（药理学专业论文）gata6在氟西汀抗mct诱导大鼠肺动脉高压中的作用机制研究.pdf

讨论 2 8 结论 3 l 四 本研究创新性的自我评价 3 2 五 参考文献 3 3 六 附录 综述 3 7 在学期间科研成绩 一4 3 致谢 4 4 个人简介 4 5 中文论著摘要 g a t a 6 在氟西汀抗m c t 诱导大鼠肺动脉高压中的作 用机制研究 刖吾 肺动脉高压 p u l m o n a r ya r t e r yh y p e r t e n s i o n p a i o 是许多心肺血管疾病发生 发展过程中重要的病理生理环节 在这个病理生理过程中 肺血管重构是重要的 病理基础 肺血管重构的特征为肺动脉平滑肌细胞的增殖 迁移及细胞外基质的 异常堆积使肺血管壁增厚 管腔狭窄 顺应性降低 其中血管平滑肌细胞的大量 增殖是肺血管重构的重要病理变化 伴随有许多细胞因子的参与 但其增殖机制 目前尚未阐明 g a t a 结合蛋白6 g 朋阪 6 是唯一表达于血管平滑肌的g a t a 家族转录因 子 主要存在于正常静止的 分化表型的平滑肌细胞 s m o o t hm u s c l ec e l l s s m c s 在损伤 有丝分裂素刺激下 可以参与细胞周期相关基因和平滑肌特异性基因的 调节 在增殖的平滑肌细胞中 g a t a 6 m r n a 水平是下调的 在体内实验中 腺 病毒介导的g a t a 6 基因转染球囊损伤后的颈动脉 能阻止血管损伤形成 这说 明g a t a 6 与血管平滑肌细胞表型调节有关 而过度表达g a t a 6 可以诱导细胞 生长的停滞 这种抑制作用能通过增加细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p 2 1 的表达 及稳定其转录后性质来实现 g a t a 6 基因腺病毒转染平滑肌细胞的微点阵基因芯 片分析 g a t a 6 转录因子也能激活内皮素一l 和血管紧张素l a 受体基因的转录 促使血管平滑肌从收缩表型向合成表型转化 这可能是血管平滑肌细胞发生增殖 对血流动力学和体液刺激的适应性应答 以上研究说明g a t a 6 转录因子是血管 平滑肌细胞增殖的重要调节因子 p 2 1 是细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂之一 具有抑制周期蛋白依赖性激酶 c d k 活性的作用 可以抑制增殖核抗原 p c n a 复制d n a 的活性 在低氧 m c t 诱导的肺动脉高压大鼠中 发现p 2 1 表达下调 p 5 3 通过目标产物p 2 1 发挥 抑制血管重构 增殖的肺动脉平滑肌细胞中 也发现p 2 1 表达下调 我们前期工作发现了选择性5 羟色胺再摄取抑制剂 s e r o t o n i nt r a n s p o r t e r i n h i b i t o r s s s r i s 氟西汀抑制m c t 诱导的肺动脉高压大鼠右心室肥厚和肺血管重 塑 大鼠肺组织和右心室中g a t a 结合蛋白4 g a t a 4 表达增多 氟西汀 f l u o x e t i n e 能够剂量依赖的降低g a t a 4 的蛋白表达 我们认为g a t a 4 参与 氟谣汀抑制m c t 诱导的肺动脉高压的右心室肥厚和肺血管重塑 g a t a 6 和 g a t a 4 同属于g a t a 家族 都能识别g a t a 序列元件 但g a t a 6 是否参与氟 西汀抑制m c t 诱导的肺动脉高压的右心室肥厚和肺血管重塑 目前尚无报道 本研究采用m c t 诱导大鼠慢性肺动脉高压模型 通过给予模型动物不同剂量 氟西汀 观察大鼠肺动脉 肺组织和心脏的g a t a 6 基因及蛋白的表达变化 以 此研究g a t a 6 在氟西汀抑制野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的可能机制 实验材料与方法 一 建立m c t 诱导的慢性p a h 大鼠模型 体重2 0 0 9 左右的雄性w i s t a r 大鼠3 2 只 随机分4 组 c o n t r o l 组 c o n t r 0 1 m c t 组 m c t m c t 氟西汀低剂量组 m c t f 2 和m c t 氟西汀高剂量组 m c t f 1 0 m c t f 2 组和m c t f 1 0 组大鼠每天分别给予氟西汀2 m g k g 和 l o m g k g 灌胃 各组大鼠常规饲养3 周 给药2 1 天后 分别检测肺动脉压力 右 心肥厚指数 病理染色的方法检测肺中小动脉平滑肌增殖指数 用r t p c r 方法 检测肺动脉 肺和心脏g a t a 6 和p 2 1m r n a 变化 免疫组化检测g a t a 6 在肺 组织的表达及部位 用统计分析的方法 比较不同组别各指标差异 探讨g a t a 6 在氟西汀抑制野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的可能机制 二 统计学分析 所有数据以m e a n s d 表示 采用单因素方差分析 p 0 0 5 时认为差异具 有统计学意义 采用s p s s l 3 0 软件进行统计学分析 实验结果 一 氟西汀对m c t 诱导的肺动脉高压大鼠的体重及血流动力学 2 