（遗传学专业论文）青霉d1菌株壳聚糖酶的酶学性质及基因片段的克隆.pdf

浙江大学硕士论文 刖舌 几丁质( c h i t i n ) ，别名甲壳质、甲壳素，化学名为口一( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一2 一 脱氧一d 一葡聚糖。是许多低等节肢动物，如虾、蟹和昆虫的外壳及少数真菌细胞 壁的重要成分，自然界每年的生物合成量多达1 0 0 亿吨，其数量仅次于纤维素。 几丁质是白色或灰白色、半透明、无定型固体，相对分子量约为1 0 3 1 0 6 2 5 x 1 0 6 ，具有高度疏水性，不溶于水、稀酸、稀碱、浓碱和一般有机溶剂 。 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，又名脱乙酰几丁质、可溶性甲壳素等，是几丁质脱乙酰 化得到的产物，化学名为d ( 1 ，4 ) 2 一氨基2 脱氧d 一葡聚糖。壳聚糖也是白色 无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体。园原料和制各方法的不同，相对分子量 从数十万至数百万不等，不溶于水或碱，可溶于稀的盐酸、硫酸等无机酸口j 】。 几丁质、壳聚糖的分子结构与纤维素非常相近，只是c 2 位上由乙酰氨基( 或 氨基) 代替羟基。几丁质、壳聚糖的分子结构分别是： 一 几丁质( c h i n )壳聚糖( c h i t o s a n ) 图l 几丁质、壳聚糖分子结构 几丁质的传统生产方法是以水产加工业废弃的虾壳和蟹壳为原料，通过脱蛋 白质、脱钙和脱色获取。常用方法有三步法( 脱钙、除蛋白、脱色) 、五步法( 二 次脱钙、二次除蛋白、脱色) 、酸碱交替法( 二次脱钙和二次除蛋白过程交替进 行) ，其中以酸碱交替法效果最佳。 将几丁质进行脱乙酰处理可制得壳聚糖，壳聚糖脱乙酰度的大小直接影响到 它的理化性质及应用。常见的几丁质脱乙酰基方法有化学法和生物法，目前工业 生产中主要采用各种改进的化学法。 化学法中影响脱乙酰度的主要因素有碱液浓度、反应温度和时间。一般而言， 提高碱液浓度、反应温度和反应时间可提高脱乙酰度，但同时主链也会降解，从 而影响产品的粘度和分子量。生物法可分两种，一种是在几丁质的基础上利用几 丁质脱乙酰酶的作用制各出高品质的壳聚糖。利用微生物发酵技术和几丁质脱乙 浙江大学硕士论文 1 1 生物医用材料和膜。壳聚糖可以用于制造吸收性手术缝合线、防止组织 粘连材料、人工韧带、人工骨和止血材料等。用壳聚糖纤维制成的缝合线，在预 定时间内有很强的抗张强度，在体内有良好的适应性，尤其是经过一定时间，壳 聚糖缝合线能被溶菌酶所降解，被人体自行吸收。多肽溶液与几丁质或壳聚糖溶 液混合制成的薄膜均匀、透明、手感柔软，具有良好的弹性和强度，可以透过尿 素、肌酐等水溶性有机物，但不能透过n a + 、k + 、c 1 等无机离子及血清蛋白， 透水性好，是一种理想的人工肾用膜。 1 2 人造皮肤。壳聚糖或几丁质是制造人造皮肤的理想材料，它质地柔软、 舒适，与创面的贴合性好，不仅具有抑菌消炎作用，还有抑制疼痛、止血和促进 伤口愈合的功能。 l3 药物载体。壳聚糖无毒，易吸收，在低p h 值时可形成膜，具有抗酸、 抗溃疡能力，可以内服而无副作用，从而能作为理想的药物缓释膜材料，减缓药 物对胃的刺激。 1 4 抗肿瘤作用。壳聚糖不仅具有很好的生物相容性，在体内能降解，而且 本身就具有一定的抗肿瘤作用和抗菌作用。几丁质或壳聚糖水解生成的d 一2 一氨 基葡萄糖在体内对某些癌细胞有明显的杀灭作用。而对正常组织几乎没有影响， 因此几丁质和壳聚糖都可作为癌症的化疗药物。壳寡糖的抑瘤率远高于其他来源 的寡糖，能提高机体的免疫活性和抗癌能力。研究表明，聚合度为3 8 的壳寡 糖生物活性较高，其中以六糖为最高，而单糖或二糖活性则很低。壳寡糖可以通 过活化人体中的淋巴细胞，抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌作用。壳寡糖在 人肠内形成的小分子基团容易被肠道吸收，抑制癌毒素在体内的释放。同时壳寡 糖作为一种良好聚电解质，能被吸附在血管壁细胞的表面，抑制癌细胞转移。 l5 非病毒的基因载体。壳聚糖是一种价格较低、生物相容性好、可降解、 低毒的阳离子天然高分子聚合物，易与d n a 结合，形成聚电解质复合体，使 d n a 具有更强的抵抗核酸酶降解能力，因此壳聚糖及其衍生物可能成为一种安 全有效的阳离子聚合物基因释放载体。替代病毒和脂质体进行基因转染。将一定 的糖基联结到壳聚糖上，得到靶向的基因载体系统：乳糖基化的壳聚糖可作为一 种专门转染表达半乳糖特异性膜凝集素的细胞的靶向基因载体；半乳糖基化壳聚 糖可作为转染肝细胞( 表达脱唾液酸糖蛋白受体) 的靶向基因载体，这些载体可 浙江大学硕士论文 用于肿瘤的基因治疗队2 1 。 2 在农业方面的应用 2 ，l 饲料添加剂。研究发现，在饲料中加入1 0 几丁质，能使小鸡对照组增 重。 2 2 种子处理剂。壳聚糖可用作粮食、蔬菜作物种子的表面处理剂，激发种 子提前发芽，促进作物生长，提高抗病能力，从而提高粮食和蔬菜产量。壳寡糖 具有良好的抗病虫害功能，且有安全、微量、高效、成本低等优势，能使水果、 蔬菜、粮食增产1 0 3 0 ，因而可以应用于生物农药产品，部分替代化学农药。 