（环境工程专业论文）外加砷源对土壤微生物数量及生态的影响研究.pdf

摘要 摘要 关于砷污染土壤的研究国内外报道都很多，但是对于# l - j n 砷源土壤的研究的报道则 很少。本研究主要采用室内模拟的方式，添加外源砷的质量分数为0 、5 0 0 m g k g ， 1 0 0 0 m g k g ，2 0 0 0 m g k g 等，研究了外加源砷对土壤微生物数量的变化、土壤微生物生 态的变化，并与调查土壤作比较。同时从驯化土壤中筛选出抗砷优势菌，为微生物修复 技术提供理论依据。 外源砷驯化土壤中的微生物数量随着添加砷的量增加而减少。其中自养微生物先随 着添加的砷的浓度的增加而减少，反映出土壤中的砷会对自养微生物形成抑制和毒害作 用，随后随着砷的浓度增加而上升；异养微生物则是呈波浪形变化，表明低浓度砷对异 养微生物有刺激生长作用，高浓度砷对异养微生物有抑制作用。 对砷污染土壤的调查结果表明，在无砷的有机培养基中，茶场土壤的细菌数比受砷 污染区的土壤多。在含砷的培养基中，砷污染土壤的细菌数比茶场土壤的多，特别是含 砷较高的培养基时，茶场土壤的微生物数量大大下降，而砷污染区土壤中本身含有大量 的抗砷耐砷菌，砷更成为了某些抗砷菌生长所必需的元素，因此微生物的数量大大增加。 通过分子生物学的实验手段，研究了步 l , j i l 不同梯度的砷源对土壤微生物的生态影 响。实验结果表明：土壤中绝大多数微生物对低浓度砷有一定的耐受性，而个别种群对 砷污染较为敏感，种群数量大大降低。随着土壤中砷浓度的增加，对土壤中微生物基因 多样性的影响也逐渐增强，有些条带明显变暗或消失，说明砷污染对土壤微生物种群有 明显的毒害作用。外加砷源达到2 0 0 0 m g k g 时，有些条带明显变亮，且出现了新的条带， 说明出现了新的抗砷优势菌群。各处理土壤中占优势的菌种仍普遍存在，但不同泳道之 间条带的亮度变化明显，表明土壤中微生物的数量存在着一个随砷污染加强而变化的现 象。 从外加高浓度砷来驯化的土壤中筛选出的菌株b 、c 、f 、n 、p 属于节杆菌属，e 、 k 属于从毛单胞菌科，i 、l 属于产碱杆菌，j 属于微球菌。 综上所述，外源砷对土壤微生物的数量和生态都有明显的影响。筛选抗砷性优势菌， 对于微生物修复受砷污染土壤有实际的意义。 关键词：外加砷源；微生物数量；微生物生态；分子生物学 广东t 业大学工学硕士学位论文 a b s t r a c t t h e r ei sag r e a td e a lo fr e s e a r c ha b o u ta r s e n i cc o n t a m i n a t e ds o i l i nt h ew o r l d ，b u t r e s e a r c ha b o u ta p p l i e da r s e n i cs o i li saf a tl o t t h i ss t u d ym o s t l ye m p l o y e di n d o o r s i m u l a t i o nm e a n s ，a d d i n g4d i f f e r e n ta sc o n c e n t r a t i o n sr a n g i n gf r o m0t o2 0 0 0 m g k gi ns o i l s ， w o r k i n go v e rt h ee f f e c t so ns o i lm i c r o o r g a n i s m s ，t h eb i o l o g i c a le f f e c t so fs o i lm i c r o o r g a n i s m s ， a n dc o m p a r i n gw i t hi n v e s t i g a t e ds o i l w h i l ea r s e n i c r e s i s t e ds t r a i nc a nb ef i l t r a t e df r o mt a m e s o i l ，i tc a np r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h eb i o r e m e d i a t i o nt e c h n o l o g y m i c r o b i a lp o p u l a t i o ni nt h ea p p l i e da r s e n i ct a m es o i lr e d u c e da l o n gw i t ht h em a s so f a r s e n i c a d d i n g t h ea m o u n to fa u t o t r o p h i cm i c r o o r g a n i s m sr e d u c e da l o n gw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no fa r s e n i ca d d i n g ，i ti n d i c a t e dt h a ta r s e n i ci nt h es o i lc o u l dr e s t r a i na n dp o