的影响 与对照组相比 m c t 组大鼠的体重明显降低 由2 7 5 6 3 8 7 9 降至2 2 9 9 4 3 2 2 9 p o 0 1 而氟西汀治疗组与m c t 相比无统计学差异 与对照组相比 m c t 组人鼠平均肺动脉压显著升高由1 6 64 3 0 m m h g 到3 0 54 4 9 m m h g p o 0 5 m c t f 1 0 组明显降低m c t 引起的肺动脉压升高 平均肺动脉压降低到 2 2 1 4 4 4 p 0 0 5 m c t f 2 平均肺动脉压比m c t 组低 但没有达到统计学意义 二 氟西汀降低右心指数 与对照组相比 m c t 组大鼠右心指数显著升高由2 6 6 d 2 7 升高到5 4 4 4 9 3 p 0 0 5 m c t f 1 0 组降低了m c t 引起的右心指数 从m c t 组的5 4 44 9 3 降低到4 0 54 5 多 p 0 0 5 三 氟西汀抑制肺血管平滑肌细胞增殖 与对照组相比 m c t 组大鼠肺小动和脉厚度由1 4 7 4 4 1 u m 增加到2 9 8 4 7 0 u m p 0 0 1 m c t f 1 0 组明显降低m c t 引起的血管壁增厚 由2 9 8 4 7 0 u m 降 低到2 2 1 3 2 u m p 0 0 1 四 肺动脉g a t a 6m r n a p 2 1m r n a 的表达 与对照组相比 m c t 组大鼠肺动脉g a t a 一6m r n a 和p 2 1m r n a 表达明显降 低 分别由1 5 7 0 5 3 降到0 6 9 生0 1 6 p 0 0 5 1 7 0 士0 3 7 降到0 7 4 0 2 5 m c t f 2 组增加m c t 引起的g a t a 一6m r n a p 2 1m r n a 表达降低但无统计学差异 m c t f 1 0 组显著增加m c t 引起的g a t a 6m r n a p 2 1m r n a 表达明显降低 p 0 0 1 五 肺组织g a l 隗 6m r n a p 2 1m r n a 的表达 与对照组相比 m c t 组大鼠肺组织g a t a 6m r n a 表达明显下降 由 1 9 5 4 0 6 5 降到0 5 6 士0 18 p o 0 5 m c t f 2 和m c t f 1 0 组均能增加m c t 引 起的g a t a 6m r n a 的下降 分别由o 5 6 士0 1 8 上升到0 9 6 d 0 2 5 0 9 9 士0 2 0 但 只有m c t f 1 0 组有统计学差异 p 0 0 5 与对照组相比 m c t 组人鼠肺组织 p 2 1m r n a 表达明显下降 由1 4 4 4 0 1 2 降到0 2 9 士o 1 1 p o 0 1 m c t f 2 和 3 m c t f 1 0 组均能增加m c t 引起的p 2 1m r n a 的下降 分别由0 2 9 士0 1 1 上升到 0 7 5 4 0 0 9 o 8 9 0 3 6 p 0 0 5 六 右心及左心g a l 除 6m r n a 的表达 与对照组相比 m c t 组大鼠右心g a t a 6m r n a 表达明显下降 由1 4 7 士0 3 9 降到0 3 8 0 1 l p o 0 1 m c t f 2 和m c t f 1 0 组均能增加m c t 引起的g a t a 6 m r n a 的下降 分别由0 3 8 士0 1 1 上升到1 0 2 土0 1 7 p o 0 1 1 2 8 士0 3 8 p o 0 1 左心各组g a t a 一6m r n a 表达均无统计学差异 七 氟西汀对m c t 诱导的大鼠肺组织g a l 陵 6 和p 2 1 蛋白表达 的影响 免疫组织化学研究结果表明 g a t a 6 和p 2 1 阳性细胞着色定位免疫组织化 学研究结果表明 g a t a 6 和p 2 1 阳性细胞着色定位于细胞浆 染色深度不等 为棕黄色至深棕褐色 与对照组相比 m c t 组大鼠肺组织g a t a 6 和p 2 1 阳性细 胞显著减少 g a t a 6 阳性细胞由2 2 8 6 士1 3 7 7 降至3 5 7 1 2 8 8 p o 0 1 p 2 1 由 2 8 6 3 士1 3 7 7 降至2 5 1 1 9 p 0 0 1 m c t f 2 和m c t f 1 0 组g a t a 6 和p 2 1 阳 性细胞显著增加 g a t a 6 干预组分别增加到1 6 7 1 6 9 2 p o 0 1 2 2 4 3 7 6 0 p o 0 1 p 2 1 干预组分别增加到1 5 0 0 士6 7 3 p o 0 1 2 1 6 3 士8 3 4 p o 0 1 结论 氟西汀抑制m c t 诱导的肺动脉平滑肌增殖和右心室肥厚与增加g a t a 6 的表 达有关 并且该作用与其调控p 2 1 的表达相关 关键词 肺动脉高压 g a t a 6 p 2 1 野百合碱 肺动脉平滑肌 右心室 5 羟色 胺 5 羟色胺转运体 4 i n h i b i t i o no np u l m o n a r y h v p e r t e n s i o n n v d e r l e n s l o n i n t r a o d r t u e c r t i i o a