用壳寡糖溶液对小麦拌种可以防止地下霉菌对种子的危害，提高抗病能力和抗倒 伏能力1 3 】。壳寡糖还可作为植物调节剂，刺激植物的免疫系统反应，激活防御 反应，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成和增强植物对病虫害的防御。 壳寡糖的诱抗活性与壳寡糖的聚合度及脱乙酰度密切相关，低聚合度及高脱乙酰 度的壳寡糖诱抗活性高。 2 3 液体土壤改良剂。将壳聚糖与可溶性蛋白合成液体土壤改良剂，具有较 好的稳定性和可降解性，降解以后是优良的有机肥料，可供作物吸收。它们不仅 可以抑制土壤中病原菌的生长和繁殖，同时能有效地改善土壤的团粒结构，是一 种比较理想的液体土壤改良剂。 3 在食品工业中的应用 几丁质和壳聚糖由于成本低廉、资源丰富，无毒副作用，在食品工业中获 得了十分广泛的应用，其中以作为液体处理剂、食品添加剂和功能材料3 个方面 的应用最为广泛1 1 5 ，1 6 1 。 3 1 液体处理剂。壳聚糖作为絮凝剂应用于食品工业有其独特优点，无毒无 味，可生物降解，不会造成二次污染，适合用于食品工业的要求。壳聚糖是理想 的糖汁絮凝剂，可以净化原料糖和废糖蜜。糖汁中添加2 5 0 p p m 壳聚糖，能使 糖汁中的悬浮物迅速凝集，形成的凝集物颗粒大、沉降迅速且易于过滤，同时还 能控制果汁的酸度。 3 2 食品添加剂。多作为食品的增稠剂和稳定剂，用于改善食品的风味、流 动性和食品结构形状、粘度的控制，增加纤维含量等。几丁质和壳聚糖能够阻止 消化系统吸收胆固醇和甘油三酯，促进这些物质排除体外，增加抗体数量，提高 机体免疫力。壳寡糖具有比壳聚糖更优越的生物活性，无毒、无副作用，可被人 6 浙江大学硕士论文 仿生膜、酶固定化等高新技术领域的应用中崭露头角2 们。 虽然几丁质、壳聚糖的来源丰富，功能优越，但是由于它们分子量大，不溶 于水和普通溶剂，使得它们的应用受到很大限制。相比之下，壳寡糖具有十分突 出的优点：水溶性好，易被人体吸收，无毒副作用：无抗原性；在宿主细胞内较 弱的累积效应等：具有抑菌、抗肿瘤、调血脂、调节免疫及活化肠道双歧杆菌等 多种生理功能。 目前，壳寡糖的制备大体可分为3 大类：化学降解法、物理降解法和酶降解 法。 化学法嗽蛐翮。骟镑薛牮，话崭。强娑碥灭等基题i囊r i 稀囊蕃嚣薷髻烈蚓醺型； 醒皑鞋嗣鞭移= m 铜橱：淄缓r l l 出蚤j 翼龆舔霹抟嗵卵m 蝤￥赢蒜釜磊 鬓鬻夔i 搭一j 委囊鹜妻；髓商蒜刺零囊i 一渐博生物技术有限公司购买。 4 仪器设备 d h p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) 、h z 9 3 1 1 k 型、 h z 9 2 1 l k 型恒温振荡摇床( 江苏省太仓市科教器材厂) 、t g l 1 6 c 型高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂)、scr一20ba低温高速冷冻离心机(日本日立工机) 、 光度计 (上海第三仪器厂)、dyy-i28a型夹芯式垂直电泳槽(北京六一仪器厂)、d y y - 12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)、nicon光学显微摄影(日本制造) 、dycp31d型dna水平电泳槽(北京六一仪器厂)、ptc一100型pcr仪( 美国 mjr e s e a r c hi n c ) 。5 壳聚糖酶产生菌n h 妇肼s p d 1 的筛选和分类鉴定 51富集培养与平板筛选4 5 1将1 m l 土壤样品的水洗液加到1 0 m l 含o 2 9 壳聚糖的o 2 k 2 h p 0 4 培养液中， 3 0 富集培养7 天，再采用平板稀释法在胶体壳聚糖平板上均匀涂布1 0 、1 0 4 、 1 0 。5 x 浙江大学硕士论文 4 - 糖苷键的能力，它能以几丁质和部分n 。乙酰化壳聚糖为底物，水合正碳离子 中间产物并使其进行转糖苷化反应，其降解程度不如壳聚糖酶【2 3 】。壳聚糖酶是 分解壳聚糖的专一性酶，主要存在于真菌和细菌细胞中，在单子叶和双子叶植物 的不同组织中也发现存在壳聚糖酶。 通过化学方法制备壳寡糖不仅工艺复杂、成本高，而且易污染环境，使壳寡 糖的应用范围受到限制。微生物壳聚糖酶可以用来大规模生产壳寡糖，并且细菌 壳聚糖酶在维持生态平衡、在生物化学和分子水平上研究壳聚糖水解机制方面有 着重要作用。 壳聚糖酶分布广泛，到目前为止，已经从多种微生物包括细菌( 肋c f “j 、 坳加6 口c 耙r 、肌耙，d 6 d c 把力，放线菌( 跏印幻哪饼s 、j o c d ，西。池j ) ，霉菌 印e r g f 朋、 尸e ”七f f m 聊) ，病毒( c 胁陀妇v i m sp b c v 1 、c v k 一2 ) ，植物组织中检测到壳聚 糖酶【2 5 】。在微生物壳聚糖酶中，有关细菌壳聚糖酶的报道很多，有的已经深入 到基因克隆和蛋白质三级结构水平。