（发酵工程专业论文）菊芋发酵生产l乳酸的研究.pdf

摘要 中文摘要 近年来，国内外对l 一乳酸的需求日趋增加，而我国l 一乳酸的生产技术比较落后。菊 芋作为种生长能力强、抗盐碱、耐沙漠的作物，其在我国中西部地区的种植面积正以基 地的形式逐年加大。菊芋深加工的研究引起了国内外学者的广泛关注，然而开展菊芋发酵 生产l 一乳酸的研究尚未见报道。由于乳酸菌自身不能利用菊粉，本研究采用一株菊粉酶活 力较强的黑曲霉为产酶菌株，以乳酸杆菌g 0 1 为l 乳酸生产出发菌株，对以菊芋为原料 的l 乳酸的发酵法生产进行了研究。主要内容及结果如下： ( 1 ) 通过对黑曲霉产菊粉酶培养基组成的优化，得到最佳培养基组成：葡萄糖4 0 l ， 蛋白胨3 0g l 和蔗糖脂4p t l 。并在该优化条件下于3 0 ，1 4 0r r a i n 下进行摇瓶发酵，9 6 h 后菊粉酶酶活力达到2 3 0u m l 。进一步研究表明菊粉酶是一种诱导酶，从诱导效果上看， 蔗糖酯相对于菊粉是一种更有效的合成诱导剂，该物质可以激活用于生产菊粉酶的m r n a 的合成。同时由于蔗糖酯在溶液中相对于菊粉，更难水解，所以有着更强的和持续的诱导 作用。研究还发现在使用葡萄糖作为碳源，蔗糖酯作为合成促进剂时，更有利于菌丝体的 生长和酶的合成。通过对该株菌的基因和形态学分析，确定其为黑曲霉。 ( 2 ) 菊粉酶的提取，先采用3 0 饱和度的硫酸铵盐析，沉淀除杂，然后采用7 0 饱和度 盐析，经透析除盐，聚乙二醇2 0 0 0 0 浓缩，得到总酶活2 5 2 5 3 u ，单位酶活1 2 6 2u m l ，比酶 活6 4 3 7u r n g ，回收率8 3 ，纯化倍数2 3 6 。进一步纯化表明黑曲霉产菊粉酶是由两种分子 量相差较小的内切酶和外切酶组成，前者分子量在1 6 5 2 1 0k d a ，而后者的分子量在1 6 0 1 7 0k d a 。比较转化酶和菊粉酶在3 0 的催化动力学发现：转化酶的k i n = 3 4 9m m o l l ， v m = 9 0 9p m o l m i n ，菊粉酶的k m - - 6 8 3m m o l l ，v m = 4 7 6 2 t m o l m i n ，这表明转化酶的最大 反应速率接近菊粉酶的2 倍，然而达到最大反应速率所需底物的浓度却接近菊粉酶的一半。 ( 3 ) 通过d e s 和n t g 对乳酸杆菌g 0 1 进行诱变，并进行耐渗透驯化，使菌株以葡萄 糖为底物产酸达到9 2 8 l ，提高了近1 倍。乳酸菌g 0 2 菌株经过多次传代接种，表现出 较好的传代稳定性。通过对该菌株的基因、形态学及代谢产物分析，确定其为干酪乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) ，乳酸同型发酵，而且产物中l 乳酸的光学纯度达到9 5 以上，为一 株较为理想的l 乳酸生产菌株。 ( 4 ) 为了消除菊粉酶合成体系中的产物抑制现象，降低发酵液中黑曲霉菌丝体密度， 同时避免在同步糖化与发酵菊芋产乳酸工艺中的染菌问题，使乳酸杆菌在菊芋糖化酶液中 提前形成优势菌群，本研究采用在黑曲霉产酶培养基中适时接入乳酸菌的混合培养工艺， 并对混合培养工艺条件进行了优化。结果表明，在产酶培养开始1 2h 接入乳酸杆菌，可以 显著提高黑曲霉后期产菊粉酶的活性，在优化的培养基中，经过6 0h 的培养，菊粉酶活力 将达到2 5 0u m l ，较参照水平( 5 0u m l ) 提高了近4 倍。进一步研究发现，乳酸菌的接入 显著地降低了发酵液中可发酵性糖的浓度，发酵液中黑曲霉菌丝体浓度降低到参照的一 半，而且黑曲霉的茵丝体形态发生了明显的改变，从而更有利于生存在竞争的环境中。 摘要 ( 5 ) 对采用同步糖化与发酵工艺利用菊芋生产l 乳酸的工艺进行了探索，研究发现最 适发酵工艺为菊粉酶活量5 0u m l ，接种量为3 5 ，菊芋粉抑制浓度为2 3 0g l ，碳酸钙浓 度5 0g l 。为了进一步提高乳酸发酵活力，将柠檬酸代谢引入乳酸发酵工艺，结果表明： 柠檬酸代谢可以显著提高乳酸杆菌的抗酸胁迫能力和乳酸发酵活性，最适柠檬酸添加浓度 为1 0g l 。在最佳工艺条件下，通过采用5 0 初始水解1 h 的补料发酵工艺，经4 0 ， 3 0h 发酵，l 乳酸浓度达到1 4 1 5 l ，得率为5 2 4 9 乳酸l o o g 菊芋粉。 关键词：l 乳酸，菊芋，诱变育种，发酵，乳酪杆菌，黑曲霉 a b s t r a c t a b s t r a c t r e c e n t l y ，t h es h a r p l ye n l a r g e dm a n u f a c t u r eo ft h eb i o d e g r a d a b l ep o l y l a c t i d ep o l y m e rh a s i n c r e a s e dt h eg l o b a li n t e r e s ti nt h ep r o d u c t i o no fl l a c t i ca c i db yu s i n gf e r m e n t a t i v er o u t e j e r u s a l e ma r t i c h o k ec a ng r o ww e l l i np o o rl a n da n ds h o w sah i g ht o l e r a n c et of r o s ta n dv a r i o u s p l a n td i s e a s e s h o w e v e r ，t h e r eh a v eb e e nf e ws t u d i e so nt h el 1 a c t i ca c i dp r o d u c t i o nf r o m j e r u s a l e ma r t i c h o k e ，w h i c hw a sn o tf e r m e n t a b l ef o rl a c t o b a c i l l u ss p i nt h i sd i s s e r t a t i o n ， a s p e r g i l l u sn i g e rs l - 0 9 ，a na c t i