i i n f l a m m a t i o n , a n t i - h y p e r s u s c e p t i b i l i t y , e t c u n d e rt h eb a s i cc o n d i t i o no f0 0 4 2m o l ln a o h c o ( n ) a n d5 - c 1 一p a d a b c a l lc o m b i n et op r o d u c eac o o r d i n a t i o nc o m p o n dw i t hp o s i t i v ec h a r g e ，w h i c hc o u l d b ec o m b i n e db y h e p a r i nw i t hn e g a t i v ec h a r g ev i ae l e c t r o s t a t i cp r o c e s s ，r e s u l t i n gi ne n h a n c e dr e s o n a l l c el i g h t s c a t t e r i n g ( r t s ) s i g n a l sc h a r a c t e r i z e da t 5 5 0n n l r l si n t e n s i t yi si np r o p o n i o nt ot h e c o n c e n t r a t i o n so f h e p a r i n t h u s ，am e t h o dt od e t e c th e p a r i ni sc o n s t r u c t e d ( 3 ) w o r k i n gs o l u t i o n so f a 6 、g 6 、c 6 、t 6 w e r er e p e c t i v e l ya d d e di n t ot h ec o m p l e xo f c o ( i i ) a n d 5 - c 1 - p a d a bu n d e rb a s i cc o n d i t i o n i ts h o w st h a tr l sc h a n g e sa r ed i f f e r e n t r l si n t e n s i f i e sn e a r l y r e i t l a h l t h es a m e w h e na 6 、g 6 、c 6 w e r ea d d e d , w h i l e ，e n h a n c e d o b v i o u s l y b y t t a n d e n h a n c e d m o r e o b v i o u s l yw h e nm ：、) v n t sd i s p e r s e ds o l u t i o ni sa d d e d t h u s ，w ec a nd e d u c et h a td n aa n dt h e c o m p l e xc o m b i n ev i atb a s e ，w h i c hi si m p o r t a n tf o rg e n ed i a g n o s ea n da n a l y s i s k e y w o r d s ：r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ；p l a s m o nr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ； s u d a n ；h e p a r i n ；c a r b o nn a n o t u b e i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：弓臂丽焉签字日期：) 铡7 年z 月 日 学位论文作者：1 氏船佴 签字日期：) 铡年g 月 日 l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签垄：易弋丽净 导师签名： 签字日期：歹一7 年f 月1 日。