n l ratsitiono nd u l m o n aa r t e r i a li nr a t s p u l m o n a r ya r t e r i a lh y p e r t e n s i o n p a h i sac o m m o nd i s e a s e i t l las u s t a i n e d e l e v a t i o ni np u l m o n a r ya r t e r yp r e s s u r e pa p w h i c hm a yl e a du l t i m a t e l yt or i g h t v e n t r i c u l a rf a i l u r e p a th o l o g i c a lf e a t u r e so fp a hi n c l u d ep u l m o n a r yv a s o c o n s t r i c t i o n v a s c u l a rr e m o d e l i n g i n f l a m m a t i o na n dm i c r o t h r o m b o s i s g a t a 6i st h eo n l ym e m b e ro ft h eg a t a f a m i l ye x p r e s s e di nv a s c u l a rs m o o t h m i l s c l ec e l l s v s m c s a n a ly s i so fv a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l sh a sd e m o n s t r a t e d a ni m p o r t a n tr o l eo fg a t a 6i nr e g u l a t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o ni nr e s p o n s et om i t o g e n i co r m e c h a n i c a ls t i m u l a t i o n g at a 一6m r n al e v e l sa r ed o w n r e g u l a t e di np r o l i f e r a t i n g v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s s u g g e s t i n gt h a tg a t a 6e x p r e s s i o nl i n k e dt ot h ec e l l c y c l ei nt h e s ec e l l sa n dp l a y sa sa ni m p o r t a n tr e g u l a t o ro ft h ev s m cp h e n o t y p e m o r es p e c i f i c a l l y f o r c e de x p r e s s i o no fg a t a 6i nv a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s i n d u c e sg r o w t ha r r e s tt h r o u g hm e c h a n i s mi n v o l v i n ge n h a n c e de x p r e s s i o no ft h e c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o rp 2 1 i nv i v o a d e n o v i r u s m e d i a t e dg e n et r a n s f e ro f g a t a 6i nb a l l o o n i n j u r e dc a r o t i da r t e r i e sp r e v e n t e dv e s s e ll e s i o n sa s s o c i a t e d 航n l v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l lp h e n o t y p i cm o d u l a t i o n t h e s es t u d i e ss u g g e s tt h a t g a t a 一6i sa ni m p o r t a n tr e g u l a t o ro fv a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l lp r o l i f e r a t i o na n d s u b s e q u e n tv a s c u l a ri n j u r y i tw i l lb eo fi n t e r e s tt od e t e r m i n ew h e t h e rg a t a 6 c o n t r o l sc e l lc y c l ea r r e s ti no t h e rc e