i s o n t h ea u t o t r o p h i cm i c r o o r g a n i s m s ，a n dt h e nt h ea m o u n to f a u t o t r o p h i cm i c r o o r g a n i s m sr i s i n gu p a l o n gw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fa r s e n i c ；t h ea m o u n to fh e t e r o t r o p h i cm i c r o o r g a n i s m sv a r i e d l i k ew a v e ，i ti n d i c a t e dt h a tl o wc o n c e n t r a t i o no fa r s e n i cc o u l ds t i m u l a t et h eg r o w i n go f h e t e r o t r o p h ! cm i c r o o r g a n i s m sa n dh i g h c o n c e n t r a t i o no fa r s e n i cc o u l dr e s t r a i nt h e h e t e r o t r o p h i cm i c r o o r g a n i s m s t h ei n v e s t i g a t i o no fa r s e n i cc o n t a m i n a t e ds o i li n d i c a t e dt h a t ，i nt h eo r g a n i cc u l t u r e m e d i u mw i t hn oa r s e n i c ，t h em i c r o b i a lp o p u l a t i o no ft e ap l a n t a t i o ns o i li sm o r et h a nt h a ti n a r s e n i cc o n t a m i n a t e ds o i l i nt h ec u l t u r em e d i u mw i t ha r s e n i c ，t h em i c r o b i a lp o p u l a t i o ni n a r s e n i cc o n t a m i n a t e ds o i li sm o r et h a nt e ap l a n t a t i o n e s p e c i a l l yi nt h ec u l t u r em e d i u mw i t h h i g hc o n c e n t r a t i o no fa r s e n i c ，t h em i c r o b i a lp o p u l a t i o no ft e ap l a n t a t i o nd e c r e a s e do b v i o u s l y b u tt h em i c r o b i a lp o p u l a t i o ni nt h ea r s e n i cc o n t a m i n a t e ds o i lw a sr i s i n gu po b v i o u s l y , t h a t s b e c a u s et h e r ew e r e l a r g en u m b e r so fa r s e n i c r e s i s t e dm i c r o o r g a n i s m si nt h ea r s e n i c c o n t a m i n a t e ds o i la n da r s e n i cb e c a m et h en e c e s s a r ye l e m e n to fs o m ea r s e n i c r e s i s t e d m i c r o o r g a n i s m si nt h e i rg r o w i n g t h ea r t i c l es t u d i e dt h ee f f e c to fs o i lm i c r o b i a lb i o l o g yf r o md i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f a p p l i e da r s e n i cb ym o l e c u l a rb i o l o g ye x p e r i m e n t a lm e t h o d s t h er e s u l to ft h ee x p e r i m e n t i n d i c a t e d ：a l m o s tm i c r o o r g a n i s m si 1 1t h es o i lc o u l dr e s i s ta r s e n i c a n di n d i v i d u a lp o p u l a t i o ni s s e n s i t i ；c et oa r s e n i c c o n t a m i n a t i o ns ot h a tt h ep o p u l a t i o nc a m ed o w no b v i o u s l y a l o n gw i t h t h ec o n c e n t r a t i o no fa r s e n i ca d d i n g ，t h ee f f e c tf o rd i v e r s i t yo fs o i lm i c r o b i a lg e n ee n h a n c e d ， i i a b s t r a c t = 暑暑= 暑= 詈詈詈! 