签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 2 日 邮编： 西南大学硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 光散射简述 光散射是一种十分常见的现象，它广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当 光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。光散射与介质 的不均匀性有关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性，从而产 生散射光。 根据不同的标准可以将散射进行不同的分类。根据入射光的波长和散射粒子 大小的关系，可以分为折射和反射、丁达尔散射、分子散射；根据入射光的波长 和散射波长的关系，可以分为弹性散射( 也称经典光散射或静态散射) 、准弹性散 射( 也称动态光散射) 、非弹性散射；根据信号检测的方向，可以分为前向散射、 直角散射、后向散射。 散射光在荧光分析中常作为一种干扰而被消除，共振光散射从它被预见到真 正第一次发现并利用经历t 4 1 年【。1 9 9 3 年，p a s t e m a c k 等【2 】用普通荧光光度计通过 匹配激发和发散单色器并进行同时扫描获得了反式一双( 一甲基吡啶铃一4 一 基1 2 一二苯卟吩及其c u 2 + 的衍生物在d n a 上的腰! 堆积，以及新合成的金属嵌合 剂与小牛胸腺d n a 作用的光散射信号，从而建立了共振光散射( r l s ) 技术，首 次将光散射技术和化学过程成功地联系在一起，并将其用于生物大分子的识别、 组装和聚集研究。之后，光散射技术就被广泛用于化学【3 叫、生物1 7 期、物理【9 】等领 域。目前，就研究对象而言，共振光散射技术已经广泛的应用于糖类和药物分析 1 0 - 1 6 l 、蛋白质分析 1 7 - 3 3 】、核酸分析f 3 4 - 5 0 、无机金属离子分析 5 1 - 5 7 】、纳米粒子 5 8 - 5 9 】 等的研究中；就技术领域而言，共振光散射得到了进一步地拓展，建立了许多新 的r l s 技术，如后向共振光散射( b r l s ) 技术唧- 6 2 1 、流动注射一共振光散射 ( f i a - r l s ) 技术【6 3 1 、光散射比率分析技术棒蛔、液一液界面全内反射一共振光散射 ( t i r - r l s ) 技术【6 7 - 6 9 、三维光散射技术1 7 0 、共振光散射成像技术1 7 1 - 7 2 1 等。 共振光散射技术因其灵敏度好、实验仪器简单、检测方便等优点而倍受化学 研究者青睐，也因而得到飞速的发展，目前，共振光散射技术己成为分析化学领 域中强有力的分析技术。 1 2 等离子共振光散射的基本原理和应用 1 2 1 等离子共振光散射的基本原理： 电磁波照射到一个金属纳米粒子上时，金属中的电子( 等离子体子) 就以与 入射光相同的频率振动( 等离子共振) 。随后，振动电子以相同的频率发射电磁波。 西南大学硕士学位论文第一章绪论 这个辐射的光通常就是指等离子共振光散射i ”。4 j 。 当一小颗粒置于电磁波中时，那么颗粒中的所有电子就会处于入射波的相同 相位( p h a s e ) ，实际上，整个颗粒就相当于一个大的共振偶极( o s c i l l a t i n gd i p o l e ， 可看作是聚集了的电子共振子) 。对于更大的颗粒，其中的电子就会处于电磁波的 不同相位，必然会导致颗粒中不同位置的电子所散射的光发生干涉，随之产生共 振四极( q u a d r u p o l e s ) ，甚至多极( m u l t i p o l e s ) 。 