（分析化学专业论文）一维微流控蛋白质微珠阵列的制备、优化及应用.pdf

一维微流控蛋白质微珠阵列的制备、优化及应用 摘要 微芯片技术是当今化学与生命科学研究领域发展最快的重要前沿之一一维 微流控微珠阵列是本研究小组近年来发展起来的一种新型的生物分析芯片，这种 分析芯片在阵列设计的灵活性、液流控制的简便性、试样的低消耗方面具有优异 的性能。在此基础上，针对微珠表面的抗体固定化所面临的问题以及蛋白质分析 的特点和要求，本论文重点研究了微珠表面的抗体修饰方法和蛋白质样品制备方 法，优化了分析条件，并应用于蛋白质的表达分析。研究工作包括三个方面的内 容： 一，微流控通道的内壁改性处理及抗体微珠的制备。本文考察了聚二甲基硅 氧烷( p d m s ) 微通道内壁对蛋白质的非特异性吸附，并对抗体微珠的制备进行 了研究，制备了基于抗体微珠的一维蛋白质阵列芯片。通过对微通道内壁的改性 处理，p d m s 对蛋白质的非特异性吸附得到了有效的抑制。在抗体微珠的制备中， 商品化小鼠单抗试剂中普遍添加的高浓度保护蛋白( 常用牛血清白蛋白，即b s a ) 严重干扰了抗体的固定化。通过采用离心超滤对超微量抗体试剂进行预处理，大 幅度改善了以b s a 为保护蛋白的抗体试剂的抗体固定化效果。此外，本文对利用 蛋白a 改善抗体微珠的制各进行了考察和摸索。 二、蛋白质检测条件的控制与优化。包括细胞总蛋白样品的制备、微珠上抗 原- 抗体反应及微珠洗涤条件、进样方式的选择与改进。本文对优化后的检测条件 进行了考察，结果表明，一维蛋白质阵列芯片的性能得到了有效的改善。 三、一维微流控蛋白质微珠阵列在蛋白质表达分析中的应用。本文以p 5 3 蛋 白为检测对象，获取了一维蛋白质阵列芯片的灵敏度和检测限，也获得了实际样 品a 5 4 9 细胞p 5 3 蛋白的拷贝数信息本文以表达较稳定的8 a c t i n 作为内参照， 考察了不同细胞系的p 5 3 、c - m y c 蛋白质表达差异、抗癌药物介导的同种细胞系 的蛋白质差异表达，并用w e s t e r n b l o t t i n g 方法进行了验证，两种方法得到了一致 的分析结果。此外，本文对一维蛋白质阵列芯片应用于颈部恶性肿瘤分型开展了 初步的研究。 关键词：微流控；微珠阵列；微芯片；蛋白质表达分析 一i i a b s t r a c t m i c r o c h i pt e c h n o l o g yh a sb e c o m eo n eo ft h em o s ti m p o n a n ta r e a si nt h ef i e l do f c h e m i s t r y 锄dl i f cs c i e n c e s 0 n e d i m e n s i o n a l ( 1 d ) m i c r o n u i d i cb e a da 玎a y sa r e k i n d so fn o v e lb i o m o l e c u l 盯 m i c r o a n a l y s i sp l a t f o 珊 t h a tw e p r o p o s e d t h e s e m i c r o c h i pp l a t f o 珊sh a v ee x c e l l e n ta d v 锄t a g e si nf l e x i b l ea r r a yd e s i g n ，e 器yn u i d i c c o n t r o la n dl o wc o n s u m p t i o no ft h es 锄p l e sa n d r e a g e n t s i nt h i st h e s i s ，b a s e do nt h i s p l a t f o r m ，m o d i f i c a t i o no ft h ea n t i b o d i e so nt h e b e a ds u r f a c e 锄de x p e r i m e n t a l o p t i m i z a t i o nh a v eb e e nf u r t h e ri n v e s t i g a t e d a n dh a v e b e e na p p l i e df o rp f o t e i n a n a l y s i ss u c c e s s f u l l y t h i st h e s i si n c l u d e st h r e em a j o rp a r t sa sf o l l o w s ： 1 d e n a n i r a l i z a t i o no ft h ei n n e rw a no ft h em i c f o n u i d i cc h a n n e l sa n d p r e p a r a t i o no ft h ea n t i b o d y - m o d i f i e dm i c r o b e a d s i no u ri r l v e s t i g a t i o n ，n o n s p e c i