鲁岛i i 詈詈詈詈詈皇葛詈皇詈詈暑暑= 昌暑喜篁= 詈昌暑= 暑皇葛皇詈皇暑皇喜置鲁詈皇量昌皇詈暑詈詈暑= = 皇暑詈喜暑暑暑昌篁鲁暑暑暑皇詈葛薯皇墨墨置暑詈詈詈皇 s o m eb a n d sb e c a m ed a r ko rd i s a p p e a r e d ，i n d i c a t i n gt h a ta r s e n i c c o n t a m i n a t e dh a do b v i o u s t o x i ca c t i o nt om i c r o b i a lp o p u l a t i o ni nt h es o i l w h e nt h ea r s e n i cc o n c e n t r a t i o nr o s et o 2 0 0 0 m g k g ，s o m eb a n d sb e c a m eb r i g h t ，a n ds o m en e wb a n d sa p p e a r e d ，i n d i c a t i n gt h a tn e w a r s e n i c r e s i s t e df l o r aa p p e a r e d p r e p o n d e r a n tf l o r ae x i s t e di ne a c ht r e a t e ds o i lp e r v a s i v e l y , b u t t h ev a r i e t yo fb a n d s b r i g h t n e s si nd i f f e r e n tt r a c kw a so b v i o u s ，i n d i c a t i n gt h a tt h ep o p u l a t i o n o fm i c r o o r g a n i s m si nt h es o i lw a sr i s i n gu pa l o n gw i t ht h ei n t e n s i t yo fa r s e n i c - c o n t a m i n a t e d s c r e e n i n gf r o mt a m es o i lw i t hh i g hc o n c e n t r a t i o na r s e n i ca p p l i e d ，s t r a i nb 、c 、f 、n 、 pb e l o n g e dt oa r t h r o b a c t e rs p ，a n de 、kb e l o n g e dt oc o m a m o n a d a c e a eb a c t e r i u m ，a n di 、l b e l o n g e dt oa l c a l i g e n e ss p ，a n djb e l o n g e dt om i c r o c o c c i n e a eb a c t e r i u m i ns u m m a r y ，a p p l i e da r s e n i ch a do b v i o u se f f e c tt ot h ep o p u l a t i o na n db i o l o g yo f m i c r o o r g a n i s m si nt h es o i l t h ef i l t r a t i o no ft h ea r s e n i c - r e s i s t e ds t r a i nh a da c t u a lm e a n i n gt o u s i n gm i c r o o r g a n i s m st or e m e d ya r s e n i c c o n t a m i n a t e ds o i l k e y w o r d s ：a p p l i e da r s e n i c ；p o p u l a t i o no fm i c r o o r g a n i s m s ；m i c r o b i a lb i o l o g y ；m o l e c u l a r b i o l o g y i i i 独创性声明 独创性声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师的 指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。 