小的球形金属纳米粒子被光照射时，电磁波就会使金属中的电子密度分布不 均匀。当电子密度低于平均密度，便形成局部正电荷过高，这样，就会把邻近的 电子吸引过来；而逐渐地，该区域就会有过多的负电荷，由于电子间的排斥作用 又会使之再度离开i 巧】。也就是，当电子云振动相对偏离中心核位置时，由于库仑 吸引就会产生一个回复力，使电子云回到原来位置；而核位置电子云过剩时，库 仑排斥又会使电子云偏离中心核位置。如此往复，便产生了等离子共振【7 3 l ，如下 图所示： 图1 1 球形粒子的等离子共振示意图 ( a d o p t e df r o m j p h y s c h e m b2 0 0 3 ，1 0 7 ，6 6 8 ，) 1 2 2 等离子共振光散射的应用： 1 2 2 1 理论研究方面 图1 - 2 氢还原法制备的银纳米粒子的s t e m 示意图 ( a d o p t e df r o m j a m c h e ms o c 2 0 0 5 ，1 2 7 ，1 2 4 4 4 ) 银纳米粒子的合成是在高温高压下用超纯的氢气还原饱和的银的氧化物溶液 2 西南大学硕士学位论文第一章绪论 ( 氢还原法) ，通过催化还原产生“银种”，然后逐渐长大，这个反应可以很方便地 在任何阶段被终止，因此可以制得大小不同的银纳米颗粒。制得的纳米粒子是均 匀的十二面颗粒( 也有少部分的被拉长的颗粒存在) 1 7 6 1 。 一般来讲，对于球形的银纳米粒子，在1 0 - 5 0 h i l l 范围内，产生偶极共振。5 0 - 1 5 0 i l i t i 的粒子，产生四极共振。对于更大的粒子，则可能发生多极共振。 图1 - 3 不同粒径大小银纳米粒子的消光光谱图 ( a d o p t e dt i m a m c h e m s o e 2 0 0 5 ，1 2 7 ，1 2 4 4 4 ) 颗粒的大小用紫外可见消光光谱进行检测。在反应开始阶段，由于粒子很小， 就在4 2 0n m 初产生一个偶极等离子共振，随着粒径的增大，偶极等离子共振逐渐 红移；当粒子增大到9 0n n l 大小时，偶极等离子共振已经红移到4 9 0h i l l ，同时， 在4 2 0 n l n 处出现了明显的四极等离子共振峰，同样，偶极和四极等离子共振仍随 粒子粒径的增大而红移；当粒子增大到1 7 0a m 大小时，偶极和四极峰分别移动到 了6 3 0 和4 7 0i l i a ，且一个新的八极等离子共振出现在4 3 0n l n 处。以此类推。 1 2 2 2 实际应用方面 在我们的周围存在着种类繁多、数量庞大的微生物，包括各种细菌，而很多 病菌的存在威胁着人类健康。因此，快速、灵敏测定和识别致病菌，对于食品及 饮水安全、医疗诊断和治疗、水质污染等是非常重要的。 目前，检测病菌的方法很多，而利用金属纳米粒子的等离子吸收和等离子共 振散射检测的方法，以其快速灵敏而见长。例如，下面这种方法就可以检测一种 蛋白质链锁状球菌7 7 1 。先用结合了生物素的b s a 包被纳米金，然后加入一种蛋白 质链锁状球菌( s t r e p t a v i d i n ) 。由于s t r e p t a v i d i n 和生物素可以特异性结合，这样， 被包被的纳米金就可以发生聚集。 西南大学硕士学位论文 第一章绪论 图1 4 基于等离子共振光散射检测链锁状球菌示意图 ( a d o p t e df r o m ，a m c h e m s o e 2 0 0 5 ，1 2 7 , 1 2 11 5 ) o 季 s 8 。o7 w a v e l e n g t hii l m 图1 - 5 吸收光谱变化情况 ( a d o p t e df r o m z a m c h e r as o e 2 0 0 5 ，1 2 7 ，1 2 11 5 ，) 加入的s t r c p t a v i d i n 浓度越大，形成的聚集体就越大，致使等离子吸收光谱发 生红移，如下图所示。 