v ei n u l i n a s ep r o d u c e rw a su s e dt of o r mt h ei n u l i n a s e ，a n d l a c t o b a c i l l u ss p g 01a sap a r e n tl 1 a c t i ca c i dp r o d u c t i o ns t r a i nw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h e p r o d u c t i o no fl 1 a c t i ca c i df r o mj e r u s a l e ma r t i c h o k e i t sc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h eo p t i m i z a t i o no fm e d i u mc o n t e n t sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o ra s p e r g i l l u sn i g e r s l 一0 9t of o r mi n u l i n a s ew a sc o n d u c t e d t h eo p t i m u mm e d i u mc o n t a i n sg l u c o s e4 0 9 l ，p e p t o n e 30 9 l ，s u c r o s ee s t e r4 9 l u n d e rt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，i n u l i n a s ea c t i v i t yo f 2 3 0 u m lw a so b t a i n e da t3 0 o nr e c i p r o c a t i n gs h a k e rw i t h14 0r p mi n9 6h f u r t h e rs t u d i e s f o u n dt h a ts u c r o s ee s t e rw a sam o r ee f f e c t i v ei n d u c e rt h a ni n u l i nf o ri n u l i n a s ep r o d u c t i o n ，w h i c h c a np r o m o t et h es y n t h e s i so fm i 矾af o rt h ef o r m a t i o no fi n u l i n a s e m e a n w h i l e a ss u g a re s t e r w a sm o r er e s i s t a n tt oh y d r o l y s i st h a ni n u l i n ，s ot h a ts u c r o s ee s t e ra c t sa sap e r s i s t e n ts i g n a lt o i n i t i a t ear e s p o n s ei nt h ec e l lt o p r o v o k e t h et r a n s c r i p t i o no fm r n aa v a i l a b l ef o r f r u c t a n o h y d r o l a s es y n t h e s i s m o r e o v e r , i tw a sf o u n dt h a tt h em e d i u mw i t hg l u c o s ea n ds u c r o s e e s t e ra sc a r b o ns o u r c ea n di n d u c e rr e s p e c t i v e l y ，w e r em o r ef a v o r a b l ef o rt h eg r o w t ha n d e n z y m e ss y n t h e s i so ft h i ss t r a i n t h es t r a i ns l - 0 9w a si d e n t i f i e da sa s p e r g d l u sn i g e rb yg e n e t i c a n dm o r p h o l o g i c a la n a l y s i s ( 2 ) i nt h ep r o c e s so fi n u l i n a s ep u r i f i c a t i o n s a l to u tw i t h30 a n d7 0 o fa m m o n i u ms u l f a t e w e r eu s e dr e s p e c t i v e l y t h r o u g ht h es a l t i n go u tb yd i a l y s i sa n dc o n c e n t r a t e ，t h ee n z y m e sw e r e o b t a i n e d f u r t h e rs t u d i e sf o u n dt h a tt h ee n z y m ef o r mb ya s p e r g i l l u sn i g e rw a sc o m p o s e db y i n u l i n a s ea n di n v e r t a s e a n dt h ed i f f e r e n c eo fm o l e c u l a rw e i g h tb e t w e e nt h eb o t he n z y m ew a sn o t s i g n i f i c a n t t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ei n u l i n a s ew a sa r o u n d1 6 5 - 2 1 0k d a ，a n dt h ei n v e r t a s e w a s16 