f i c p f o t e i na d s o f p t i o no nt h ei 蚰e rw a l lo ft h ep d m sm i c r o c h a n n e l sc 锄b es u c c e s s f u l l y r e s t r a i n c dv i ap r o p e rm o d i 6 c a t i o n0 ft h ei n n e rw a n i na n t i b o d y - b e a d sp r e p a r a t i o n ， t h ea n t i b o d yi m m o b i l i z a t i o nw a si n f l u e n c e dg r e a t l yb yp r o t e c t i v ep r o t e i n ss u c ha s b o v i n es e f u ma l b u m i n ( b s a ) ，w h i c ha f ec o m m o n l ya d d e da tah i g hc o n c e n t f a t i o nt o p r e v e n tt h ec o m m e r c i a la n t i b o d yp r o d u c t sf i d mt i t e rd e c r e a s e as i m p l ep r e t r e a t m e n t p r o t o c o lb a s e do nu l 仃a - f i l t m t i o nw a sc a f r i e do u ta n dw a sp r o v e dt ob ee m c i e n tf o r t h eb s a r c m o v a l a p p r o a c ho fp r o t e i nal i n k a g ef o rt h ei m p r o v e m e n to fa n t i b o d y i 咖o b i l i z a t i o nw a sa l s oi n v e s t i g a t e d 2 o p t i m i z a t i o no fe x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h i sp a r ti n c l u d e sp r e p a r a t i o no f t o t a lp r o t e i ns a m p l e s 行o mt h ec u l t u r ec e n s ，o n - b e a di m m u n o - b i n d i n gr e a c t i o n 她d w a s hs t e p ，a n dc h o i c eo fs a m p l i n g t h e0 p t i m i z e dc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e da n d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ep e r f o 珊a n c eo ft h el dp r o t e i na r r a y sh a sb e e ni m p r o v e d 3 q u a n t i t a t i v e 孤a i y s i so fp r o t e i ne x p r e s s i o n t h es e n s i t i v i t ya n dl i m i t o f d e t e c t i o nw a sg a i n e df o rt h ed e t e c t i o no fp 5 3p r o t e i nu s i n gt h el dp r o t e i na r r a y s a l s o ，w ed e t e m i n e dp 5 3c o p yn u m b e ri na v e r a g es i n g l ea 5 4 9c e i nt h ei n u s t r a t i o n o fd i f 话f e n t i a lp r o t e i ne x p r e s s i o na n a l y s i s ，at h r e e - p r o t e i np r o f i l i n go fp 5 3 ，c m y c a n dp - a c t i nw a sd e m o n s t r a t e d p h a 珊a c e u t i c a l m e d i a t e dd i f r e n t i a le x p r e s s i o n so f p 5 3 柚dc m y ci ns e v e f a lk i n d so fc e l ll i n e sw e r ei n v e s t i g a t e da n dt h er e l