1 3 纳米材料的应用 1 3 1 金属纳米粒子的应用 纳米技术是2 1 世纪非常前沿的新兴技术。纳米粒子( 1 - 1 0 0r i m ) ，具有尺寸效应、 体积效应、表面效应和宏观量子隧道效应，与普通大颗粒材料相比，呈现出许多 特有的物理、化学性质7 ”9 】，如热、电、光、磁等，因此，近年来已成为物理、 4 晒鹪 傅eo晦直詈葛pcoz 西南大学硕士学位论文第一章绪论 化学、材料等学科研究的重点领域 s o - s tj ，显示了广阔的应用i ；仃景。目前，纳米技 术已广泛用于生物、医疗、药物、化工、能源、信息等方面，具有巨大的应用潜 力。 金属纳米粒子( n p s ) 由于其不同于普通金属的光学和电化学性质，而倍受人 们关注【8 2 1 。重要的是，由于等离子吸收和散射8 3 - 8 4 ，其悬浮液显现出光亮的颜色， 正是这样，金属纳米粒子在光学传感器的发展f 8 确9 】、d n a 杂交的检测唰、单碱基 错配f 9 l 】、蛋白质折叠【9 2 1 及其与适配体形成的复合物【9 3 】的研究等领域有着广泛和潜 在的用途。 继放射标记物、酶标记物和荧光标记物之后，金纳米粒子已经在分子生物学 和临床医学中，成为第四大标记物并具有其独特的优点 9 4 1 。金纳米粒子所发射的 光散射强度是一个荧光分子所发射出的荧光强度的1 0 5 倍，可以在生物和芯片领域 作为荧光类似物和示踪标记的作用 9 5 - 9 8 】。 通常情况下，直径5 2 0n r f l 的金纳米粒子因其等离子共振而在5 2 0r n t l 存在一 个特征吸收峰嗍，当粒子因条件改变发生聚集时，该峰就会发生红移，且溶液由 红变紫“o o 。利用这个原理，金纳米粒子已经成功用于d n a 1 0 1 - 1 0 4 、重金属离予1 0 5 1 、 钾离子【1 雏1 伪1 、蛋白a 【1 0 9 1 等的检测中。 将两种不同的单链d n a ( 靶物d n a 和探针d n a ) 修饰到金纳米粒子上，如 果靶物d n a 和探针d n a 完全互补，二者在合适条件下就会杂交使得金纳米粒子 发生聚集，导致等离子吸收带红移，从而达到检测靶物d n a 的目的【1 1 们。 w a v e l e n g l h ，n m 图1 - 6 0 5m n a c l 浓度下的消光光谱图 ( a d o p t e df r o m j a mc h e m 勋c2 0 0 3 ，1 2 5 ，8 1 0 2 ) 银纳米粒子在表面增强拉曼光谱、共振散射光谱、分子生物学、超分子体系 西南大学硕士学位论文第一章绪论 等研究领域占有极为重要的地位【4 1 2 】，由于其诸多的应用使银纳米粒子的制备变 得尤为重要目前，银纳米粒子的制备方法主要有化学还原法、沉积法、电极法、 蒸镀法、机械研磨法等【1 l3 1 ，其中化学还原法因为所需实验条件简单、节能而得到 很好应用1 1 1 ”1 ，最为常见的就是柠檬酸钠还原法，即在不断搅拌热的硝酸银溶液 的同时，加入柠檬酸三钠，还原银离子为银纳米粒子。这类方法虽然简单，但得到 的胶体稳定性不好，常伴有黑色大颗粒沉淀形成。因此，仍需要继续研究新的制备 方法，使其稳定性得以进一步改善。此外，对银纳米粒子的表征也是分析科学工 作者面临的重要任纠纠1 7 1 ，目前主要的表征手段有等离子吸收、共振光散射、扫 描电镜和透射电镜、共振瑞利散射【1 1 8 1 1 1 9 】等。 图l 一74 - m b a i 撒曼光谱( a ) 和在p h1 2 3 ( b ) 及p h5 0 ( c ) 下结合了银纳米粒子 的4 - m b a 的s e r s 光谱( a d o p t e df r o m a n a lc h e m2 0 0 4 ，7 6 ，7 0 6 4 ) 6 西南大学硕士学位论文第一章绪论 利用表面增强拉曼散射( s e r s ) 性质制作纳米级的p h 传感器【1 2 0 ，就是应用银纳 米粒子特性的一个成功例子。用4 一巯基苯甲酸修饰的银纳米粒子对p h 范围在6 8 时 非常敏感，且有特征响应。