但是有关真菌壳聚糖酶酶学性质及壳聚糖酶 基因克隆的报道比较少，只在有限的几种真菌中有过壳聚糖酶分离纯化和酶学性 质的报道：岛青霉( 凡n f c 肌“m 括肠n 讲c 删) 2 6 1 ，鲁氏毛霉( 胁c 卯厂0 麟f f ) 【2 ”， 红酵母属( 月 o 如幻，“肠日c f f 妇) 【2 8 】，腐皮镰孢霉( 凡坫胛胁川s d 肠耐f s p p 础p d f f ) 【2 9 】，小刺青霉( p 印加舶s “珊) 【3 0 】，烟色曲霉( 彳妒e r g f f f 淞丘m t 即r 甜k h 一9 4 ) 3 1 1 ， 木霉( 开f c d 出r m 盯旭p 5 e f p c 一3 7 ) 【3 2 1 ，曲霉( 4 妒e 憎f z f 2 拈s p y 2 k ) 【3 3 】，米曲霉 ( 4 o r 脚ei a m 2 6 6 0 )【3 4 1 ，球孢白僵菌( b e 口“v e r 妇6 甜s 胁咒d ) 【3 列，烟色曲霉( 爿 m m t 啊n 岱k b 1 ) 3 6 。各种真菌壳聚糖酶的主要酶学性质见表1 。 随着分子生物学技术的发展，微生物壳聚糖酶的研究已经进入了分子水平， 壳聚糖酶与几丁质酶、溶菌酶同属于糖苷水解酶类。0 糖苷水解酶( 0 - g l y c o s i d e h v d r o i a s e s ，e c3 2 1 ) 是一组广泛的催化两个或多个糖分子、或者一个糖分子 与另一个非糖分子之间糖苷键的酶。由于酶的氨基酸顺序与分子折叠相似性之间 有着直接的关系，根据酶的氨基酸序列的相似性，糖苷水解酶分成不同的家族( 除 去不能分类的) ，共有8 7 个。根据已知的壳聚糖酶的氨基酸序列，壳聚糖酶分 属于其中的4 6 号、7 5 号、8 0 号、8 号和5 号5 个家族，其中真菌的壳聚糖酶属 于7 5 号家族【2 5 ”j 。 塑坚茎堂堕圭堡苎 表l 真菌壳聚糖酶的主要酶学性质 菌株 分子量 最适 最适 等电点 金属离子 金属两手一 ( k d a ) p h 温度 p i激活剂抑制剂 t 坩础“ 7 65 o5 5 4 9k + h 矿+ ，c u 2 - ，m n 2 + ， rf 口c i n 5 f5 0 k h j fs p n h d s e o n p 卿n “舰m a ，确i g 口l i ( h 9 4 r 陀p j p fp c 3 7 a s p e r g l t ws p y 2 k o n w p i a m 2 6 6 0 b jb 口s s i c k n 口 5 85 o5 0 4 7c a 2 +p b 2 + s n 2 + 1 0 04 54 5n d m n 2 + h g “，c u 2 + 3 65 64 0m dn dn d n d5 。0 2 2 55 5 1 0 84 5 5 5 9 34 0 2 56 5 4 0 1 3 5 3 6 5 5 5 5 4 0 5 5n d 7 0 _ 8 07 3 5 0 6 04 8 5 0n d 6 5 7 08 4 5 0n d 5 0n d 6 0n d a 胁1 i g a t u s k b - 1 1 1 1 2 36 56 0n d n d m n 2 + m n 2 + n d m n 2 + c u 2 + n d n d f e 2 + n d 2 3 _ 3 85 57 0n dn d n d h f + ，c u 2 + h g “，c u 2 + n d h g n ，c d 2 + n d n d c u ”，p b “，h 矿， n i “，a g + ，m n 2 + b i 2 + ，c u 2 + ，f e 2 十， f e ”，h g ”，m n 2 + ， m o “ c u 计，h 9 2 十，m 0 6 + n d ：指未确定。 目前n c b i 数据库中已知壳聚糖酶氨基酸序列的真菌主要有：米曲霉4 。 d ，删pi a m 2 6 6 0 ( c h t i o s a l l a s e b ，b a c l 0 6 1 0 和c 1 1 i t o s 卸a s e ，j c 7 6 5 9 ) 叫、腐皮镰孢 霉f s d 缸n f fs p p 向甜e o ? f ( b a c l 0 6 0 9 ) 【3 ”、球孢自僵菌b 6 耵s 蛔h ( a a g l 7 9 4 0 ) 、 坛幻 拓f “m 口h 括d p f 以pv a r 钾r f d h 埘( c a c 0 7 2 1 8 ) 、烟色曲霉爿屈m 辔口f 螂 ( a a d 2 6 1 1 1 ) ，序列对比分析结果显示它们彼此之间的同源性较高( 图3 ) 。 几丁质及壳聚糖具有丰富的原料来源和广泛的应用范围，壳寡糖由于其具有 独特的生理功能，正越来越受到人们重视，对其制备方法的研究报告也越来越多。 现在，对几丁寡糖、壳寡糖的应用开发刚刚起步，尤其是对酶法的研究更是兴盛 起来，对其研究也应该继续加强。首先应该从自然界中继续筛选产酶活性较高、 底物特异性强的菌株，优化菌株产酶最适发酵条件；其次是重点深入研究酶的 l o 浙江大学硕士论文 催化机理，分析其蛋白质结构，并应用于对酶的改造。运用基因工程手段，通过 对壳聚糖酶的基因分析，运用分子克隆方法克隆并改造壳聚糖酶基因，构建高效 表达工程菌株，优化产酶的发酵条件，以实现重组壳聚糖酶的高效表达；最后应 大力开展酶法制取壳寡糖的新技术，优化生产工艺，充分利用丰富的自然资源， 开展工业化生产。 本实验室一直在致力于开展生物降解几丁质、壳聚糖的研究。