i a b 订i t yo f t h el - dp r o t e i n 甜r a y sw e r ev e r i f i e db yw e s t e mb l o t t i n g i na d d i t i o n ，p r e l i m i n a r y w o r ko nn e c km a l i g n a n tt u m o rt y p i n gh a sb e e nc a r r i e do u t k ：e y w o r d s ：m i c r o n u i d i c ； b e a da r r a y ； m i c r o c h i p ；p r o t e i ne x p i e s s i o na n a l y s i s l i i 一维微流羟蛋白质微珠阵列的制各，优化及应用 本文所用英文缩写词表 缩略词名称缩略词名称 a 5 4 9肺癌上皮细胞 8 - a c t i n a f p b s a c c d c e c h 0 - p 5 3 肌动蛋白 甲胎蛋白 牛血清白蛋白 电荷耦合器件 h r p i c c d l c m l i f 辣根过氧化物酶 增强型电荷耦合器件 激光捕获微切割 激光诱导荧光检测 m a l d i m s 基质辅助激光解析电离质谱 毛细管电泳m e m s 氅箜p 翟。差罗的中国仓鼠m i 矾a 卵巢上皮细胞 “ c n e 2 鼻咽癌细胞 2 一dd i g e 荧光差异双向凝胶电泳 2 - d e双向电泳 2 d h p l c 二维高效液相色谱 d m p 二甲基庚二酸亚胺酯 d s硫酸葡聚糖 e c l 酶促化学发光 e d t a乙二胺四乙酸盐 e s i m s 电喷雾电离质谱 5 一f u 5 氟尿嘧啶 h b e h g p i p g 人支气管上皮细胞 人类基因组计划 固相p h 梯度 m s p a g e p b p b s p c r p d m s p e g p m s f p v d f 膜 s d s s n p 微机电加工 信使核糖核酸 质谱 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚凝胺 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚二甲基硅氧烷 聚乙二醇 苯甲基磺酰氟 聚偏二氟乙烯膜 十二烷基硫酸钠 单核苷酸多态性 t e m e d四甲基乙二胺 t r i s三羟基氨基甲烷 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 仰韵喃 日期：砌形年甲月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：似j 嗜日期：多。d 多年厂月乡日 翩戤。偏搬? ：沪等| 7 月v 日j 1 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 蛋白质分析的重要性及面临的挑战 蛋白质和核酸是生命体内最重要的两类生物大分子。蛋白质是基因表达的终 产物也是基因功能的载体【i l ；核酸则在2 0 世纪4 0 5 0 年代确认为遗传因子基 因的载体【“2 0 世纪7 0 8 0 年代，d n a 重组、测序、p c r 技术的涌现使核酸研 究迅速发展，1 9 9 0 年人类基因组计划( h u m 姐g e n o m ep r o j e c l ，h g p ) 的实施将 核酸研究推向高峰，此时蛋白质研究则相对落后【。2 0 0 1 年，伴随人类基因组计 划的完成，生命科学研究的焦点从基因组序列的测定转向了基因的确认、基因表 达规律及基因功能的探寻，而这些内容都有赖于对基因表达的研究【l 】。2 0 世纪9 0 年代中后期，对基因表达的研究在m r n a 层面上展开，基于大规模m r n a 鉴定、 定量技术的基因表达谱研究己较为成熟，人们倾向于通过m r n a 层面的基因表达 研究来反映蛋白质的表达，但是1 9 9 9 年h a t z i m 蚰i k a t i s 等【3 l 经过研究指出m r n a 的表达只能揭示转录层面上的基因表达调控，不足以反映基因表达的最终状态， 整体水平上的蛋白质研究不可忽视。随着生命科学研究焦点的转移，整体水平的 蛋白质研究蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 受到空前关注【钔。 蛋白质是细胞内各类代谢和调控的主要执行者，也是致病因子、药物对机体 作用的最重要的靶分子i i l ，其表达指示了细胞的生理及病理状态、揭示了药物与 环境因素对生命体的影响。系统性的蛋白质研究是理解生命现象、疾病进程、药 物作用所必需的，也是加快药物研发所需要的 在细胞的生命活动中，各种蛋白质往往与其他生物分子一同形成精密复杂的 相互作用及调控网络，调节细胞的生长周期、控制细胞的增殖与凋亡、使细胞黏 附或迁移【5 1 ，进而操纵肌体的生长、发育、分化、应激、死亡等。