如上图所示，a 是4 巯基苯甲酸( 4 m b a ) 的拉曼散射光 谱，b 和c 分别是在高p h 和低p h 值下被4 。巯基苯甲酸修饰的银纳米粒子的拉曼散射 光谱。其中，在1 4 3 0 c l n 的c 0 0 的伸缩振动峰与粒子周围的p h 环境有直接关系， 当p h 降低时，该伸缩振动峰减弱。 金属纳米粒子因其特殊的性质而具有广阔的应用前景和价值，仍是一个独具 魅力的研究领域。 1 3 2 碳纳米管的应用 碳纳米管是由片状的石墨卷成的中空同轴圆柱体，它的直径可以从几埃到几 十纳米，长度可达几毫米。根据碳纳米管中碳六边形沿轴向的不同取向，可以将 碳纳米管分为扶手椅型、锯齿型和螺旋型( 又称手性) 三种；根据碳纳米管的层 数不同，又可将其可分为单壁碳纳米管( s i n g l e - w a l l e dc a r b o n n a n o m b e ，s w n t ) 和多 壁碳纳米管( m u l t i - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e ，m w n t ) 两种，单壁碳纳米管是由单层石 墨卷曲而成，管径很细，如典型的单壁碳纳米管直径约1 4n m 左右；多壁碳纳米管 是由多层( 几层到几十层) 石墨卷曲而成片间距离是0 3 4 - 0 4 0 n i n ，直径多分布在 1 0 2 0 n n l 的同心圆结构。自从1 9 9 1 年，碳纳米管被发现以来【1 2 1 l ，它就逐渐成为世 界各国研究的热点之一，引起了广泛的关注【1 2 2 加3 1 。 碳纳米管中的碳原予主要是通过s p 2 杂化而成，可形成高度离域化的大7 c 键共轭 体系，这就决定了它可以和其他冗电子体系发生兀兀共轭作用，形成非共价键结合 的复合物1 2 4 。1 2 7 1 。 但是，碳纳米管不溶于常规溶剂，如水、有机溶剂等，很难分散，因此，在 很大程度上制约了其应用研究。近年来，科学家对碳纳米管进行化学修饰或在强 氧化性酸溶液中通过超声将碳纳米管切断【1 2 弘”们，使其在某些特定溶液中的分散度 得到显著地改善，为碳纳米管的进一步深化研究提供了更为有利的条件和前提。 在碳纳米管的功能化研究中，l i u 等1 1 3 1 】首先将单壁碳纳米管用混酸”切割”得到 1 0 0 - 3 0 0t l l n 的短管，接着用体积比为4 ：1 的浓硫酸和3 0 的过氧化氢溶液氧化，得 到带负电荷的羧基化的s w n t s 。h a m o n 等【1 3 2 4 3 3 1 在此基础上把羧基化的s w n t s 用 二氯亚砜处理，再与长链烷基胺反应得到可溶性的s w n t s 。碳纳米管的分散性的 改善为碳纳米管的分离提纯和应用提供了便利的条件。 由于碳纳米管具有特殊的结构、电学、化学等性质，它已经广泛用于能源、 物理、化学、材料等众多领域，如：场发射器俐】、锂离子电池【1 3 5 1 、超级电容器 0 3 6 、超强复合材料 1 3 7 等。但是，碳纳米管在光谱学中的应用仍很少见，在该方面 7 西南大学硕士学位论文第一章绪论 仍有很大的突破和发展空间。 1 4 本文拟达到的目的、意义及主要研究内容 研究的目的和意义： ( 1 ) 将纳米技术与共振光散射技术相结合，进一步深化了共振光散射的应用。例如， 基于银纳米粒子的特殊性质，主要是等离子吸收和等离子共振方面的特性，用 共振光散射技术对其进行表征。由于等离子吸收和共振散射，银纳米粒子的悬 浮液显现出光亮的颜色，而在碱性介质中苏丹红可以与硝酸银发生氧化还原反 应，生成银纳米粒子，通过溶液颜色的变化和等离子共振光散射信号的分析即 可实现对苏丹红的定性定量检测。本方法克服了高效液相色谱法仪器昂贵、操 作不便的不足，对实际检测更加方便快捷。 ( 2 ) 利用共振光散射技术对肝素进行表征。以共振光散射信号为手段，实现了对生 物大分子药物肝素的快速定量检测，灵敏度高，检测有效。 ( 3 ) 利用共振光散射技术对t 碱基进行选择性识别，并拓展碳纳米管的实际应用， 使其在光散射分析中的价值得以更多体现。