本研究主要是 通过简便、快速的筛选方法，从自然环境中分离到一株高产壳聚糖酶的菌株，并 进行菌株鉴定、产酶发酵条件优化、酶的分离纯化以及酶学特性的研究，同时在 分子水平上对该菌株壳聚糖酶进行初步探索，期望可以取得更深入的研究进展。 浙江大学硕士论文 材料与方法 1 菌株和材料 1 1 实验菌株：青霉d 1 菌株( 凡n f c 订f i ms p d 1 ) ：产壳聚糖酶菌，由本实验 室从泥土中分离筛选获得。 2 培养基 2 1 壳聚糖和几丁质 由日本岛根大学的松田英幸教授提供，颗粒大小都为l o o 目，壳聚糖脱乙酰 度为7 0 9 0 ，分子量为5 0 0 一l 0 0 0k d a ，几丁质脱乙度为1 0 2 5 。 2 21 ( 或2 ) 胶体壳聚糖 称l g ( o r2 9 ) 壳聚糖，加入7 5 d0 4 n 的h c l 在磁力搅拌器上研磨，直至变 为胶体状。用2 m o l l 的n a o h 调口h 至5 0 ，蒸馏水定容至1 0 0 m l 。 2 3 胶体几丁质的配制 5 9 几丁质中加入5 0 m l 浓h c l ，搅拌3 0 m i n 后加入2 5 0 m l 冰蒸馏水，搅拌均 匀，4 静置，待分层后弃上清，重新加入冰蒸馏水，重复以上操作直到溶液p h 为5 o 左右。真空抽滤除去几丁质中的水分，即制成胶体几丁质。本文中提到的 胶体几丁质浓度实际上是几丁质粉末的浓度，胶体几丁质的用量应根据它与初始 几丁质粉末的重量比来计算。 2 4 查氏培养基： n a n 0 30 2 ，k 2 h p 0 40 1 ，k c lo 0 5 ，m g s 0 40 0 5 ，f e s 0 4o 0 0 l ， 蔗糖2 o 。p h 自然；若为固体培养基，则加琼脂1 5 - 2 2 5 基本培养基： n a n 0 30 2 ，k 2 h p 0 4o 1 ，k c l0 0 5 ，m g s c l0 0 5 ，f e s 0 4o 0 0 1 ， 酵母膏o 5 ，蛋白胨0 5 。p h 5 o 2 6 胶体壳聚糖平板 a 液：1 胶体壳聚糖， b 液：n a n 0 3o 4 ，k 2 h p 0 40 _ 2 ，k c lo 1 ，m g s 0 4o 1 ，f e s 0 4o 0 0 2 ， 琼脂15 2 0 。p h 自然 浙江大学硕士论文 将a 液、b 液分别在1 2 l 下灭菌2 0 m 抽，再等体积混合倒平板、制斜面。 2 7 发酵培养基，即壳聚糖培养基( 1 3 不同浓度) l 3 9 壳聚糖粉末加到1 0 0 m l 的基本培养基中，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 8 马铃薯培养基( p d a ) 2 0 9 已去皮的马铃薯切成小块，煮沸半小时，用纱布过滤后滤液中加2 9 蔗 糖，加蒸馏水定容至1 0 0 m l ，1 2 l 灭菌2 0 m i n 。若为固体培养基则加1 5 9 2 o g 琼脂粉。 2 9 胶体壳聚糖平板 胶体壳聚糖0 5 ，琼脂粉：1 5 2 o 。用p h 4 0 的n a 2 h p 0 4 一柠檬酸缓冲液 配制。 3 试剂 3 12 哪o l l 的标准氨基葡萄糖溶液 氨基葡萄糖在6 0 下烘干到恒重后，准确称取0 4 3 1 9 ，用蒸馏水定容至1 0 0 0 m l ，配成2 哪o l l 的标准液。 3 2 d n s 试剂 4 5 5 9 酒石酸钾钠加到1 2 5m l 热水中溶解，加入1 5 7 5g d n s ( 3 ，5 一二硝基 水杨酸) 和6 5 5m l 的2 m o l ln a o h ，再加入1 2 5 9 重蒸酚和1 2 5 9 亚硫酸钠， 搅拌溶解，冷却。用蒸馏水定容至2 5 0 m 1 贮于棕色瓶中，放置7 天后备用。 3 3m c i l v a i n eb u n 赋心a 2 h p 0 4 一柠檬酸缓冲液) 0 2m 0 1 ln a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 o 1 m 0 1 l 柠檬酸缓冲液，两者按不同比例混合 配成不同p h 值的缓冲液备用。 3 4 变性s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s 。p a g e ) 所需试剂及染色液、脱色液的 配制见参考文献【4 0 ，4 ”。 3 5 非变性聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳( n a t i v cp a g e ) 所需试剂及染色液、脱色液 的配制见参考文献4 ”。 3 。6 真菌形态观察试剂 乳酸石炭酸棉蓝染液：石炭酸1 0 o g 、乳酸( 比重1 2 1 ) 1 0 0 n l l 、甘油2 0 o m l 、 蒸馏水1 0 o r r d 、棉蓝o 0 2 9 。 1 4 浙江大学硕士论文 仿生膜、酶固定化等高新技术领域的应用中崭露头角2 们。 虽然几丁质、壳聚糖的来源丰富，功能优越，但是由于它们分子量大，不溶 于水和普通溶剂，使得它们的应用受到很大限制。相比之下，壳寡糖具有十分突 出的优点：水溶性好，易被人体吸收，无毒副作用：无抗原性；在宿主细胞内较 弱的累积效应等：具有抑菌、抗肿瘤、调血脂、调节免疫及活化肠道双歧杆菌等 多种生理功能。 