这样，环境中 的影响因子对细胞中某一个或某几个靶标的作用将触发网络上各个节点蛋白的表 达或状态变化，从而使细胞发生生理改变；细胞间个别基因的差异也可能使这种 蛋白质网络发生变化，在同样的影响因子作用下显示出巨大的生理差异。 在疾病的诊治方面，对蛋白质调控网络运作状态的正确把握有助于精确地判 定病理状态、预测病情发展、估计药效和药物的毒副作用，实现对人对症的个性 化医疗，从而有利于病患的康复、有利于更大限度地发挥药物的药效、避免毒副 作用蛋白质调控网络的差异和运转状况则直接体现疾病的易感性差异、显示疾 病的进程此外，蛋白质调控网络影响药物的代谢、药效的发挥、毒副作用的产 生，决定细胞对药物的敏感性【6 7 i 。 一维微流控蛋白质微珠阵列的制备、优化及应用 在药物研究领域，新药研发具有广阔的发展空间。例如，在已知的大约4 5 0 0 种疾病中，仅有不到一半的疾病有相应的治疗手段，有对应药物的疾病甚至不到 四分之一【l 】。然而，新药的研发是一个周期长、风险高、投入高、回报高的产业 【引。高效地筛选药物、了解其药理毒理、完成临床试验，这是缩短周期、降低风 险、减少投入的关键【9 】。找到致病因子的靶标蛋白，并通过组合化学、高通量筛 选技术确定药物的先导物，然后通过系统化、规模化的蛋白质研究确定药理和毒 理、指导临床试验，将能有效地促进新药的研发进度。 近年，n a t u r c 、s c i e n c e 等一些重要期刊接连发表有关蛋白质研究的论文【4 1 0 i ， 明确表明蛋白质研究的重要学术前沿地位。但另一方面也显示，目前系统化、规 模化的蛋白质研究也面临着巨大的挑战，蛋白质研究的难度远高于核酸研究【i ，5 1 。 首先，蛋白质的结构远比核酸复杂，蛋白质的种类也远远多于基因的数目。 核酸由4 种核苷酸组成、d n a 具有非常好的稳定性；而蛋白质由2 0 种基本氨基 酸组成、具有复杂的空间结构、容易变性并丧失天然功能。在遗传密码的传递过 程中，一个基因可以通过m r n a 转录本剪接方式的变化、翻译起止位置的改变、 翻译时的移码等途径而编码多种蛋白质 4 】。在翻译后修饰中，丰富的蛋白质修饰 过程使蛋白质的性状更加多样。有文献估计，翻译后修饰的类型在2 0 0 种以上【l “。 对于哺乳动物基因组，为翻译后修饰蛋白编码的基因约占基因总数的5 l o 【1 1 ， 抡】。对于人类基因组，可表达的蛋白质种类更为可观。人类基因组草图分析结果 表明，人类基因组仅有大约2 5o o o 4 0o o o 个基因，只相当于果蝇或蠕虫基因数 目的两倍左右【1 3 】，而编码的蛋白质的种类可达1 0 万甚至1 0 0 万种以上【l l 】。 其次，蛋白质的表达是高度活跃和动态的，具有时序性、适应性。一个生物 体只有一个基因组，而细胞的蛋白质组成却随着环境的不同而产生巨大的差异。 细胞中的蛋白质通过丰度的增减、定位的改变、稳定性的调节、修饰情况的变化、 结合对象的更替而对内外环境作出应答【4 】。因此，一个生命体的蛋白质组 ( p r o t e o m e ) 涵盖了不同组织、不同阶段、不同环境的全部蛋白质表达谱【1 4 l ，对 蛋白质组的研究也将涉及测序、鉴定、定量、细胞内定位、翻译后修饰、蛋白质- 蛋白质相互作用、三维结构、活性、功能等多方面内容【4 j 。 此外，蛋白质研究的难度还在于需要提高分析手段的灵敏度。从生理、病理 方面来看，大部分执行重要生物功能的蛋白质是低丰度蛋白，包括调控蛋白、信 号转导蛋白、受体蛋白等【1 1 ；从恶性肿瘤等重大疾病的诊断来看，病变组织细胞 成分复杂、疾病早期阶段特征性蛋白含量低，疾病的诊断尤其是早期诊断需要实 现低丰度蛋白质的检测。但是，蛋白质不能被简单地扩增或原位合成、难以利用 “拷贝”的方式增加拷贝数。 总之，生命科学研究的发展一方面拓宽了蛋白质研究的内容，另一方面也在 系统化、规模化、低丰度蛋白质的检测方面给蛋白质研究带来了新的挑战。 一2 一 硕士学位论文 1 2 蛋白质分析技术进展 蛋白质研究是由技术推动，也是受技术限制的1 4 】，图1 1 形象地表明传统的 蛋白质分析技术效率低，不适合于系统化、大规模的蛋白质研究。蛋白质研究的 高目标，高难度给分析技术提出了高要求，促使研究者致力手开创和拓展大规模 蛋白质分析技术。 圈1 1蛋白质研究是受技术推动，也是受技术限制的州。 在大规模蛋白质分析技术中，当前影响力最大的是双向凝胶电泳质谱联用的 技术路线。高分辨率双向电泳( 2 d e ) 技术诞生于1 9 7 5 年，由0 f a r r e l l 【”】和 k l o s e 【1 6 】分别提出。经过第一向的等电聚焦( i e f ) 、第二向的s d s 聚丙烯酰胺凝 胶电泳( s d s 队g e ) ，o f a r r e l l 成功地使大肠杆菌样品分离成了1 1 0 0 种不同组 分1 9 8 2 年，固相p h 梯度( i p g ) 凝胶应用于i e f ，改善了2 d e 的重复性并获 得了更高的分辨率1 1 7 】。在蛋白质组研究中，2 d e 技术成为首选分离技术【1 1 。1 9 9 7 年? o n i 讲蚺】将荧光差异技术引入2 d e ( 2 dd i g e ) ，对不同样品标以性质相近、 光谱分开的不同c y 埘染料后在同一块凝胶中分离，以克服2 d e 重复性差给定性 比较造成的干扰。