l lt y p e si nw h i c hi ti se x p r e s s e do ri fs u c hr e g u l a t i o n i su n i q u et ov a s c u l a r sm o o t hm u s c l ec e l l s w eh a v er e p o r t e dt h a tf l u o x e t i n ep r o d u c e di n h i b i t i o no np u l m o n a r ya r t e r ya n d r i g h tv e n t r i c u l a rr e m o d e l i n gb ym o n o c r o t a l i n ei nr a t s i sr e l a t i o nw i t hg a t a 4 e x p r e s s i o n w ei n t e n dt oe x p l o r et h ep a t h o g e n e s i so fp a hi n d u c e db ym c ti n r e l a t i o nt og 蓖r a 6 5 m e t h o d s m o n o c r o t a l i n ei su s e dt oe s t a b l i s ht h em o d e lo fp u l m o n a r yh y p e r t e n s i o ni nr a t s r a t sw e r et r e a t e dw i t hd i f f e r e n td o s eo ff l u o x e t i n eb yg a v a g ef o rt h r e ew e e k s t h e n p u l m o n a r yh a e m o d y n a m i cm e a s u r e m e n t r i g h t v e n t r i c u l a r i n d e x l u n g t i s s u e m o r p h o l o g i c a li n v e s t i g a t e g a t a 一6a n dp 21 e x p r e s s i o n w a sd e t e c t e db yp c r s t a t i s t i c sw e r em a d et oc o m p a r et h e s ei n d e x e si nd i f f e r e n tg r o u p s a n di n v e s t i g a t et h e m e c h a n i s mo fg a t a 6o ff l u o x e t i n ep r o d u c e di n h i b i t i o no np u l m o n a r ya r t e r ya n d r i g h tv e n t r i c u l a rr e m o d e l i n gb ym o n o c r o t a l i n ei nr a t s r e s u l t s e f f e c to ff l u o x e t i n eo nm o n o c r o t a l i n ei n d u c e dp h t w e n t y o n ed a y sa f t e rm c tt r e a t m e n t t h eb o d yw e i g h tw a ss m a l l e r i nt h e m c t t r e a t e dg r o u p s h o w e v e r n od i f f e r e n c e si nb o d yw e i g h tw e r ed e t e c t e db e t v e e n t h em c tg r o u pa n df l u o x e t i n et r e a t m e n tg r o u p s pa p r vw e i g h ta n dr v lw e r e h i g h e ri nm c tg r o u pt h a nc o n t r o lg r o u p s a n df l u o x e t i n elo m g k gc o u l dr e d u c e dt h e r va n dr v is i g n i f i c a n t l y w i t hn os i g n i f i c a n c eo ff l u o x e t i n e2 m g k gt r e a t m e n t e f f e c to ff l u o x e t i n eo np u l m o n a r ya r t e r i e sr e m o l d i n go fr a t s m c t t r e a t e dr a t sh a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dm e d i a lw a l lt h i c k n e s so fm u s c u l a r p u l m o n