目前，壳寡糖的制备大体可分为3 大类：化学降解法、物理降解法和酶降解 法。 化学法嗽蛐翮。骟镑薛牮，话崭。强娑碥灭等基题i囊r i 稀囊蕃嚣薷髻烈蚓醺型； 醒皑鞋嗣鞭移= m 铜橱：淄缓r l l 出蚤j 翼龆舔霹抟嗵卵m 蝤￥赢蒜釜磊 鬓鬻夔i 搭一j 委囊鹜妻；髓商蒜刺零囊i 一渐博生物技术有限公司购买。 4 仪器设备 d h p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) 、h z 9 3 1 1 k 型、 h z 9 2 1 l k 型恒温振荡摇床( 江苏省太仓市科教器材厂) 、t g l 1 6 c 型高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂)、scr一20ba低温高速冷冻离心机(日本日立工机) 、 光度计 (上海第三仪器厂)、dyy-i28a型夹芯式垂直电泳槽(北京六一仪器厂)、d y y - 12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)、nicon光学显微摄影(日本制造) 、dycp31d型dna水平电泳槽(北京六一仪器厂)、ptc一100型pcr仪( 美国 mjr e s e a r c hi n c ) 。5 壳聚糖酶产生菌n h 妇肼s p d 1 的筛选和分类鉴定 51富集培养与平板筛选4 5 1将1 m l 土壤样品的水洗液加到1 0 m l 含o 2 9 壳聚糖的o 2 k 2 h p 0 4 培养液中， 3 0 富集培养7 天，再采用平板稀释法在胶体壳聚糖平板上均匀涂布1 0 、1 0 4 、 1 0 。5 x 塑望盔兰堡主堡苎 将石炭酸加在蒸馏水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝【4 2 1 。 3 7p e 疗f c f f 7 f “ms p d 一1 染色体d n a 提取试剂旧删 抽提缓冲液：5 0m m 0 1 ，lt r i s h c l 、15 0m m o l ，ln a c l 、1 0 0m m 0 1 le d t a ： t e 缓冲液：1 0m m o i 几t r i s h c i ( p h 8 o ) 、lm m o i 甩e d l a ： 2 0 s d s ： 5m o 】l n a c l ： c t a b n a c l ：1 0 c t a b 、0 7mn a c l ： 平衡酚氯仿异戊醇( 2 5 2 4 1 ) ； 冰无水乙醇；7 0 乙醇。 3 8p c r 反应所需试剂： 而g 酶，1 0 反应缓冲液、d n t pm i x t u r e ( 1 0 m m ) 、m g c l 2 ( 2 5 m m ) 、引物 1 ( s e n s e 阿m e r ) 、引物2 ( a 面s e n s ep r i m e r ) 、模板、去离子水、石蜡油。 p c r 反应所需试剂均从上海博亚生物技术有限公司购买。 4 仪器设备 d h p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) 、h z 9 3 1 1 k 型、 h z 9 2 1l k 型恒温振荡摇床( 江苏省太仓市科教器材厂) 、t g l 1 6 c 型高速台式 离心机( 上海安亭科学仪器厂) 、s c r 一2 0 b a 低温高速冷冻离心机( 日本日立工 机) 、d - s c r 4 2 0 型可控硅控温三用水浴锅( 江苏通州市实验仪器厂) 、7 2 1 型分光 光度计( 上海第三仪器厂) 、d y y - i 2 8 a 型夹芯式垂直电泳槽( 北京六一仪器厂) 、 d y y - 1 2 型电脑三恒多用电泳仪( 北京六一仪器厂) 、n i c o n 光学显微摄影( 日本 制造) 、d y c p 3 1 d 型d n a 水平电泳槽( 北京六一仪器厂) 、p t c 一1 0 0 型p c r 仪 ( 美国m jr e s e a r c hi n c ) 。 5 壳聚糖酶产生菌n h 妇肼s p d 1 的筛选和分类鉴定 5 1 富集培养与平板筛选4 5 】 将1 m l 土壤样品的水洗液加到1 0 m l 含o 2 9 壳聚糖的o 2 k 2 h p 0 4 培养液中， 3 0 富集培养7 天，再采用平板稀释法在胶体壳聚糖平板上均匀涂布1 0 、1 0 4 、 1 0 。5 三个稀释度，3 2 恒温培养，观察透明圈产生情况。培养5 天后挑取生长 浙江大学硕士论文 良好且能产生透明圈的单菌落，接种到胶体壳聚糖斜面培养基上，采用石蜡油保 种法进行保种。 5 2 菌株形态特征鉴定 将保存在新鲜斜面上的d 一1 菌株接种到壳聚糖平板上，3 2 培养4 天。观察 记录d 一1 在胶体壳聚糖平板上的单菌落形态。 将p e n f c 埘“s p d 1 接种到壳聚糖平板上，采用斜插片培养法3 2 培养4 天，利用乳酸石炭酸棉蓝染液染色，制成水浸片，于光学显微镜下观察菌丝和分 生孢子头形状并拍照f 4 2 】。 