2 0 0 3 年a l b 觚【挣】将内标用于2 dd i g e ，实现了2 d e 的定量分 析。质谱( m s ) 技术在生命科学领域的应用始于2 0 世纪8 0 年代中期，电喷雾电 离质谱( e s i m s ) f 2 0 】、基质辅助激光解析电离质谱( m a l d i 。m s ) f 2 1 i 两项技术 的出现使f m o i 乃至蛐o l 水平检测几十万道尔顿大小的生物大分子成为可能在 蛋白质组研究中，m s 技术替代效率、准确性和灵敏度较低的e d m 姐自动测序技 术，成为蛋白质组研究首选鉴定手段【近年，o d a 【2 2 】提出稳定同位素代谢标记 技术，g y 画b 3 】提出同位素亲和标签技术，以克服分析对象离子化能力差异造成的 m s 定量分析困难。 2 d e ，m s 联用的技术路线尽管已具有同时分析数千种蛋白质的能力1 2 ”，但 是，2 d e 技术稳定性差、重复性低、难以分析酸或碱性蛋白的诸多缺陷还没有克 一维微流控蛋白质微珠阵列的制各、优化及应用 服，这一技术路线用于定性比较和定量分析已经取得了一些进展，但仍然有很多 技术难题尚未解决。此外，2 d e m s 联用不仅依赖于昂贵的设备、花费高，而且 耗时多、技术要求高，例如，每个2 d e 全过程需要大约一周的时间，初学者可 能要练习几十个全过程才能得到几千个蛋白质点【2 5 】；所用质谱仪的价格十倍于 p n a 自动测序仪，国内外仅极少数单位有能力购置。这些都限制着大规模蛋白质 研究的发展，因此，在发展2 d e m s 联用技术的同时，研究者们也努力发展其他 蛋白质分析技术。 目前，二维高效液相色谱技术( 2 d h p l c ) 、毛细管电泳( c e ) 、微流控芯片 电泳等技术已拓展应用于蛋白质的分离，基于分子识别的蛋白质芯片也被开发用 于蛋白质表达谱、蛋白质蛋白质相互作用的研究。多种技术的相互整合与优势互 补，以及生命科学、信息科学、分析化学等多学科领域的交叉将会极大地推动蛋 白质研究的发展。 尽管蛋白质分析技术已取得了很多突破性的进展，但是，新技术的开发和拓 展仍然是蛋白质研究领域的首要课题【4 1 。其中，微芯片技术在蛋白质研究领域有 着广阔的应用前景，受到研究者的普遍关注。 1 3 微芯片技术及其在蛋白质分析中的应用 目前，微芯片技术已成为当今化学与生命科学研究领域发展最快的重要前沿 之一【2 6 9 1 。根据结构和工作原理，可将微芯片分为微阵列芯片和微流控芯片【3 0 1 。 微阵列芯片，其核心是亲和识别技术，点阵上的每个点都固定有特异性识别分子， 用以结合分析对象。一个点阵就相当于一个独立、可寻址的生物传感器，大量的 这种微型生物传感器高密度组合到一小块芯片上，同时进行生物杂交、荧光扫描， 从而实现高通量检测。微流控芯片，则是基于微机电加工( m e m s ) 构建的一种 以微管道网络为结构特征的生化分析微型器件。微阵列芯片和微流控芯片有着各 自不同的特点和发展过程( 表1 1 ) 。 表1 1 微阵列芯片与微流控芯片的比较 图1 2 为典型的微阵列芯片和微流控芯片。 硕十学位论文 图l ，2 微阵列芯片和微流控芯片示例。 左：微阵列芯片( a d e l a i d em i c m a m yf a c i i “y ，a u 8 t m l i a ) # 右：微流控芯片( l a b c h i p 佃，c a l i p 盯慨h n o l o g i e 8c o r p ) 1 3 1 微阵列芯片 2 0 世纪8 0 年代中期，e k i n s 等【3 i 】提出。多元微点分析”的构想，从非均相免 疫分析入手展开相关理论分析并进行了初步的实验验证，多元微点分析的实质就 是微阵列芯片。1 9 9 1 年，f o d o r 等【3 2 】在固相基质上通过光引导原位合成了1 0 2 4 种多肽序列，并用荧光显微镜观察了多肽和单克隆抗体之间的亲和反应，并正式 提出微阵列概念。此后，蛋白质微阵列研究长期沉寂。而d n a 微阵列技术则突 飞猛进。1 9 9 5 年，s c h e n a 等【3 3 l 首次报道将高精度机械手点样系统、荧光标记技 术、双通道荧光扫描技术及数据分析软件结合，制成d n a 微阵列并进行基因表 达分析1 9 9 8 年，d n a 微阵列研究取得重大突破，s c i e n c e 将生物芯片技术评为 当年的世界十大科技突破之一p ”。d n a 微阵列在国外实现产业化，点阵密度也 从最初的l o o 个位点合成8 核苷酸发展到1 6 c m 2 的4 0 万个点上合成2 0 核萤酸。 d n a 微阵列技术的飞跃，不仅派生出了组织微阵列、细胞微阵列等多种新型微阵 列芯片技术，还带动了蛋白质微阵列的发展。 近年，蛋白质研究的再次兴起以及d n a 微阵列技术的飞跃将研究者的注意 力引到了蛋白质微阵列技术上，并取得了蛋白质微阵列技术的一系列发展。目前， 蛋白质微阵列技术已在蛋白质蛋白质相互作用、蛋白质小分子相互作用、酶分 析、蛋白质表达分析中得到应用。