碳纳米管在电化学分析中应用甚 广，而在光谱分析中则不为多见。本文将碳纳米管进行分散，并利用共振光散 射光谱，初步探讨了其对化学反应的影响。 主要的研究内容： ( 1 ) 偶氮染料苏丹红与环境重金属污染物银离子相互作用的研究。对致癌物质苏丹 红进行定性及定量的检测，又利用激光笔和l e d 照射反应溶液，通过肉眼观察 等离子散射光的强弱来半定量的检测苏丹红，对实际样品的检测方便快捷有 效。 ( 2 ) 共振光散射技术对生物大分子分析的应用研究。利用共振光散射技术测定生物 大分子药物肝素，灵敏度高，方法简便。 ( 3 ) c o ( i i ) 与5 c i p a d a b 对t 碱基的选择性识别，并分析了m w n t s 分散液的积极影 响。c o ( n ) 与5 c 1 一p a d a b 形成的配合物，在碱性条件下分别与& 、g 6 、c 6 、t 6 反应，测得反应后的共振光散射强度只与t 6 反应后才增强。从而得出，配合物 与d n a 反应的结合位点就是t 碱基。 西南大学硕士毕业论文第二章基于银纳米粒子的等离子共振光散射法可视化检测苏丹红 第二章基于银纳米粒子的等离子共振光散射法 可视化检测苏丹红 2 1 引言 金属纳米粒子( n p s ) 由于其不同于普通金属的光学和电化学性质，倍受人们 关注【”。由于等离子吸收和散射【2 埘，其悬浮液显现出光亮的颜色，因此，金属纳 米粒子在光学传感器的发展【4 8 】、d n a 杂交的检n t g j 、单碱基错配【1 0 l 、蛋白质折叠 【l i 】及其与适配体形成复合物【1 2 】的研究等领域有着广泛和潜在的用途。 等离子吸收和散射性质与金属粒子中的电子振荡有关。当一束光照射到金属 纳米粒子上时，其中的电子就会发生共振，称其为等离子共振粒子【1 3 i ，同时，共 振电子以与入射光相同的频率发射电磁波，金属纳米粒子通常也被称之为等离子 共振子1 1 3 】。振荡频率与电子密度、有效电子数及电荷分布的形态等因素有关 1 4 - 1 5 】。 通常情况下，当粒子粒径小于入射光波长时，就会发生偶极等离子共振；而随着 粒子粒径的增大，四极或更高极的共振便会发生【l “。以金属粒子为例，银纳米粒 子由于等离子吸收在可见光区表现出一定的光学特性。事实上，单独的银纳米粒 子可以与一个光子发生作用，且比同粒径大小的其它任何粒子都有效，这使得银 纳米粒子在光学应用方面更加具有吸引力【1 ”。我们期望可以用普通的荧光光度仪 来检测由等离子共振产生的光散射信号，为此，我们提出了利用检测到的等离子 共振光散射( p r l s ) 信号来测定食品中苏丹红的方法，并将其可视化。 苏丹红i 、和i v ( 分子结构示于图2 - 1 ) ，是一系列人工偶氮染料，通 常用于油染、印刷、蜡染、塑料等行业【1 8 9 1 ，因为其亮丽的色彩可以改善产品外 观。苏丹红禁止用于食品行业中，因为它被国际癌症研究机构( i a r c ) 1 2 0 】列为致 癌物质之一，有证据证明苏丹红i 具有潜在致癌性，它可以在体内和某一给定d n a 序列发生反应从而破坏基因物质，主要的反应产物经鉴定为8 ( 苯基偶氮) 鸟嘌呤加 合物【2 l i 。此外，苏丹红i 及其羟基化代谢物都可以被过氧化物氧化，生成d n a 、 r n a 、蛋白的加合物 2 2 - 2 3 l 。 然而，世界上部分地区的辣椒制品中已经被检验出含有苏丹红染料，尤其是 苏丹红i ，这对人类健康是极为有害的。在2 0 0 3 年5 月，法国食品权威机构( a f f s a ) 检验到从印度进口的辣椒粉中含有苏丹红i 【2 4 1 。在中国，某些食品中也发现含有苏 丹红i ，如烤鸡翅、辣泡菜、辣椒酱等。 目前，检测苏丹红的标准方法是欧盟公布的高效液相色谱法【2 5 】，其它一些方 法也在用，包括h p l c u v 【2 6 1 、h p l c a p c i m s l 2 7 1 、h p l c d a d 检测法2 8 1 等。