6 发酵液壳聚糖酶活力的测定 6 1 氨基葡萄糖标准曲线制作 分别取2u m o l 1 的氨基葡萄糖( g l c n ) 标准液1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、 1 0 珊1 于试管中，均用蒸馏水补足到1 0 m 1 ，混匀；各取o 5 础加o 5 m ld n s 试剂 混合后沸水浴中加热5 m 通，迅速用冷水冷却，每管中加4 m l 蒸馏水，混匀后以 蒸馏水为对照，于5 4 0 衄波长处读取吸光度值。 另外取o 5 m l 蒸馏水和0 5 m 1d n s 试剂混合，经同样处理后也以蒸馏水为对 照测o d 5 4 0 ，作为空白。每种浓度的溶液做两个平行组，结果取平均值。以氨基 葡萄糖量( 岍0 1 ) 为横坐标，以不同浓度氨基葡萄糖溶液o d 5 4 0 与空白0 d 5 4 0 的 差值为纵坐标做标准曲线，并由该曲线的趋势线获得标准曲线函数。 6 2 壳聚糖酶活力的测定 发酵液于4 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，取上清作为酶液，按图4 方法检测其活力( 必 要时对发酵液进行适当稀释) 。 根据氨基葡萄糖标准曲线，将两组o d 5 t o 差值折算成还原糖量，再根据酶活 力单位的定义，算出酶活力。 一个酶活力单位( u ) 定义为：在本实验条件下，每分钟产生相当于1 岬1 0 l 氨基葡萄糖的还原糖量所需的酶量。 6 3 发酵液中还原糖量的测定 发酵液于4 0 0 0 r p m 离，心1 5 m i n ，取o 5 m i 上清与0 5 m ld n s 试剂混合，沸水 浴中反应5 m i n 后冷水冷却，加入4 o m l 蒸馏水，混匀后于5 4 0 吼处读取吸光度 浙江大学硕士论文 值，再按氨基葡萄糖标准衄线函数算出其o d 5 4 0 对应的还原糖量。 1 o m 【m c i l v a i n e 缕仲液( p h 4 o ) o 5 m 1 上清酶液 o 5 m 1l 胶体壳聚糖 。或点水浴反应，。；。 上 加o 1 m 12 5 m 的n a o h 1 o m lm c i l v a i n e 缓冲液( p h 4 0 ) o 5 m i 上清酶液 上 沸水浴1 0 m i n 上 加入o 5 m 1 1 胶体壳聚糖 上 4 8 或5 2 水浴反应3 0 m i n 再煮沸5 m i n ( 空白组) 使未反应的胶体壳聚糖沉淀 取。，。，上清与。土，。n 。试剂混合 沸水浴反应，熹。，冷水冷却 0 图4 壳聚糖酶活力的测定方法 7 h 缸沁h 小s p d ，1 产壳聚糖酶条件的优化 以下各实验如无特殊说明，发酵培养基中底物壳聚糖浓度均为1 o ，接种 量为1 0 7 个孢子1 0 0 m l 培养基，培养基p h 值：p h 5 0 。培养温度为3 2 ，摇床 转速为1 8 0 r p m 。发酵液酶活力测定均从培养的第4 8 h 开始，每隔2 4 h 取一次发 酵液测酶活。 7 1 & i c 凇誓ms p d l 孢子悬液的制备 将d 一1 菌株从斜面接种到壳聚糖平板上，3 2 培养4 5 天，无菌水洗下孢子 ( 5 m 1 无菌水平板) 。并用无菌玻璃珠打散，制成孢子悬液，约1 0 7 个孢子，m l h 2 0 1 7 浙江大学硕士论文 7 7 不同底物壳聚糖浓度对p p n f c f ，池ms p d 一1 产酶的影响 在5 n am 1 三角烧瓶中装入1 am l 发酵培养基( p h 5 0 ，培养基中添加1 m 1 稀释十倍的消泡荆) ，底物壳聚糖浓度分别为2 ，o ，2 5 ，3 o 。3 2 、1 8 0 m 培养，每隔2 4 h 取样测酶活。 7 8 最适条件下p p ”f c 棚“ms p d 一1 的发酵产酶情况 根据正交实验和单因素实验结果，确定d 1 菌株的最适产酶发酵条件，接种 后培养，从第4 8 h 开始，每隔1 2 h 取样测酶活、还原糖及发酵液p h 值变化情况。 8 薹i 摊缸淞”ms p d 1 壳聚糖酶的提纯与理化性质的初步研究 8 1 心”f c f m m d 1 产壳聚糖酶的分泌性。 将孢子悬液接种到1 0 0 m l 的发酵培养基，3 2 培养4 天后按以下步骤测定 d 1 菌株产壳聚糖酶的分泌性。 第一步：取发酵液2 0i ：i i ，直接稀释5 倍测酶活。( 胞外酶) 第二步：取发酵液2 o m l ，离心，6 0 印m ，1 0 m i n ，弃上清，菌体用1 o m l 、 p h 4 o 的n h p 0 4 一柠檬酸缓冲液洗涤三次，最后再用2 m l 相同缓冲液重悬菌体， 置于冰水浴中超声波破碎1 0 次，每次2 0 k h z 、3 0 s 。直接取超声波破碎液不稀释 测酶活。 胞内酶) 第三步：取发酵液2 0 m 1 ，直接用超声波破碎1 0 次，每次2 0 k h z 、3 0 s 。不 离心直接取超声波破碎液稀释五倍测酶活。( 总酶量) 8 。2 壳聚糖酶粗酶液的提取与纯化 以下操作步骤均在4 条件下进行。 培养4 天的发酵液4 a a o m 离心2 0 m i n ，除去菌丝体和不溶物，收集上清， 用硫酸铵盐析法分级沉淀。将硫酸铵缓缓加入上清液中，边加边缓慢搅拌，先到 3 5 饱和度，加完后4 冰箱过夜，使蛋白质部分沉淀。