m a c b e a t h 等【 】制作出高密度蛋白质微阵列， 用于蛋白质相互作用、蛋白酶底物的识别、小分子的靶蛋白的识别，他们制作了 一个有l o7 9 9 个蛋白g 点、一个f r b 点的微阵列，将标记不同荧光染料的识别 对象混合与之反应，f r b 点清晰地显示出与蛋白g 点的荧光差异。表明高密度蛋 傩微流摔蛋白质微珠阵列的制蔷、优化及虑用 白质微阵列具有优良的特异性( 图1 3 ) 。j o o s 等3 6 1 应用免疫微阵列实现了1 8 种 自身抗原的诊断，h u a n g 等3 7 1 基于抗体微阵列完成了2 4 种细胞因子的检测。 闰1 3 点阵密度高达l o8 0 0 点的蛋白质微阵列1 。 1 07 9 9 个蛋白g 点中掺杂的1 个f r b 点显示出了清晰的荧光差异。 1 3 2 微流控芯片 1 9 9 0 年w i d m c r 和m a i l z 【3s 】首次提出微全分析系统( t a s ) 的概念，旨在基 于微机电加工( m e m s ) 技术发展一种集成生化分析全过程的微型器件，实现微 量生物化学样品的低消耗、多功能、快速、高通量检测分析。1 9 9 2 年，m a n z 等p 州 首次报道微流控芯片研究，以荧光染料为分析对象展示了电渗流驱动进样和分离 的可行性，从而将肛1 a s 的主流构型定位于微流控芯片。1 9 9 3 年，h a r r i s o n 和 m a n z 【4 0 】将毛细管自由流电泳移植到微流控芯片中，成为最早用于芯片的电泳分离 方式【9 1 。1 9 9 5 年m a t h i e s 等【“l 在微流控芯片上完成了高速d n a 测序，微流控芯 片的应用价值得以体现。2 0 世纪9 0 年代中后期，美国在微全分析领域做了很大 投入，并取得了大量研究成果，我国也在2 1 世纪初开始加大这项研究的投入l ”】。 微流控芯片在短时问内成为了微芯片技术的发展前沿。在十几年的发展历程 中，多种电泳分离技术相继引入微流控芯片分离技术中，如区带电泳和等速电泳 【4 3 1 、等电聚焦1 、脉冲场电泳等m l 。相对于传统电泳分离技术，微流控芯片电 泳的显著优点是试样用量微小、样品操作、易于自动化，另外，还大大加快了分 析速度、大幅度缩短了分析时间。现在，其它微流控芯片分离技术还比较薄弱， 但分离手段从单一电泳分离转向多元化的进程已经开始，电色谱【4 6 】胶束电动色谱 【4 7 1 、及其他色谱技术h 8 1 、膜分离4 9 1 、固相萃取【5 0 1 和液液萃取【5 l 】、磁分离【5 2 1 等多 种分离技术在微流控芯片中得到应用。检测技术则从最初的激光诱导荧光( l i f ) 检测扩展到电化学检测，化学发光检测、质谱检测等多种手段。 芯片的制作材料从石英、玻璃基质扩展到高分子聚合物，聚二甲基硅氧烷 ( p d m s ) 等新型材料的使用降低了芯片的制作难度和成本另外，随着加工技 术的不断改进，加工精度提高、芯片构造更加复杂、集成度越来越高，还出现了 微泵、微阀等结构通道阵列由单通道发展为多通道平行排列，提高了平行检测 通量，甚至出现了3 8 4 通道的圆形阵列通道微流控芯片( 图1 4 ) 【5 3 1 。 图1 43 8 4 通道的圆形阵列通道微流控芯片1 5 3 1 a 3 8 4 通道微流控芯片示意图；b ，芯片4 9 通道局部示意图； c 每一组有4 条通道；d 每组通道共用一个阴极储液池 微流控芯片的应用已经涵盖了化学、生物的诸多领域，逐渐与核酸分析、蛋 白质分析、药物分析等多种分析方法结合并体现微型化检测技术的优势【“ 1 目前，已有多种微流控芯片电泳模式用于不同类型的蛋白质分析。f i g e y s 等 i ，6 l 将微流控电泳芯片与e s i m s 串联，实现了蛋白质酶解产物的顺序进样和肽段 分析，不同储液池的样品无交叉污染，检测限均在f m o l ，m i 水平此后又有较多 工作致力于微流控芯片e s i m s 串联在蛋白质和其他生物大分子分析中的技术问 题研究1 5 7 强1 z h e n g 等【，9 l 在p d m s 和玻璃毛细管组成的微流控芯片中培养蛋白质 晶体，不仅实现了晶体培养条件的有效控制，还实现了蛋白质晶体的芯片上x 射线衍射分析( 图1 5 ) 。b o u s s e 等1 6 0 l 在微流控芯片内集成了s d s 蛋白质复合物 的分离、荧光染色、脱色过程，用以测定蛋白质分子量，得到了灵敏、准确的测 定结果，染色与脱色过程仅需l o om s 。微流控芯片电泳也应用于酶分析、均相免 疫反应产物的分离，然而在微流控芯片中均相免疫分析存在较多限制，如分离效 一维微流控蛋白质衡珠阵列的制各、优化及应甩 率受样品本体影响大，抗原一抗体复合物有时形成沉淀或多种复合物而影响分离。 圈1 5 微流控芯片中的蛋白质晶体培养以及芯片上的晶体x 射线衍射分析【” 上图，a ) 蛋白质晶体培养方法示意图；b ) 芯片照片；c ) 蛋白质晶体的显微成像； 下图，蛋白质晶体的芯片上x 射线衍射图。 多维分离技术在提高蛋白质的芯片分离分辨率方面也得到了应用。r o c l 【l i n 等【6 i l 在微流控芯片中结合使用胶柬电动色谱、毛细管电泳，实现了胰蛋白酶消化 产物的二维分离，分析时间少于l om i n ，峰容量估计在5 0 0 1 0 0 0 范围内。