本学位论文是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下，在广东省微生物研究 所的老师指导下完成的，论文成果归广东工业大学及广东省微生物研究所共同所有。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。 4 5 一：缘匆鳟 论文作者签字： 丝艨 2 0 0 8 f 月弓口日 第一章绪论 1 1 土壤砷污染 第一章绪论 砷是一种类金属元素，在地壳中的丰度为1 8 m g k g ，元素丰度排序为第2 0 位。砷 是自然界分布广泛的元素，含砷矿物达2 4 0 多种，世界自然土壤的平均砷含量为 9 3 6 m g k 苎【l 】，在环境科学领域中属于重金属范畴。砷是入和动物的必需元素，同时砷及 其化合物也是致癌、致畸变的物质，当人体摄入超过一定剂量的砷就会引起急性或慢性 中毒，如长期饮用含砷量0 8 m g l 的水或每日进食中含砷近3 m g 达2 3 周可引起中毒【：1 。 砷已被国内外列为优先控制污染物，在我国污灌引起的土壤污染中，砷居第5 位。 砷的异常地球化学行为和人类的生产活动所释放到环境中的砷已严重威胁到人类，土壤 的砷污染和防治一直是国际上的研究难点和热点领域。 1 1 1 土壤中砷的形态 大量研究表明，土壤中的砷大多为无机砷，包括三价砷( a s ( i i i ) ) 和五价砷( a s ( v ) ) ，有机砷一般包括m m a ( 甲基砷酸) 、d m a ( 二甲基砷酸) 、t m a ( 三甲基砷) ， 占土壤总砷的比率极低【3 】。有机砷中除了砷化氢衍生物外一般毒性较弱。无机砷有剧毒， 其中三价砷a s ( i i i ) 较五价砷a s ( v ) 毒性高约1 0 0 倍【4 】，而且a s ( i i i ) 移动性强，更 易危害环境。砷化物可从呼吸道、食道和皮肤接触进入人体。进入人体的三价砷化物能 和硫基作用，抑制蛋白酶的活性并致癌；五价砷其结构似磷化物，能干扰人体代谢【5 t s - 。 1 1 2 土壤砷的来源 砷是自然界分布十分广泛的一种元素。翁焕新等人f f 调查了我国4 0 9 5 个自然土壤样 本的含砷量，经过统计分析，自然土壤砷的背景值约为1 1 0 m g k g 。造成土壤污染的高 浓度a s 主要来源于各种各样的人为源。一是制造业，a s 2 0 3 是制造工业中作为原料舡 使用的主要形态，包括陶瓷和玻璃，电子产品，涂料，去污剂，化妆品，烟花爆竹等的 制造【8 】。砷还作为一个微量成分做成c u a s 合金增强金属的防腐性 9 1 。在采矿业中，a s 矿作为p b ，z n ，c u 和a u 矿伴生成分的舡，会随着采矿和冶炼过程，造成大气、土壤， 广东工业大学工学硕士学位论文 沉积物、河流和地下水的污染，由此造成的农业土壤中a s 污染有过大量的报道 z o a i 。煤 炭中含a s2 - 8 2 m g k g ，但褐煤中可高达1 5 0 0 m g k g ，一方面它们在露天堆放中会直接释 放一部分到大气中；另一方面在使用中产生a s 污染，如火电厂燃煤产生的飞灰和灰渣 中含有大量的舡，特别是粒径较小的飞灰【1 2 - 1 4 。在制革厂，亚砷酸钠曾被用来作为动物 皮毛处理的杀虫剂，使用后的废弃液排放到土地上，可造成表层土和亚表层土分别高达 4 3 5 和1 0 1 0 m g k g 的污染【1 5 】。在林业中，由于砷化物可用作木材保护的优良性能，特别 是c c a ( c o p p e rc h r o m a t ea r s e n a t e ，砷铬酸酮) ，全球的使用量每年以1 2 的比率增 长，而在美国木材保护占了1 9 9 0 年所需a s 量的7 0 ，我国每年大约生产2 4 0 0 0 万立 方米的木材，如果都用c c a 处理，需要c c a1 3 万吨年【1 6 t t 。在农业中，砷化物曾经或 正被广泛用于农业中做杀虫剂、消毒液、杀菌剂和除草剂；另外一些化肥中也含有一定 量的a s 。 1 1 3 砷污染的危害 砷俗称砒霜，是一种有毒并致畸、致突变、致癌的化学元素。长期暴露在砷的污染 环境下可导致慢性砷中毒，甚至造成肝癌、皮肤癌等流行性地方病，严重损害人体健康。 目前世界受高砷危害的国家和地区主要有孟加拉国、印度、智利、泰国、美国和中国的 湖南、台湾、山西部分地区。在印度西孟加拉邦1 6 个区中有6 个区发现砷中毒，面积 3 7 4 9 3 k m 2 ，病区人1 ：33 4 0 0 万，其中8 0 万人口处在高砷饮水的暴露之中 1 s l 。日本政府已 将砷中毒与铅中毒、水俣病、骨痛病等严重污染病相并列，宣布为第四公害病。2 0 0 0 年湖南郴州炼砷区就因废渣污染井水连续发生了两次大规模的人群砷中毒事件，导致 2 2 0 多人住院治疗，引起国务院的高度重视。2 0 0 1 年，中国环境报报道，广西河池五好 矿发生严重的砷污染问题，导致1 1 5 人急性砷中毒。2 0 0 1 年，广东清远市也发生了一 起集体砷中毒事件。另外，部分国家和地区由于砷的背景值较高也可以引起砷的毒害。 砷在土壤中不易迁移，对土壤的污染在世界上许多地区都很普遍。