a r ya r t e r i e s v e s s e l d i a m e t e r o f5 0 lo o p m c o m p a r e dw i t hc o n t r o lr a t s f l u o x e t i n elo m g k gr e d u c e dt h em c t i n d u c e di n c r e a s ei nm e d i a lw a l lt h i c k n e s s e f f e c to ff l u o x e t i n eo ng a t a 一6a n dp 2 1g e n ee x p r e s s i o ni n p u l m o n a r ya r t e r yo fr a t s p c rw a su s e dt od e t e r m i n et h ee x p r e s s i o no fg a t a 6a n dp 21m r n a t h e r e s u l t ss h o w e dt h ee x p r e s s i o n so fg a t a 6a n dp 21w e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n m c t g r o u pt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p p 0 0 5 e x p r e s s i o n o fg a t a 6 m r n a a n dp 21m r n aw e r eh i g h e rs i g n i f i c a n t l yi nm c t f 10g r o u p p 0 01 b u tn o ti n m c t f 2g r o u p 6 e f f e c to ff i u o x e t i n eo ng a t a 一6a n dp 21 g e n ee x p r e s s i o n i n p u l m o n a r y t i s s u eo fr a t s p c rw a sa l s ou s e dt od e t e r m i n et h ee x p r e s s i o no f g a t a 一6a n dp 21m r n a t h e r e s u l t ss h o w e dt h ee x p r e s s i o n so fg a t a 6a n dp 21w e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n m c t g r o u pt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p p o 0 5 e x p r e s s i o no fg a t a 一6 m r n a a n dp 21m r n aw e r eh i g h e rs i g n i f i c a n t l yi nm c t f10g r o u p p 0 0 5 b u tn o ti n m c t f 2g r o u p e f f e c to ff l u o x e t i n eo ng a t a 6 g e n ee x p r e s s i o ni nr i g h tv e n t r i c l e o f r a t s p c rw a su s e dt od e t e r m i n et h ee x p r e s s i o no fg a t a 6a n dp 21m r n a t h er e s u l t s s h o w e dt h ee x p r e s s i o n so fg a t a 一6w a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nm c t g r o u pt h a nt h a t i n t h ec o n t r o l g r o u p p 0 01 e x p r e s s i o n o fg a t a 6 m r n aw e r e h i g h e r s i g n i f i c a n t l y b o t hi nm c t o f l 0g r o u p p 0 0 1 a n di nm c t f 2g r o u p p 0 0 5 e f f e c to ff l u o x e t i n eo ng a t a 一6a n dp 21e x p r e s s i o ni nl u n g t i s s u e so fr a t s i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yr e s u l t ss h o w e dt h a tc o m p a r e dt oc o n t r o lg r o u p g a t a 6 a n dp 21 p r o t e i ne x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nl