无 9 西南大学硕士毕业论文第二章基于银纳米粒子的等离子共振光散射法可视化检测苏丹红 论用哪种方法，首先必须用h p l c 系统进行分离，这不仅耗时，而且给实时分析 带来不便，而食品中苏丹红的安全质量控制又至关重要，因此，迫切需要一种简 单快捷的检测手段。这里，我们基于反应生成的银纳米粒子建立了一种新的检测 苏丹红的方法，操作简便，灵敏度高。 2 2 苏丹红的可视化检测 在银纳米粒子形成的基础上，本节报道了一种在食品中检测苏丹红的新方法。 苏丹红i 、i v ( 结构如图2 1 所示) 由于结构中含有氮氮双键和酚羟基而 具有还原性，因此，就可以与硝酸银发生氧化还原反应，生成银纳米粒子。颜色 由苏丹红的红色变为银纳米粒子的棕色，并且导致等离子共振光散射( p l l l s ) 增 强，特征散射峰在4 5 2n r n ，散射信号用普通荧光仪检测。p r l s 信号与苏丹红浓度 成正比，苏丹红i 、m 、浓度范围分别为0 2 - 2 4 t t m o l l ，0 1 2 4 t t m o l l ，0 1 - 2 4 p m o f l 和0 2 3 0g m o l l ，检出限分别为3 21 1 1 1 1 0 l l , 3 0n m o l l ，3 2n m o l l 和2 9 n m o l l 。对实际样品辣椒油的检测，回收率为9 0 8 1 0 3 3 ，r s d 为4 0 - 4 9 ，且 这个结果和i - i p l c 检测的结果一致。机理研究表明，苏丹红的反应基团是酚羟基， 而非氮氮双键。 酗 q n r 厂( ， d 时a o h t l 卜曲一r 厂扣如 卜s n 。， o + a g r 图2 - 1 苏丹红的分子结构以及与a g n 0 3 反应的原理图 1 0 西南大学硕士毕业论文第二章基于银纳米粒子的等离子共振光散射法可视化检测苏丹红 1 实验部分 1 1 仪器 p r l s 光谱强度用f - 4 5 0 0 荧光光度仪( 日本，东京，日立公司) 测得，等离 子吸收用u 3 0 1 0 光谱仪( 日本，东京，日立公司) 测得，t e c n a i 1 0 电子显微镜 ( f e a ) 测得银纳米粒子的t e m 成像图，搅拌溶液用q l - 9 0 1 ( 中国，海门) 旋涡 混合器。还用到了高效液相系统( 日本，东京，日立公司) ，包括l - 2 4 5 0 二极管 检测器、l - 2 3 0 0 柱温箱和l - 2 1 3 0 泵。用到低速离心机( 中国，上海，o p r a t i o n a l 仪 器有限公司) 处理样品，m 光谱由s p e c t r u m g x 型红外光度仪( p e r k i n - e l m e r ) 测 得。用一支激光笔( 6 5 3n n l ，2 0m w ) 和一个光发射二极管( l e d ，4 5 8n n l ，0 5 m w ) 来观察散射光的强弱，其输出功率用w 1 4 功率测定仪( 中国，重庆，西南 大学，物理激光研究所) 测得。 1 2 试剂 标样苏丹红i 、购于化学试剂公司( 中国，上海) ，苏丹红m 、购于k a s e i k o g y o 有限公司( 日本，东京) 。1 0 x 1 0 。m o l l 苏丹红卜的储备液是分别将其 标样溶解于d m f 中得到的，1 o x l 0 巧m o l l 的工作液也是用d m f 稀释而得。 将一定量的硝酸银固体溶解于二次水中得到o 1m o l l a g n 0 3 储备液，工作液 是用二次水稀释到1 0 x l o - 3m o l l ；实验中还用到的试剂有：0 1m o l l n a o h 、o 4 n h 3 h 2 0 和o 2 曲通x 1 0 0 工作液。所有试剂均为分析纯，无需进一步纯化，所 用水均为二次水。 