例如美国超级基 金计划1 2 2 6 个待修复点中就有5 6 4 个点存在砷的污染1 1 9 。我国甘肃白银地区由于使用 含砷废水灌溉农田，全市有1 6 3 的土壤砷超过当地临界值( 2 5 m g k g ) ，最高达1 4 9 m g k g ， 严重影响农业生产【加】。我国南方地区工矿区土壤砷异常状况较多，2 0 0 0 年湖南郴州炼砷 区因废渣污染井水，当地农民利用污染的水源灌溉，致使4 0 h m p 农田抛荒。王振刚等1 2 1 1 对石门雄黄矿附近的三个村调查发现，土壤砷含量为8 4 2 9 6 m g k g ，表明土壤己受到不 2 第一。章绪论 同程度的砷污染。 1 2 土壤中砷污染对微生物的生态效应 1 2 1 对微生物数量的影响 土壤中微生物种类很多，它们各自具有不同的生理习性，产生各种作用。由于各种 土壤给予微生物的生存条件的差异，所以土壤中微生物群落的组成和数量也各不相同。 总体看，土壤中的微生物以细菌为最多，放线菌和真菌次之，藻类和原生动物等的数量 较少。自上一世纪7 0 年代以来，对重金属影响微生物数量及群落结构多样性方面进行 了大量研究工作，主要涉及c d 、c r 、c u 、p b 、z n 、h g 、a s 等7 种重余属，通过污染 大田测定以及盆栽、模拟试验，大部分研究表明，重金属对微生物毒性的效应与其浓度 有很大关系，低浓度的某些重金属能促进微生物的生长，但随着重金属浓度的增加，会 出现明显抑制作用，二者一般呈负相关关系，其相关显著性与重金属种类、土壤类型及 微生物类群有关【2 2 】。由于在确定土壤中金属的生物有效性上有一定难度，而且土壤微生 物区系的复杂性及研究方法不同，不同研究结果之间可比性较差 2 2 1 。 土壤受砷污染后，细菌总数明显减少，在试验浓度范围( 1 0 4 0 m g k g ) 内，当土壤 砷浓度为1 0 m g k g 时，细菌数已明显下降，并随土壤砷浓度的增加而递减。不同形态的 砷化物对细菌的影响效应具有一定差异，以亚砷酸钠的抑制作用最为明显。砷污染物对 几种固氮菌、解磷细菌及纤维分解菌均有抑制作用，除紫云英根瘤菌在低浓度( 砷酸氢 二钠1 0 m g k g ) 时菌落数略有增加外，均随砷浓度的递增而减少】。 重金属污染对不同质地土壤中的微生物生物量的影响是不同的。一般有机质含量 高、粘粒含量大的土壤对重金属具有较大的缓冲能力，重金属对微生物的抑制作用较小； 而在砂质、砂壤质土壤中，重金属对微生物生物量的抑制作用较大。 总之，作为必须微量元素之一，土壤中砷的浓度较低时对微生物生物量有一定的刺 激作用，但超过一定浓度时对土壤微生物则有毒害效应；而且相同的砷浓度在不同土壤 中对微生物的毒害程度不同，表现出这一抑制作用的复杂性。由于重金属污染对土壤中 微生物个体的影响，必然导致对其种群结构的影响。 广东工业大学工学硕士学位论文 1 2 2 对微生物种群结构的影响 土壤微生物种群结构是表征土壤生态系统群落结构和稳定性的重要参数之一。通常 情况下，土壤砷污染对于微生物有两种效应：一是不适应砷的微生物种类数量的减少或 灭绝；二是适应砷的微生物种类数量增大与优势化。因此，土壤砷污染会引起土壤微生 物的种群结构的变化，土壤微生物多样性减少。 1 2 3 对微生物生理生化功能的影晌 土壤砷污染引起微生物数量、种群结构变化的同时，也影响微生物的代谢功能。 1 2 3 1 对碳、氮代谢的影响 碳( c ) 、氮( n ) 代谢是土壤微生物活动中2 个最基本的代谢过程。w i l k e 研究了 1 2 种重金属和非金属污染物( a s 、b e 、b r 、c d 、c r 、f 、p b 、h g 、s e 、s n 、v 和n i ) 对n 素转化的长期影响( 8 9 年) ，发现除s e 和s n 外，其它污染物均抑制n 的矿化作 用 2 4 1 。 1 2 3 2 对微生物体内酶的影响 土壤受砷污染后，会对微生物的生理生化活性产生影响。杨居荣等 2 5 1 通过模拟试验 及现场调查，研究了砷对水解酶类和氧化还原酶类活性的影响发现：砷对脲酶、碱性磷 酸酶和蛋白酶这三种水解酶类的活性均有一定的抑制作用；砷对脱氢酶、多酚氧化酶、 过氧化氢酶的活性均有不同程度的抑制作用。因此，砷可抑制土壤酶活性，甚至导致酶 失活。 1 2 3 3 对土壤呼吸的影响 杨居荣等【2 5 】通过模拟试验及现场调查，研究发现砷对土壤呼吸有明显的抑制作用， 随着投加砷量的增加，土壤呼吸强度明显下降，两者呈显著的负相关，当土壤砷投加量 达1 0 0 m g k g 时，土壤呼吸强度的抑制率可达5 0 。 4 第一章绪论 1 3 微生物修复技术 1 3 1 概念和原理 微生物修复通常是指利用具有特异功能的微生物或者生物强化物质消减、净化环境 中污染物的替代技术。重金属污染土壤的微生物修复是利用微生物的生物活性对重金属 的亲合吸附或转化为低毒产物，从而降低重金属的污染程度。在长期受某种重金属污染 的土壤上，生存有很大数量、能适应重金属污染环境并能氧化或还原重金属的微生物类 群。微生物对重金属首先是吸收作用，由于专性微生物区系能促进重金属参与微生物体 组成，从而促进重金属的微生物吸收，减少植物摄取。重金属污染土壤的微生物修复主 要包括两方面，即生物吸附和生物氧化还原。生物吸附是重金属被活的或死的生物体 所吸附的过程，而生物氧化则是利用微生物改变重金属离子的氧化还原状态降低土壤 环境中重金属含量。