0 17 0k d a t h em i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n to ft h ei n u l i n a s ea n di n v e r t a s ea t3 0 w e r e k m = 3 4 9m m o l l ，a n dv m = 9 0 9r t m o l m i nf o ri n v e r t a s e ，a n dk m = 6 8 3m m o l l ，v r n = 4 7 6 2 l a m o l m i nf o ri n u l i n a s e r e s p e c t i v e l y t h o s er e s u l t ss i g n i f i e dt h a tt h em a x i m u mr e a c t i o nr a t eo f i n v e r t a s ew a sn e a r2 f o l dh i g h e rt h a nt h a to ft h ei n u l i n a s e ，h o w e v e r ，t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n r e q u i r e df o rm a x i m u m r a t ew a so n l yh a l fo ft h ei n u l i n a s e ( 3 ) t h ep a r e n ts t r a i no fl a c t o b a c i l l u ss p g 一01w a st r e a t e db yd i e t h y ls u l f a t e ( d e s ) ， n m e t h y l - n - n i t r o - n - n i t r o s o g u a n i d i n e ( n t g ) ，a n dd o m e s t i c a t e dw i t hh i g hc o n c e n t r a t i o no f f r u c t o s ea n dl a c t i ca c i d as t r a i ng 0 2w h i c hc o u l da c c u m u l a t e9 2 8g ll 1 a c t i ca c i du s i n g g l u c o s ea sc a r b o ns o u r c ew a so b t a i n e d t h es t r a i n so fg 0 2a l s op r e s e n t e df a v o r a b l eg e n e t i c s s t a b i l i t ya f t e rs e v e r a lt i m e so ft r a n s f e r s s t r a i n sg 0 2w a si d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u se a s e l ， h o m o f e r m e n t a t i o n ，a n dc a l lp r o d u c el ( + ) l a c t i ca c i dw i t ha no p t i c a lp u r i t yo fo v e r9 5 t h e r e f o r e t h i ss t r a i nw a saf a v o r a b l es t r a i nf o rl 1 a c t i ca c i dp r o d u c t i o n ( 4 ) t oa v o i dt h ep r o d u c tr e p r e s si nt h ei n u l i n a s ep r o d u c t i o ns y s t e ma n dd e c r e a s et h eb i o m a s s i i i a b s t r a c t o fa s p e r g i l l u sn i g e ri nt h ee n z y m ep r o d u c t i o nm e d i u m ，a n dt or e m o v et h ec o n t a m i n a t i o ni nt h e s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o np r o c e s sf o rp r o d u c t i o no fl a c t i ca c i df r o m j e r u s a l e ma r t i c h o k e ，t h el a c t o b a c i l l u ss p g - 0 2w a si n o c u l a t e dt ot h ee n z y m ep r o d u c t i o n m e d i u mt of o r ms u p e r i o r i t yb a c t e r i u mb e f o r el a c t i ca c i df e r m e n t a t i o na n dt h ec o m p o s eo ft h e m e d i u mw a so p t i m i z e d t h er e s u l t ss i g n i f i e dt h a tw h e nt h el a c t o b a c i l l u ss p s t r a i nw a s i n o c u l a t e da t12ho ft h ec u l t u r e ，t h ee n z y m ea c t i v i t yw a se n h a n c e ds i g n i f i c a n t l y a f t e r6 0ho f c o - c u l t u r e ，i n u l i n a s ea c t i v i t yr e a c h e d2 5 0u m l ，w h i c hw a