1 3 实验方法 在1 0m l 试管中依次加入2 2 5m l l 0 x1 0 3m o l la g s 0 3 ，0 4m lo 1m o l l n a o h 和o 2 5m lo 4 n h 3 h 2 0 工作液，充分混匀，然后再加入一定体积的苏丹 红和0 3m l 曲通x 1 0 0 工作液，最后，用水定容到5m l ，充分搅拌。2 0 m i n 后， 在扣除空白的基础上测定p r l s 强度。空白是用同样的方法加样，只是不加苏丹红。 p r l s 光谱是用f 4 5 0 0 荧光仪在3 2 0 - 7 0 0n n l 范围内同时扫描激发和发射单色 器( 狭缝1 0 0 i 蛐) 而得，也就是钡= 0 n r l l 。p r l s 强度均指最大p r l s 蜂强度。 1 4 反应产物的分离 为了分析反应机理，我们通过以下步骤实现了产物的分离和表征：在2 0 0m l 锥形瓶中依次加入1 0 0m lo 1m o l la g n 0 3 ，1 0 0m l1 0m o l ln a o h 和1 8m l 2 8 n h 3 h 2 0 ，充分摇匀后，逐滴地加入1 0 0m l1 0 1 0 3m o l l 苏丹红i 溶液。 混合液在室温下快速搅拌3 0r a i n 后，过滤，用氯仿萃取( 3 0m l 3 ) 。得到的有 西南大学硕士毕业论文第二章基于银纳米粒子的等离子共振光散射法可视化检测苏丹红 机相用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏蒸发溶剂，剩下的较高浓度的混合液过硅胶 柱进行分离纯化，流动相用乙醚石油醚( 体积比1 ：5 0 ) 。最后，旋转蒸发、用油泵 抽干，得到黄色的产物。 1 5 样品的预处理 实际样品，包括辣椒油、辣椒酱和番茄酱是从一大型超市( 中国，重庆，北 碚重百) 中购买的。取各样品的液体部分1 0g 分别置于1 0m l 试管中，用d m f 稀释到1 0m l ，充分搅拌后，进行离心分离( 转速3 6 0 0r p m ，时间2m i n ) ，静置 1 0m i n 后，取上层清液进行实验。为对比测定结果，我们同时用欧盟公布的高效 液相色谱法做了对照，其实际样品的处理如下，分别取2 0 0g 溶于1 0 0m l 乙腈 中，充分搅拌1h 后过滤，滤液直接用于样品迸样。 2 结果与讨论 2 1 苏丹红与硝酸银反应的光谱特征 图2 - 2 碱性条件下苏丹红的吸收图谱( 内嵌图给出四种苏丹红的颜色) 各物质浓度：苏丹红，4 0p , m o l l ；n a o h ，8 0 x 1 0 3 r e e l l ；n h 3 h 2 0 ，o ，0 2 ；曲通x - 1 0 0 ，0 0 1 2 苏丹红i 、m 和在碱性条件下具有不同的颜色和吸收光谱( 示于图2 2 ) ， 其特征吸收峰分别位于3 7 6 和4 8 6n l t l 、3 9 6 和5 0 2n l n 、3 4 4 和5 2 4 砌、3 7 4 和5 1 8 1 1 1 1 1 0 然而，与硝酸银反应后发生很大的变化，特征吸收峰均位于3 9 8 0n n a ( 示于 图2 3 ) 。图2 中的内嵌图为苏丹红i 与硝酸银反应的颜色变化响应，苏丹红、 1 2 西南大学硕士毕业论文第二章基于银纳米粒子的等离子共振光散射法可视化检测苏丹红 和与硝酸银反应后的颜色与苏丹红i 同。 图2 3 苏丹红i 与a ：0 3 反应后生成的银纳米粒子的等离子吸收图谱( 内嵌图为颜色响应) 各物质浓度：a g n 0 3 ，4 5 1 0 4m o il ；n a o h ，8 0 l 旷m o l l ；n i l 3 h 2 0 ，o 0 2 ；苏丹红i ( 曲线0 - 4 ，, m o l l ) ，o i 0 ，2 0 ，3 o 4 o ；曲通x 一1 0 0 , o 0 1 2 图2 _ 4 苏丹红i 与a 庐1 0 3 反应后生成的银纳米粒子的t e m 图 平均直径分别为1 7 9 土2 0 ( a ) 、1 7 2 2 0 ( b ) 以及1 7 5 士1 5n m ( c ) 。各物质浓度：a g n o , ，4 5 l 矿t o o l l ；n