微生物可使还原态金属氧化，如无色杆菌、假单胞菌能使亚砷酸盐 氧化为砷酸盐，从而降低a s 的毒性。除此而外，重金属污染土壤的微生物修复的另一 重要方面是菌根的作用。菌根是植物根系和真菌形成的一种共生体，菌根与土壤的交互 作用形成了菌根际。对根际的研究结果表明，根际环境的改变直接影响了重金属在土壤 植物系统中的迁移、转化和生物有效性。微生物、菌根对重金属的生物有效性的影响 是多方面的，利用菌根根际的作用可提高生物修复的效率 2 6 1 。 微生物不仅种类繁多，数量极大，分布广泛，且具有繁殖迅速，个体微小，比表面 积大，对环境适应能力强等特点，因而成为人类最宝贵、最具开发潜力的资源库之一鲫。 基本上所有的细菌都有对付毒性金属离子的抗性基因，其中最大( 数量最多) 的抗性系 统是由耗能的毒性离子外排系统起作用，其次为通过酶来转化的系统( 氧化还原，甲基 化和脱甲基化) ，或者由金属结合蛋白解毒( 如金属硫蛋白s m t a ，c h a p e r o nc o p z 和周 质银结合蛋白s i l e ) 2 8 1 。目前在重金属污染土壤上运用遗传、工程菌等高科技生物技术 和手段，达到污染生物修复备受推崇。在重金属污染土壤上培育对重金属具有降毒能力 的微生物，有些微生物具有嗜重金属性，利用特异微生物有效地吸收土壤中的重金属， 使污染区净化，以保证土壤生态健康和农业的可持续发展【2 6 】。 广东工业大学r 学硕士学位论文 1 3 2 微生物修复受砷污染土壤的原理 微生物参与了砷在环境中循环的多个环节，如土壤水体中砷的相互转化、砷由地 表向地下和水体的迁移、生物甲基化产生的气态砷和微生物对砷的吸附、固定等。砷虽 然对人体有毒，但微生物对砷的适应性极强，甚至有的微生物以砷作为其生长的能源【勰】。 细菌对砷的抗性和代谢系统有三种模式：一是最为广泛存在的为砷操纵子，它们存在于 大多数细菌的基因组和质粒中；二是最近发现的a r r 基因，这是周质区的a s ( v ) 还原 酶，它在厌氧呼吸中起作用，使a s ( v ) 作为末端电子受体；三是a s o 基因编码周质 a s ( i i i ) 氧化酶，它在好氧环境下发挥抗耐a s ( i i i ) 作用，使a s ( i i i ) 成为电子供体， 转化为低毒的a s ( v ) 吲。鉴于细菌抗砷的三种模式，我们可以从受砷污染或者未受 砷污染的环境中筛选得到抗耐砷菌，把环境中的砷吸附和解毒。例如日本研究人员利用 微生物对砷的吸附特性将砷从水体中去除1 2 9 1 。最近还有被提到微生物甲基化砷，由于砷 甲基化的最终产物三甲基砷是无毒的，因此微生物甲基化砷成为了新的研究热点。 1 4 外源砷对土壤微生物的生态效应的研究现状 从大量文献中可以发现，研究者一般从3 个途径来获得重金属对土壤微生物和微生 物过程的胁迫或毒害作用的资料： ( 1 ) 通过实验室的培养试验来获得； ( 2 ) 通过田间试验来获得； ( 3 ) 实地监测获得。 一般用较为快速简便的生物分析方法来测定这种胁迫或毒害作用，如测定可培养土 壤微生物数量和区系结构，土壤碳、氮矿化作用，及土壤酶活性等p o 。关于土壤环境中 砷的研究，早在上世纪3 0 年代后期就有人探索，但是都是通过对已受砷污染的土壤进 行研究而得出结论，但是关于在实验室条件下外加砷源对土壤微生物群落的生态影响则 报道甚少。 国内较早进行的外加源砷对土壤微生物生态影响研究是从上世纪九十年代开始的。 1 9 9 6 年，陈同斌【3 l 】通过微生物嫌气培养实验，探讨了砷污染对土壤呼吸作用、反硝化作 用、挥发性脂肪酸形成和氨素形态转化等微生物活动过程的影响，结果表明砷明显抑制 微生物活动中c 0 2 的产生，而且显著降低反硝化细菌的活性。2 0 0 1 年，赵春燕等【3 2 】报道 6 第一章绪论 了通过含有不同浓度的铜、铅、砷、镉4 种重金属的大豆、小麦盆栽试验，采用气相色 谱方法测定土壤微生物酶活性。结果表明：低浓度的重金属能够提高固氮酶和反硝化酶 的活性，而高浓度的重金属对上述二种酶有强烈的抑制作用。b b e d v a n t o r o 铮，】研究长 期砷和d d t 的污染对澳大利亚n e ws o u t hw r a l e s 北部土壤微生物特性的影响，未受污染土 壤的微生物特性与受污染的土壤有很显著的不同( p 0 0 0 1 ) ，和未受污染的土壤相比， 受污染土壤的真菌数量、微生物生物量碳及呼吸都戏剧性地减少( p 0 0 5 ) 。2 0 0 4 年， 蒋成爱等 3 4 1 报道了a s 可单独或者与其他重金属联合作用减少土壤中微生物( 细菌、放射 菌、真菌和线虫等) 的数量和降低酶的活性，a s ( i i i ) 和a s ( v ) 对土壤微生物的影响因土 壤类型和微生物的种类而异，其中两种砷化物对放线菌和真菌影响不大，低浓度时能够 提高固氮酶( a z o t o b a c t e rs p ) 和反硝化酶的活性，而高浓度则对上述二种酶有强烈的抑制 作用。a k g h o s h 等【3 5 】通过对孟加拉国西部受砷土壤的土壤因子包括微生物生物量、土 壤呼吸、荧光素二乙酸酯及脱氢酶活性的研究，得出这些土壤因子皆与砷的形态( 可生 化态砷和总砷) 呈显著的负相关性，而微生物代谢商则与砷的形态呈显著正相关性，表 明了砷对土壤微生物群落产生了压力。 