u n gt i s s u e so fr a t si nm c t g r o u p c o m p a r e d t om c t g r o u p g a t a 一6a n d p 21p r o t e i ne x p r e s s i o np o s i t i v i t yr a t e i nm c t f 2g r o u pa n dm c t f10g r o u pw e r ei n c r e a s e d c o n c l u s i o n s s r if l u o x e t i n ep r o t e c t sa g a i n s tm c t i n d u c e dp u l m o n a r ya r t e r yr e m o d e l i n ga n d r i g h tv e n t r i c l eh y p e r t r o p h y w h i c hm i g h tb er e l a t e dt oam e c h a n i s mo fg a t a 6 e x p r e s s i o ni n c r e a s e k e y w o r d s 7 m o n o c r o a r t e r y r i g h t 英文缩略语 英文缩写 英文全称中文全称 p a h p u l m o n a r ya r t e r yh y p e r t e n s i o n 肺动脉高压 5 h t 5 h y d r o x y t r y p t a m i n e 5 一羟色胺 5 h t ts e r o t o n i nt r a n s p o r t e r5 羟色胺转运体 f l uf l u o x e t i n e氟西汀 s s r i ss e r o t o n i nt r a n s p o r t e ri n h i b i t o r s 5 一羟色胺转运体抑制剂 g a t a 6g a t ab i n d i n gp r o t e i n6g a t a 6 结合蛋白 细胞周期蛋白依赖激酶 p 2 1 c y c l i n d e p e n d e m i 衄i t o r 抑制剂 m c tm o n o c r o t a l i n e野百合碱 p a s m c s p u l m o n a r ya r t e r ys m o o t hm u s c l ec e l l s 肺动脉平滑肌细胞 r v r i g h tv e n t r i c l e 右心室 l vl e f tv e n t r i c l e左心室 s p s e p t u m 室间隔 r v i r i g h tv e n t r i c u l a ri n d e x 右心指数 p a p p u l m o n a r ya r t e r i a lp r e s s u r e 肺动脉压 s a p s y s t e ma r t e r i a lp r e s s u r e 体循环动脉压 9 刖舌 g a t a 6 是唯一表达于血管平滑肌的g a t a 家族转录因子 主要存在于正常 静止的 分化表型的平滑肌细胞 在损伤 有丝分裂素激下 平滑肌细胞增殖 g a t a 6 m r n a 水平下调的 提示g a t a 一6 的表达与细胞周期相关 且是血管平滑 肌表型的重要调控因子 而过度表达g a t a 6 可以诱导细胞生长的停滞 这种抑 制作用能通过增加细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p 2 1 的表达来实现 在体内实验 中 腺病毒介导的g a t a 6 基因转染球囊损伤后的颈动脉 能阻止血管损伤形成 g a t a 6 基因腺病毒转染平滑肌细胞的微点阵基因芯片分析 g a r a 6 转录因子也 能激活内皮素 1 和血管紧张素l a 受体基因的转录 促使血管平滑肌从收缩表型向 合成表型转化 这可能是血管平滑肌细胞发生增殖对血流动力学和体液刺激的适 应性应答 这些研究说明g a t a 6 转录因子是调节血管平滑肌细胞增殖的重要调 节因子 肺动脉高压 p u l m o n a r ya r t e r yh y p e r t e n s i o n p a n 是许多心肺血管疾病发生发 展过程中重要的病理生理环节 肺血管重构现象是肺动脉高压的一个基本病理学 特征 肺血管重构成为治疗的标靶已经得到学术界的公认 因此 围绕血管重构 的发生发展过程 调控干预因素的探讨成为了心肺血管领域重要的学术研究热点 肺血管重构的特征为肺动脉平滑肌细胞的增殖 迁移及细胞外基质的异常堆积使 肺血管壁增厚 管腔狭窄 顺应性降低 其中血管平滑肌细胞的大量增殖是肺血 管重构的重要病理变化 伴随有许多细胞因子和生长因子的参与 如内皮素 一1 e n d o t h e l i n 1 e t 1 5 羟色胺 5 h y d r o x y t r y p t a m i n e 5 h t 血栓烷a 2 t h r o m b o x a n ea 2 t x a 2 等多种生长因子都可促进肺小动脉血管平滑肌细胞的增 殖 