离心，4 ，l n | 囊m ( 1 2 ，5 n 2 ) ，1 5 m i n ，得到沉淀和上清，3 5 饱和度时沉淀主要是杂蛋白；上清 继续用同样方法加硫酸铵，分别达到6 5 和8 5 饱和度，置于冰上4 冰箱过夜。 离心，4 ，l 自o o | m ( 1 2 ，5 0 0 。g ) ，1 5 m i n ，得到沉淀( 6 5 及8 5 饱和度) 和 上清液。 收集各步骤所得沉淀( 3 5 、6 5 、8 5 饱和度时所得沉淀) 先用p 嚣i o 的 浙江大学硕士论文 n a 2 h p 0 4 一柠檬酸缓冲液( 所用缓冲液体积尽量要少) 洗涤，使沉淀悬浮溶解， 收集装入预先处理好的透析袋中，再用p h 4 0 的n a 2 h p 0 4 柠檬酸缓冲液透析4 8 小时，期间每隔一定时间更换透析缓冲液。透析完成后，收集透析袋里的酶液， 分装于无菌的印p e n d o r f 管中，2 0 冰箱保存备用。测各个步骤所得样品的壳聚 糖酶活，计算壳聚糖酶的得率和纯化倍数。 透析后的样品再通过预先用n a 2 h p 0 4 柠檬酸缓冲液( p h 4 o ) 平衡过夜的 s e p h a d e x g _ 2 0 0 凝胶柱( 1 6 6 0 c m ) 凝胶过滤层析分离，用相同的缓冲液洗脱， 流速2 4 m 垤，4 m 】管，收集合并有酶活部分。 经第一次过柱后，得到两个酶活高峰。分别合并几次经s 印h a d e x g 一2 0 0 凝胶 过滤所得的主要酶活部分，用饱和硫酸铵盐析法沉淀浓缩，所得沉淀经透析后再 次经过用n a 2 h p 0 4 柠檬酸缓冲液( p h 4 o ) 平衡过夜的s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶柱进 行二次过滤层析分离。流速2 4 m l i l ，4 m l ，管，收集有活性部分检测纯度，测定酶 分子量和酶学性质。 8 3p p ”f c 肌“ms 口d l 壳聚糖酶理化性质的初步研究 以下实验所用酶液均为二次过柱后所得并经过适当稀释的样品。 8 3 1 壳聚糖酶的最适反应温度及酶的温度稳定性 选取在不同的温度条件下( 3 6 、4 0 、4 4 、4 8 、5 2 、5 6 、6 0 、 6 4 ) 反应，按标准方法测酶活，以酶活力最高值为1 0 0 。 将酶液先用p h 4 0 的n a 2 h p 0 4 一柠檬酸缓冲液稀释4 倍后，分别于不同温度 ( 3 6 、4 0 、4 4 、4 8 、5 2 、5 6 ) 下保温6 0 r n i n ，迅速冷却。然后再取 0 5 m l 按标准方法测定剩余酶活，以稀释过未经保温的酶液酶活力为1 0 0 。 8 3 2 壳聚糖酶的最适反应p h 值和酶的酸碱稳定性 在不同口h 值的n a 2 h p 0 4 柠檬酸反应缓冲液( p h 2 5 ，3 o ，3 5 ，4 o ，4 5 ， 5 o ，5 5 ，6 o ，6 ，5 ，7 o ) 中反应，按标准方法测酶活。 酶液先用p h 4 o 的n a 2 h p 0 4 柠檬酸缓冲液稀释l 倍后，取稀释过的酶液 0 ，5 m l ，加o 5 m l 不同p h 值的n a 2 h p 0 4 柠檬酸缓冲液( p h 2 5 ，3 o ，4 o ， 5 o ， 6 o ，7 o ) ，于3 7 保温6 0 m i n ，迅速冷却。然后再取o 5 m l 按标准方法测剩余酶 活力，以最大酶活值为1 0 0 。 8 3 3 金属离子对酶促反应的影响 浙江大学硕士论文 酶液先用p h 4 o 的n a 2 h p 0 4 一柠檬酸缓冲液稀释，选取不同的金属离子( n a + ， 贮，m 9 2 十，c a 2 + ，c 0 2 + ，m n 2 + ，f e 3 + ，c u 2 + ，a r ) 分别加入酶溶液，使其终浓度为 1 2 5 m m o l ，l ，按标准方法测酶活。所用的金属离子均为氯盐( c u 2 十，a 矿除外，分 别为a g n 0 3 和c u s 0 4 ) ，浓度为1 0 0 m m o l l 。以稀释过、不加金属离子的原酶液 酶蓁薹! 擎髫。 l 譬，羹矍蠢葫瑟翼薹鏊凌型囊 荔酗謦；矗量引篓羹藩挂；苗嚣霪鬣螯；鞠都举蟊鳓i 藉薹誊& 簟蔻i 霎陲_ 薹； 型蓄琴j 荐磊吲瓣剖莽晷j l 誊：蔷兹袄皱噩“豁塞毫 番蘸塞且蚕薹。* 芸；u 耄辇要蟾矧基鄯掣到删：小2 疆迤墨壁鲤饕确舔 l ! 箍堤臻；斟勖甄| ：翰型割彰加鼙骋n 蓑鬓羹露彘瑚墅搜5 ) * # ，篓露裂冀萎 潞嚆：鏊；f 羲i 妻e l ；型 分混匀。 ( 6 ) 加6 5 u 1 c t a b ，n a c l ，充分混匀，6 5 温浴1 肚2 0 m i n 。 ( 7 ) 加入等体积( 约7 0 0 脚) 的氯仿异戊醇，充分混匀。1 2 0 0 咖) m 离心1 0 m j n ， 将上清液转移到一个新的ep p e n d o r f 管中。 ( 8 ) 加入等体积的酚、氯仿异戊醇，充分混匀，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，将 上清液转移到另一个新的印p c n d o r f 管中。一共抽提两次以除去蛋白。 ( 9 ) 加入2 倍体积的冰无水乙醇，轻轻混匀至d n a 沉淀下来。