c h e n 等【6 2 】设计了组装式p d m s 芯片，在等电聚焦后重组片基，使两向电泳通道垂直相 接，再进行第二向电泳，完成了b s a 、卵白蛋白及牛碳酸酐酶混合物的分离。l i 等【6 3 l 的设计则更为简便，单条横向通道与两段通道阵列垂直相接，前段阵列与后 段阵列相错( 图1 6 ) 。在横向通道内等电聚焦分离蛋白质样品，然后在前段阵列 的储液池d 中引入s d s 液流，将样品推挤入后段阵列进行s d s 电泳分离。这种 硬士学位论交 2 d 电泳全过程时间少于l om i n ，芯片尺寸仅2 c m 3 c m ，峰容量达1 7 0 0 图1 6 徽流控芯片上的蛋白质双向电泳【“ a 第一向电泳( i e f ) ；b 第一向分离样品转入通道阵列：c 第二向电泳( s d s 凝胶电泳) 近年来，非均相免疫分析在微流控芯片中也得到了教多的应用。d o d g e 等i i l 在玻璃芯片通道的局部区域通过物理吸附蛋白a ，用直接免疫法和竞争免疫法进 行蛋白a 与兔免疫球蛋白g 间的免疫分析研究。s a t o 等彬1 将免疫分析微流控芯 片用于临床诊断，检测了癌症诊断中重要指标人血液中的癌胚抗原。k o i i m a 等【“ 在玻璃膜芯片上实现了肝病诊断指标甲胎蛋白( a f p ) 和自血病、肾病诊断指标 p 2 小球蛋白( p 2 m g ) 的检测 1 3 3 微芯片中的非均相亲和识别技术 非均相亲和识别技术已经在微芯片中得到了广泛的应用。在微阵列芯片中， d n a 微阵列、抗体微阵列都是应用这一技术的典型。目前，在多种微流控芯片中 也都采用了非均相亲和识别的模式。 1 3 3 1 非均相亲和识别技术在蛋白质芯片中的应用 蛋白质分析中最常用的非均相亲和识别技术是非均相免疫分析。基于抗原。 抗体反应的非均相免疫分析操作简单、灵敏度和特晃性较好，因而成为临床诊断 和生物化学研究中非常重要的蛋白质表达分析方法。然而，传统的非均相免疫分 析需要较长的实验时问、试剂和样品用量大，不能为大规模蛋白质表达分析提供 足够的分析能力 结合非均相免疫分析和微芯片技术，是目前蛋白质表达分析的一个趋势。与 常规方法相比，微芯片技术具有多方面优势【舒6 w 9 1 。最显著的优势是样品和试剂 用量少，大大提高了分析通量与效率。 一9 一 一维微流控蛋白质微珠阵列的制各、优化及应用 同微阵列相比，在微流控芯片中进行同样的非均相免疫分析，其反应时间、 样品和试剂用量还能够进一步缩减。k u s n e z o w 等【7 0 l 证实在微阵列芯片中，生物 大分子的传质仍然是一个限速步骤，尤其当分析对象浓度低时，要达到理想的反 应效果甚至需要十几个小时。尽管可以通过充分地搅拌降低传质过程的影响，但 很明显，试液用量难以降低。而在微流控芯片中，可以很方便地控制液流，试液 的不断更新有效地减弱了传质过程的影响。s a t o 等【6 7 l 在微流控芯片中进行非均相 免疫分析，并证实微通道中抗原抗体反应可在大约l om i n 内完成，整个免疫分 析过程为lh 。对于蛋白质分析方法来说，试样用量的多少是非常值得关注的一 个指标，在很多情况下，整个实验时问的减少不仅仅取决于样品检测步骤。试样 用量的多少也可能决定样品制备步骤所需要的时间。比如，近年来出现的一种新 型的细胞样品制备技术一一激光捕获微切割( l a s e rc a p t u r em i c f od i s s e c t i o n ， l c m ) ，能够从复杂的组织样品中精确地选取特定种类的细胞用于实验，然而这 种方法的效率比较低，样品用量增大将导致耗费的时间成倍增长。此外，样品需 要量大可能导致一些珍贵样品无法得到正确的分析结果。 对于应用非均相亲和识别技术开展蛋白质表达谱研究，目前存在的一个明显 的限制因素是蛋白质亲和识别分子的获得。现有的多克隆、单克隆抗体制备技术 效率低，对于很多种类的蛋白质抗原还没有相应的抗体与之匹配，有的抗体亲和 力弱，极大地限制了在微芯片中的使用。实际上，在抗体的制备方面已经面临一 场革新。噬菌体展示、核糖体展示等高通量蛋白质工程技术已经建立，尽管这些 技术还无法用于合成复杂蛋白质，但在基因工程抗体的制备中却显示出了巨大的 潜能，甚至可通过分子的体外进化在短时间内制备和筛选出稳定性、亲和力、选 择性优异的抗体，从而有助于实现高密度、高活性抗体固定化。国内目前也有研 究者开始致力于基因工程抗体芯片的研究，例如，赵新生等1 7 l ，7 2 1 已在噬菌体抗体 芯片方面展开了研究。 此外，蛋白质的亲和识别不仅指抗原抗体反应，还包括其他识别蛋白、 a p t a m e r 、分子印迹聚合物等识别分子与蛋白质的特异性结合。上述各种蛋白质识 别分子制备技术都已经在发展之中。这些技术不仅具有在短时间内大批量制备针 对不同蛋白质的亲和识别分子的潜力，而且将能够针对不同的亲和力需求、提供 稳定性优良的亲和识别分子，降低亲和识别分子固定化的难度。这些新型蛋白质 识别分子制备必将能给蛋白质表达谱的研究提供多种性能优异的亲和识别分子。 将非均相亲和结合与微流控芯片结合进行蛋白质表达分析具有广阔的发展前景。 