但其增殖机制目前尚未阐明 1 0 5 h t 为一种促有丝分裂素 由肺动脉平滑肌细胞膜上的5 羟色胺转运体 s e r o t o n i nt r a n s p o r t e r s e r t 介导进入肺动脉平滑肌细胞 p u l m o n a r ya r t e r ys m o o t h m u s c l ec e l l s p a s m c s 并通过多种信号转导途径引起p a s m c s 增生肥大 引起 肺动脉血管壁构型重建 选择性5 羟色胺再摄取抑制剂 s s s 是s e r t 的阻断 剂 主要包括氟西汀 舍曲林 帕罗西汀 西肽普兰等 人体外实验发现应用s s r i s 可以抑制由5 h t 引起的牛肺动脉平滑肌细胞的增殖 我们采用野百合碱诱导大鼠肺动脉高压动物模型 m c t 可引起肺血管内皮细 胞损伤 炎性细胞浸润 进而肺血管平滑细胞增生肥大 血管壁构型重建 从而 促进肺动脉高压的发生发展 此模型中 损伤的内皮细胞减少了5 h t 的再摄取 并激活血小板释放5 h t 血浆中5 h t 浓度升高 而5 h t 作为一种促细胞有丝 分裂素 通过5 h t 转运体s e r t 转运至肺血管平滑肌细胞内促进细胞增殖 导致 肺血管构型重建 我们前期工作发现了氟西汀抑制m c t 诱导的右心室肥厚和肺血管重塑 大鼠 肺组织和右心室中g a t a 结合蛋白4 g a l r a 4 表达增多 氟西汀 f l u o x e t i n e 能够剂量依赖的降低g a t a 4 的蛋白表达 但m c t 诱导的大鼠肺动脉 肺组织和 右心室中g a t a 结合蛋白6 g a t a 6 的表达如何 氟西汀能否影响g a t a 6 的 表达 目前尚无报道 因此 本实验拟用m c t 诱导的大鼠肺动脉高压模型 检测 大鼠肺动脉 肺组织和右心中g a t a 6 和p 2 1 的基因和蛋白表达 以研究g a t a 6 在氟西汀抑制m c t 诱导的右心室肥厚和肺血管重塑作用中的机制 实验材料与方法 一 实验材料与试剂 1 实验动物 雄性w i s t a r 大鼠4 0 只由中国医科大学实验动物部提供 中国医大学实验动 物中心 实验动物合格证号 辽实动字0 3 4 号 2 药品与试剂 1 野百合碱 2 氟西汀 美国s i g m a 公司 武汉远程公司 3 无水乙醇 4 戊巴比妥钠 5 其它试剂为分析纯 3 实验仪器 1 液氮罐 2 多导生理记录仪 3 电动匀浆器 4 p 2 3 i ds t a t h a m 压力换能器 5 石蜡切片机 6 医用微波炉 7 光学显微镜 4 试剂的配置 上海鑫达精细化工有限公司 美国s i g m a 公司 中国成都y d s 1 0 型 日本n i h o nk o n d o nr 6 0 0 0 德国h e i d o l p h d i a x9 0 0 日本n i h o nk o n d o n 德国l e i c a1 5 1 6 中国格兰仕 日本o l y m p u sb x 4 0 1 蛋白提取液 5 0 m m o l lt r i s h c l 1 5 0m m o l 1n a c i 1 n p 4 0 0 5 脱氧胆 酸钠 o 1 s d s p h 7 5 现用现加lm m o l lp m s f 2 考马斯亮兰g 2 5 0 溶液 考马斯亮兰g 2 5 00 4 克 9 5 乙醇1 0 0 m l 8 5 磷 酸2 0 0 m l 加超滤水至2 0 0 0 m l 过滤后使用 3 b s a 标准液 b s a l0 m g 超滤水2 0i i l l 制成0 5 m g m lb s a 标准液 4 凝胶储备液 3 0 a c r b i s e 丙烯酰胺2 9 克 双体甲叉双丙烯酰胺l 克 加超滤水至1 0 0 m l 5 1 0 a p s o 1 克过硫酸铵 加超滤水至lm l 4 度保存 一周内使用 6 1 0 s d s l 克s d s 1 0m l 超滤水 不溶时 可加热5 0 度左右助溶 7 o 5 m i r i s h c i p h 6 8 3 0 3 克t r i s 加d d n 2 0 溶解后 用h c l 调p h 至 6 8 加超滤水到5 0 m l 8 1 5 mt r i s h c l p h 8 8 9 0 8 9 t r i s 加d d h 2 0 溶解后 用h c i 调p h 至8 8 加超滤水到5 0 m l 9 s x r s b 1 8 9 克 i r i s 5 克s d s o 1 2 5 克溴酚蓝 2 5m l 甘油 b e t a 巯 基乙醇用时现加 按2 5 比例 用h c l 调p h6 8 1 2 1 0 1 0 x p b s n a c l4 2 5 克 n a 2 h p 0 4 1 2h 2 01 5 4 9 n a h 2 p 0 4 2 h 2 01 4 9 调p h 到7 2 7 4 加超滤水到5 0 0m l 1 1 1 0 x 电泳缓冲液 t r i s 7 5 8 克 甘氨酸3 6 克 s d s2 5 克 超滤水定容到 2 5 0 m l 1 2 考马斯亮蓝r 2 5 0 r 2 5 00 2 5 克 甲醇5 0m l 冰乙酸4 0m l 加超滤水到 1 0 0m l 1 3 脱色液 乙酸5 0i i l l 甲醇2 2 