r i c h a r de m a c u r 铮，6 】于2 0 0 4 年报道了在不饱和土壤中微生物数量与砷的氧化还原 作用的联系，并分离出八株好氧异养细菌，采用p c r 产生的d n a 指纹图谱并联合变性梯 度凝胶电泳方法鉴定其中三株菌是将a s ( i i i ) 氧化成a s ( v ) ，另 b 5 株是将a s ( v ) 还原成a s ( i i i ) 。r i i n at u r p e i n e n 等t 3 ，l 研究发现，受砷污染的土壤中生物构成单元的数量 没有受到重金属污染的影响，抗a s ( v ) 细菌占总异养细菌数量的比例是比较高( o 5 1 1 ) 的，而且与砷的浓度无关，而抗a s ( i i i ) 细菌在土壤中的比例就与砷的浓度有关，并且发 现了砷的生物利用性与抗a s ( i i i ) 细菌的比例是呈显著正相关性的。 最近几年，对于土壤中砷对微生物生态的影响也是通过对已受砷污染的土壤进行 的。2 0 0 6 年，m sv f i s q u e z m u r r i e t a 等，s 】通过研究了墨西哥一个受重金属包括砷、铅、铜、 锌等严重污染的土壤，得出微生物生物量、土壤有机碳、矿物总氮和总碳和土壤重金属 含量之间存在显著的负相关性( p c g c c c g c c g c g c g c g g c g g g c g g g g c g g g g g c a c g g g g g g c c t a c g g g a g g c a g c a g a t t a c c g c g g c t g c t g g 3 将上述试剂按顺序装入一个1 5 m l 离心管中，经充分混匀后，分装至l o 个p c r 管， 以两管为一组，共5 组，其中一组为阴性对照( 即不加d n a ) ，另外四组分别加入从四 组土壤中提取出来的经过稀释1 0 倍后的d n a 各1 1 t l 。放入p c r 扩增仪，设定扩增程 序，进行扩增。 3 4 3 扩增程序 除了进行p c r 反应体系的优化设计，还要对p c r 反应过程的温度等条件进行优化 选择实验。 ( 1 ) 变性：p c r 反应开始后，首先使双链模板d n a 解链为单链，9 5 c 变性2 0 3 0 秒即可使一般的d n a 分子完全变性，变性温度过高或变性时间过长都会导致d n a 聚 合酶活性的下降，从而影响p c r 的产量。但若变性温度过低会导致d n a 模板变性不完 全，则引物无法与模板结合，亦会导致p c r 反应的失败。对于富含g 、c 的模板应适当 2 1 广东工业大学工学硕士学位论文 提高变性温度。通过实验最终选取变性温度为9 4 ，变性时间为3 0 s 。 ( 2 ) 模板d n a 与引物的退火( 复性) ：引物与模板的退火温度由引物的长度及g c 含量决定，引物长度为1 5 2 5 b p 时，其退火温度可由t m 值确定，t i n = 4 ( g + c ) + 2 ( a + t ) ， 退火温度为t m 值5 。提高退火温度可减少引物与模板之间的非特异结合，提高p c r 反应的特异性；降低退火温度则可提高扩增产量。退火时间一般为2 0 4 0 秒，时间过短 会导致延伸不充分，后面延伸步骤时温度会升高，会导致引物从模板脱落，p c r 反应失 败。如待扩增目的d n a 片段含量很少，可在p c r 前几次循环中适当延长退火时间，这 样有利于引物与模板的结合，提高p c r 反应的灵敏度。通过实验退火温度选取为6 2 ， 退火时间为4 5 s 。 ( 3 ) 引物的延伸：延伸温度取决于所用的d n a 聚合酶的最适温度，一般为7 0 7 5 。 延伸时间由扩增片段的长度决定，扩增小于5 0 0 b p 的d n a 片段的延伸时间为2 0 秒，扩 增5 0 0 1 2 0 0 b p 的d n a 片段的延伸时间为4 0 秒，扩增片段大于l k b ，则需增加延伸时间。 当扩增片段小于1 5 0 b p 时，则可省略延伸步骤，因为退火温度下，t a qd n a 聚合酶的活 性已足以完成段序列的合成。 通过实验，选择延伸温度为7 2 ，延伸时间为l m i n 。 ( 4 ) 循环次数：p c r 的循环次数主要取决于模板d n a 的浓度，一般为2 5 3 5 次， 此时p c r 产物的积累即可达到最大值，刚刚进入“平台期”。即使再增加循环数，p c r 产物量也不会再有明显增加。平台期”是指p c r 后期循环产物的对数积累趋于饱和，并 伴随o 3 1 p m o i 靶序列的累积。随着循环次数的增加，一方面由于产物浓度过高，以致 自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效率的降低；另一方面， 随着循环次数的增加，t a qd n a 聚合酶活性下降，引物及d n t p 浓度下降，易发生错误 掺入，非特异性产物增加。因此，在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。本实 验选择3 0 次循环。 3 4 4p o r 产物的琼脂糖凝胶电泳 3 4 4 1 实验原理 生物大分子如核酸、蛋白质、多糖等，在一定的p h 条件下，可以解离成带电荷的 离子。