1 3 3 2 微珠一一新型的识别分子固定化载体 在基于非均相亲和识别技术的微芯片，其设计和制作首先要涉及的问题就是 识别分子固定化载体的选择。微阵列芯片的常用固定化基质有膜、玻片、凝胶， 硕士学位论文 在这些基质上构建识别分予阵列的技术已经取得了重大的进展，但是，平板基质 上的阵列设计处于封闭系统，缺乏灵活性；微流控芯片内，以微通道内壁、膜、 凝胶作为固定化基质同样存在设计封闭、缺乏灵活性的问题，此外，生物大分子 固定化操作更为烦琐 近几年，微珠成为研究者看好的一种新型的识别分子固定化载体，在微阵列 技术中得到了应用【7 3 川l 。和平面式微阵列芯片相比，微珠阵列具有突出的优点， 如更高的通量和更可靠的数据，实验设计更加灵活，在颗粒上更加易于进行灵活 的d n a 和蛋白质修饰，各种表面已经官能团化的微珠已经商品化、成本较低， 等等。w a i t 等t ，引l 将表面修饰了不同d n a 探针的各种微珠固定在光纤束末端， 制作了光纤微珠阵列，该阵列直径为3 0 0 l o o o “m ，包含50 0 0 至5 0o o o 个点阵。 该阵列具有高度的灵活性，可以很容易地将新的探针序列加入探针库，节省了时 间和材料n i e 等弘2 】发展了一种量子点包埋示踪的高通量聚合物微珠技术( 图 1 7 ) ，将不同发射光的量子点按特定配比包埋于聚合物微珠内，从而可以实现聚 合物微珠的光学编码以及生物大分子的高通量分析更多的工作将流式细胞分析 结合起来，发展了悬浮徼珠阵列技术【鼬q 5 】和可产生浩大编码库的s p l i t - a n d m i x 处 理方法1 7 卯。 图1 7 量子点包埋示踪的高通量聚合物微珠技术【“1 上图。徽珠阵列编码原理图； 下图，同一激发光下的荧光成像图，其中，左图为编码微珠，右图为量子点溶液 一维微流控蛋白质微珠阵列的制各、优化及应用 微珠技术在微流控芯片里的应用同样引人注目【6 5 8 鲫。但是微通道里难以很 好地控制微珠，这是相关研究工作报道不多的个重要原因，也是研究者们试图 解决的一个问题。例如，s a t o 掣6 那通过在微通道内设置微堰截留微珠( 图1 8 ) ， 但是特殊结构对加工工艺水平往往有较高的要求，并且微珠的数量和位置不容易 控制、难以构成阵列，限制了分析通量的提高。 图1 8 在徽流控芯片微通道内设置微堰结构用于截留微珠【”1 。 ( a ) 、( b ) ：芯片结构示意图：( c ) ：上图为芯片照片，下图为芯片微通道的显微成像图。 1 4 一维微流控微珠阵列的发展 集成微珠阵列技术和微流控技术是微全分析系统( 阳a s ) 的一个挑战性工作， 对于发展微量试样操纵可控的，高通量的微分析平台是十分必要的【9 2 一钔。传统的 芯片主要是微流控芯片和微阵列芯片两种，将两种芯片结合起来的研究工作报道 极少。传统的微阵列芯片存在着本身固有的一些局限性，如阵列设计不灵活，处 于封闭体系，分析结果缺乏标准等，另外试剂和样品的消耗相对较大。微流控芯 片对试剂和样品的消耗可以做到非常少，不过在微通道中进行化学与生物修饰存 在很多的困难。 结合微流控技术和微珠阵列技术，本实验室构建了一种新型的生物大分子检 测分析芯片一维微流控微珠阵列 棚7 1 。这种芯片平台技术将微流控技术与基 于高通量的大规模并行分析方法的阵列芯片结合起来，发展成基于微流控串行分 析技术的一维微珠阵列生物芯片。其设计思想是将阵列芯片上的每个点阵用一个 微流控通路串起来，实现微流控通路里的点阵化，在微流控操纵下将超微量试液 引入阵列内并逐一流过每个点阵。在这个平台中，每个点阵是一个表面功能化了 硕士学位论文 的微珠，微珠置于微流路中设置的小室里，可以相对自由地运动 一维微珠阵列芯片的构建如图1 8 所示，芯片由聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 基片与玻片粘合封装制成，p d m s 基片上印有设置了多个小室的微通道，通过显 微操作在每个小室内放置一种功能化微珠，从而构成微珠阵列。功能化微珠是一 维阵列芯片的敏感元件，每个微珠表面修饰了一种识别分子，当样品流经小室时。 微珠表面的识别分子特异性地识别、捕获目标分子 图1 8 一维微流控微珠阵列结构示意圄 这种设计有很多优点，一方面增加点阵芯片上微量体积试样操纵的可控性和 简便性以及降低试剂和样品的消耗，另一方面在微流控下大大有利于点阵上生物 大分子的相互作用。将修饰微珠引入芯片体系，避免了在芯片微通道内复杂的化 学与生物处理，而微珠修饰是一种灵活、高效，大批量、简单而且价廉的方法 此外，在一维微流控阵列内，微珠在小室里可以相对自由地移动，在微流体的作 用下，微珠表面充分和溶液接触，表面溶液时刻更新，传质影响减小，因此表面 修饰的生物分子与溶液中的目标分子相互作用的几率增大，彼此结合的动力学和 热力学性质都得到改善，从而明显缩短了分析时间。由于每个小室放置的微珠是 已知的，因而可以方便地对所有小室中的微珠进行编码。以直径5 0 p m 的微珠为 例，我们可以在2 c m 长的微通道上设置1 6 0 个以上的小室，充满微通道时微流体 的体积在几十纳升。这种芯片平台的阵列设计非常灵活，便于开展多种研究。运 用这一芯片平台，本实验室在蛋白质表达分析、基因表达分析、单碱基突变检