5m l 可用乙醇 超滤水5 0 0m l 1 4 1 0 x 丽春红 2 0 m 1 2 丽春红 0 4 克 3 0 氯乙酸 6 克 3 0 磺基水 杨酸 6 克 用时加入9 倍的超滤水 1 5 1 0 x 转膜缓冲液 t r i s 2 9 克 甘氨酸1 4 5 克 s d s1 8 5 克 加水到5 0 0m l 用时取1 0i i l l 加2 0i i l l 甲醇 加7 0m l 超滤水 1 6 洗膜液 1 0 x p b s5 0m l 4 5 0m l 超滤水 o 5m lt w e e n 2 0 1 7 5 封闭液 1 克脱脂奶粉 2 0m l 洗膜液 1 8 杂交液 b s a0 5 克 洗膜液5 0m l 4 度保存 1 9 1 0r e t o o l 1p m s f 溶液 取0 0 1 7 4 2 克p m s f 溶于1 0m l 超滤水中 分装 后一2 0 度保存 2 0 配胶的浓度和方法 4 浓缩胶 1 0m 1 3 0 a c r b i s 0 5 m 嘣s h c i p h 6 8 1 0 s d s d d h o t e m e d 1 0 a p s 8 分离胶 1 0m 1 3 0 a c r b i s 1 5 mt r i s h c i p h 8 8 1 0 s d s 1 3 1 3 2m l 2 5 2 m l 0 1m l 6 m l 1 0 山 5 0m 2 6 m l 2 5m l o 1m l d d h 2 0 t e m e d l o a p s 2 3 h a s n s e n 甲矾苏木精的配制 a 液 苏木精 l g 无水乙醇 1 0 m l b 液 钾矾 2 0 9 蒸馏水 2 0 0 m l c 液 高锰酸钾 l g 4 7 5 i m 1 0 山 5 0 山 蒸馏水1 6 三液分别溶化后 将a 液倒入b 液 再加入c 液3 m l 充分搅拌均匀后加热 至沸腾 1 分钟左右 将容器置于冷水中使其迅速冷却 此液配后即可使用 2 4 柠檬酸缓冲液 0 0 1 m p h 6 0 a 液 柠檬酸1 0 5 9 蒸馏水5 0 0 m lb 液 柠檬酸钠1 4 7 9 蒸馏水5 0 0 m l 工作液 a 液9 m l b 液4 1 m l 加蒸馏水至5 0 0 m l 现用现配 2 5 1 盐酸酒精 l m l 浓盐酸 加7 5 酒精至1 0 0 m l 2 6 g a t a 6 1 4 0b p 上游 a c g a g a t g g c a c c g g t c 久r r a 下游 t g t g a c a g t r g g c a c a g g a c a g 2 7 g a p d h 2 0 4b p 上游 a g t t c a a c g g c a c a g t c a a 下游 c g g a g a t g a t g a c c c t m 2 8 p 2 1 1 6 6b p 上游 g a g a t c a g g a g t t c a a g a c c 下游 t t g g c t c a c t g c a a c c t c c 二 实验方法 一 肺动脉高压大鼠模型建立及动物分组 1 4 体重2 0 0 9 左右的雄性w i s t a r 大鼠3 2 只 随机分4 组 对照组 c o n t r 0 1 m c t 组 m c t m c t 氟西汀低剂量组 m c t f 2 和m c t 氟西汀高剂量组 m c t f 1 0 m c t 组 m c t f 2 组和m c t f 1 0 组人鼠一次性腹腔内注射m c t6 0m g k g c o n t r o l 组注射同等剂量的溶剂 m c t f 2 组和m c t f 1 0 组大鼠每天分别给予氟西汀 2 m g k g 和10 m g k g 灌胃 m c t 组和c o n t r o l 组大鼠每天给予等量溶剂灌胃 各组 大鼠常规饲养3 周 二 肺动脉压和体循环压测定 给药2 l 天后戊巴比妥钠4 0m g k g 麻醉大鼠 仰位固定于手术板上 正中切 开颈部皮肤 钝性分离皮下组织及肌层 剥离颈动脉及右颈外静脉 将与压力换 能器连接并充满肝素盐水的p e 2 5 0 管插入颈动脉 压力换能器通过载波放大器与 多导生理记录仪相连 所记录压力代表系统循环血压 将肺动脉插管内充满肝素 盐水 插入右侧颈外静脉 插入过程中保持管的弧度向下方 并根据插管的标记 判断到达心脏部位时 将插管左旋并向前推进 当压力基线上升并出现肺动脉波 形时 开始描记肺动脉压 三 右心室肥厚指数的测定 将大鼠处死取出心脏 仔细分离右心室 f i g h tv e n t r i c l e r v 和左心室 室间隔 1 e rv e n t r i c l ep l u ss e p t u m l v s 滤纸吸水后 分别称量r v 和l v s 的重量 r v l v s a p 为右心指数 n g h tv e n t r i c u l a ri n d e x r v 0 四 肺组织形态学检测 取大鼠右肺下叶固定于4 的多聚甲醛 制成5 岬厚的肺组织石蜡切片进行 h e 染色 l 石蜡包埋 1 在4 多聚甲醛中固定标本1 2 小时 2 梯度酒精6 0 7 0 8 0 9 0 1 分别脱水8 小时 3 1 0 0 酒精i i i 脱水各