在电场中这些带电荷的离子，可以根据电荷的性质向正极或者负极移动。这种带 第三章外加砷源对土壤微生物生态的影响 电荷物质在电场中向其相反电极泳动的现象称为电泳。凡是带电荷的生物大分子都可以 进行电泳。以电泳支持介质主要可以分为聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，以电泳方式可 分为垂直型和水平型。一般说来，聚丙烯酰胺凝胶电泳用来分离较短的核酸片段 ( 5 5 0 0 b p ) ，分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，而后者多用于o 1 k b - 6 0 k b 的较大核酸片段。 琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方 法。 在p h 值为8 0 - 8 3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电， 在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测 其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 3 4 4 2 实验步骤 p c r 琼脂糖凝胶电泳实验的步骤如下： ( 1 ) 取出洗净并晒干的胶床，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约8 m m 高的挡墙，要确保严密，以免脂胶时有胶液漏出。或者在倒胶前先用滴管吸取一点胶液 点在未封闭的两端，待凝固后形成挡墙再倒胶。 ( 2 ) 选择孔径大小适合的点样梳，将梳子插入到胶床上小凹槽内，根据制胶需要 可插在胶槽的一端，也可插在中央。梳子平面要和胶床底面垂直，梳齿前端和胶床底面 有l m m 的间隙。将胶床放在调整好的水平台面上。 ( 3 ) 称取需要的量的琼脂糖粉末于2 5 0 m l 的三角瓶中后加入适量的l x t a e 电泳 缓冲液，轻轻摇动三角瓶，使琼脂糖粉微粒呈均匀悬浊状态，瓶内溶液应只占容器体积 的1 3 1 2 为宜。用保鲜膜或铝箔纸封盖，且应留有小缝隙或穿刺2 3 个孔，以便加热时 水蒸气逸出。 ( 4 ) 用沸水浴或微波炉加热使琼脂糖熔化。在使用微波炉时，应控制好时间，有 时候加热到一定时间会突然产生气泡，使琼脂糖沸逸出来，所以应随时观察熔化情况。 ( 5 ) 熔化的琼脂糖自然冷却到6 0 。c 时，根据需要可加入0 5 r t g m l 的e b 进行凝胶 染色( 戴手套操作) 。轻轻摇动三角瓶，将溴化乙锭与琼脂糖混合均匀后，倒入已准备 好的胶床内，凝胶厚度为0 3 0 5 e r a ，并除去气泡。 ( 6 ) 室温下静置一小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶布或者胶带纸，将带 凝胶的胶床置于电泳槽中。 广东工业大学工学硕士学位论文 ( 7 ) 向电泳槽中加入1 x t a e 电泳缓冲液，缓冲液的量以超过凝胶表面1 - 2 r a m 为 宜。轻轻拔出固定在凝胶中的梳子，使原梳齿处因缺凝胶而形成的样品孔充满缓冲液， 如发现样品孔内有残留气泡，应设法去除( 如用注射器吸除) ，以免加样时样品随气泡 散溢。 ( 8 ) 在待电泳分析的核酸样品中加入约为样品1 6 的上样缓冲液，用加样器轻轻混 合均匀，并以低转数离心5 秒钟，使其全部汇集于试管底部。用加样器吸取样品，轻轻 的加入到凝胶的样品孔中。加样器头要轻贴样品孔壁，但不要碰坏孔壁，否则电泳条带 不整齐。因混有上样缓冲液，样品比重变大，加样后带有溴酚蓝颜色的样品应缓缓沉于 样品孑l 底。每加完一种样品应更换一个吸头，以避免交叉污染。d n a 的参比物( m a r k e r ) 应加在两侧的加样孔内。记录样品点样顺序及样量。 ( 9 ) 在样品全部加完后，开始电泳前，应检查一次凝胶放置是否正确，即确认凝 胶的样品孔一端为负极。确认后可接通电源，开始电泳，最高电压不超过5 v c m 。几分 钟后，见到溴酚蓝指示剂向正极移动，表示电泳正常。 ( 1 0 ) 当指示剂跑过胶板的2 3 ，可终止电泳；切断电源后，取出凝胶，将电泳凝 胶块放在凝胶成像仪中观察，拍照。 3 5 变性梯度凝胶电泳 3 5 1 实验原理 双链d n a 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和 电荷。不同长度的d n a 片段能够被区分开，但同样长度的d n a 片段在胶中的迁移行 为一样，因此不能被区分。d g g e ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 技术在一般 的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂( 尿素和甲酰胺) 梯度，从而能够把同样长度 但序列不同的d n a 片段区分开来。 双链d n a 分子中，由于碱基的组成和排列差异，使不同序列的双链d n a 分子具 有不同的解链温度。当双链d n a 分子在含梯度变性剂( 尿素、甲酰胺) 聚丙烯酰胺凝 胶中进行电泳时，因其解链的速