1 2 0 0 0 r d m 离心1 0 m i n 。 ( 1 0 )用冰的7 0 乙醇洗涤沉淀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 觚n 。 ( 11 )弃去上清，沉淀真空干燥。用1 0 0 斗l t e 缓冲液溶解d n a 沉淀，加2 m r n a 8e a ，3 7 水浴1 5 m i n 以除去r n a 。 ( 1 2 )取5 u l 用o 8 的琼脂糖凝胶电泳检测。 9 2 目的基因d n a 片段合成与分析陬5 ”。 根据已知的真菌壳聚糖酶氨基酸序列，利用氨基酸序列多重对比软件 c i u st w 进行对比分析找出同源区段，设计引物。以d 1 菌株染色体d n a 为模板 进行p c x 一塑坚奎堂堡圭堡苎 轻地压一块玻璃板，加入p h 4 0 的n a 2 h p 哦一柠檬酸缓冲液，使凝胶c 浸泡在缓 冲液中，4 8 水浴反应5 小时，观察透明圈产生情况。同样的样品再作s d s p a g e ( 浓缩胶5 ，分离胶1 2 ，胶a ) 。然后比较a 、b 、c 三块胶上壳聚糖酶b 蛋白条带的位置，初步确定酶b 的分子量。 9 一如删“朋s p d 一1 壳聚糖酶基因的克隆 9 1 f c 棚“肌s p d 1 染色体d n a 的提取【4 3 ，4 4 ，5 0 1 。 ( 1 ) d l 接到查氏培养基于3 2 振荡培养4 d ，真空抽滤法除去培养基收获 菌丝体。 ( 2 ) 分别用生理盐水、2 0 m m o l e d t a 、生理盐水洗涤菌丝体，加入少许液 氮磨碎。 ( 3 ) 加5 0 0 1 抽提缓冲液，充分混匀菌丝。 ( 4 ) 加5 0 m2 0 s d s ，3 7 温浴1 h 。 ( 5 ) 加7 5 “l5 m j l n a c l ，充分混匀。 ( 6 ) 加6 5 u 1c t a b ，n a c l ，充分混匀，6 5 温浴1 肚2 0 m i n 。 ( 7 ) 加入等体积( 约7 0 0 脚) 的氯仿异戊醇，充分混匀。1 2 0 0 咖) m 离心1 0 m j n ， 将上清液转移到一个新的e p p e n d o r f 管中。 ( 8 ) 加入等体积的酚、氯仿异戊醇，充分混匀，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，将 上清液转移到另一个新的印p c n d o r f 管中。一共抽提两次以除去蛋白。 ( 9 ) 加入2 倍体积的冰无水乙醇，轻轻混匀至d n a 沉淀下来。1 2 0 0 0 r d m 离心1 0 m i n 。 ( 1 0 ) 用冰的7 0 乙醇洗涤沉淀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 觚n 。 ( 1 1 ) 弃去上清，沉淀真空干燥。用1 0 0 斗l t e 缓冲液溶解d n a 沉淀，加2 m r n a s e a ，3 7 水浴1 5 m i n 以除去r n a 。 ( 1 2 ) 取5 u l 用o 8 的琼脂糖凝胶电泳检测。 9 2 目的基因d n a 片段合成与分析陬5 ”。 根据已知的真菌壳聚糖酶氨基酸序列，利用氨基酸序列多重对比软件 c i u s t w 进行对比分析找出同源区段，设计引物。以d 1 菌株染色体d n a 为模板 进行p c r 扩增，合成目的基因d n a 片段；测序，并翻译成氨基酸序列；然后用 渐_ 江大学硕士论文 氨基酸序列对比软件b l a s t 与n c b i 中已知的真菌壳聚糖酶氨基酸序列进行对 比分析。 p c r 反应体系： p c r 反应程序 d d h 2 05 8 “l 模板d n a3 l 弓i 物l1 0 l ( 1 0 0 n g p 1 ) 引物2l o 弘l ( 1 0 0 n 影砧) 1 0 反应缓冲液1 0 p l m g c l 2 6 “1( 2 5 m m ) d n t pm i x t u r e2 l( 1 0 m m ) 劢印酶l “1 ( 2u ) 共1 0 0 “l 预变性：9 4 变性： 9 5 退火：5 8 延伸：7 2 延长： 7 2 ) m l n l m i n l m i n 3 5c y c l e s 1 m i n j 6 r 血n 浙江大学硕士论义 结果 l 壳聚糖酶产生菌的筛选和鉴定 1 1 富集培养和第一次筛选 土壤样品经过富集培养后，在胶体壳聚糖平板上筛选到一株生长良好且能产 生透明圈的单菌落( 图5 ) ，然后转接到胶体壳聚糖斜面培养基上，采用石蜡油 保种法保存。 图5 即n 缸删h ms p d 1 在胶体壳聚糖平板上形成的透明圈 1 2 菌落形态观察和菌株鉴定 在查氏培养基上观察菌落形态呈松絮状，外观干燥、不透明、质地大而疏松， 菌落中间寄绿色，外周是白色。在光学显微镜下观察，分生孢子梗顶端呈扫帚状 ( 图6 ) 。根据菌落特征和菌株分生孢子头的形态特征将该菌株归为青霉属，命 名为凡n f c f 胁“聊s p d - 1 。 图6 光学显璇镜卜f 观察弼的n n i 麟砌ms p d 1 分生孢子头形状 一 塑坚奎兰堡圭堡塞 2 摇瓶中心心证谢f “卅s pd 1 发酵条