s4 - f o l dh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o l ( 5 0u r n l ) 谢t hs i n g l es t r a i n f u r t h e rs t u d i e sf o u n dt h a tt h ei n o c u l a t i o no fl a c t o b a c i l l u ss p d e c r e a s e dt h ef e r m e n t a b l es u g a ri nt h em e d i u md r a m a t i c a l l y , a n dt h eb i o m a s so fa s p e r g i l l u s n i g e rw a sd e c r e a s e dt oh a l fo ft h ev a l u ei nt h ec o n t r 0 1 t h em y c e l i a lc o n f i g u r a t i o no ft h e a s p e r g i l l u sn i g e rc h a n g e do b v i o u s l y , w h i c hw a sm o r ef a v o r a b l et os u r v i v ei nt h ec o m p e t i t i v e e n v i r o n m e n t ( 5 ) t h es i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o np r o c e s sf o rl 1 a c t i ca c i dp r o d u c t i o n f r o mj e r u s a l e ma r t i c h o k ew a si n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nw a s i n u l i n a s ea c t i v i t y5 0u m l ，i n o c u l a t i o nv o l u m e3 5 j e r u s a l e ma r t i c h o k ec o n c e n t r a t i o n2 3 0g g l i tw a sa l s of o u n dt h a tt h ec i t r a t em e t a b o l i s me n d o w e dc e l l sw i t he x t r aa b i l i t yt oc o u n t e r a c tt h e a c i dt o x i c i t y , a n dt h e ne n h a n c et h el a c t i ca c i dp r o d u c t i v i t y t h eo p t i m i z e dc i t r a t ec o n c e n t r a t i o n w a s10 l u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o ni nt h ef e d b a t c hc u l t u r e ，t h el 1 a c t i ca c i dw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no f1 4 1 5g lw a so b t a i n e da t4 0 i n3 0h ，w i t hay i e l do ft h e5 2 4 9l a c t i c a c i d 10 0 9j e r u s a l e ma r t i c h o k ef l o u r k e yw o r d s ：l - l a c t i ca c i d ，j e r u s a l e ma r t i c h o k e ，m u t a g e n e s i sb r e e d i n g ，f e r m e n t a t i o n ， l a c t o b a c i l l u sc a s e i ，a s p e r g i l l u sn i g e r i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 芋名：茹磊争一日 期：尘乒一 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江 南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：三每盘耻导师签名：一盈蛆 日 期：壶通，! 兰：堑 第一章绪论 第一章绪论 1 1 菊芋概述 菊芋又称洋姜，为菊科( c o m p o s i t a e ) l f i - 日葵属多年生草本植物，原产北美洲，于1 7 世纪 传入欧洲，后传入我国。菊芋是能形成地下块茎的栽培种，9 月上旬开始开花，地下块茎 开始膨大，早熟品种1 0 月中旬地上直立茎成熟，晚熟品种到1 1 月上旬才成熟。新鲜菊芋块 茎中各营养成分的含量见表1 1 【1 1 。 表1 - 1 鲜菊芋块茎的营养成分 t a b l e1 - 1n u t r i e n tc o m p o s i t i o ni nt h ef r e s hj e r u s a l e ma r t i c h o k e 大量成分( g k g )微量成分( m g k g ) 水分熬灰分警訾嚣薯钙磷铁v c v b tv b 2 7 9 7 91 6 6 12 8 36 o】11 01 6 04 91 1 98 46 00 1 70 0 6 菊芋适合于我国北纬3 6 - - 4 0 0 、东经1 0 2 1 0 5 0 区域种植，即最适合在地处黄土高原和 青藏高原的结合部的青海、甘肃和宁夏地区进行栽种。这些地区种植的菊芋作物不但产量 高，而且果聚糖含量也高( 果聚糖含量平均为1 6 左右) ，是十分良好的菊粉生产原料。近 年来随着科技的发展，菊芋加工成的菊糖、酒精、食品添加剂、保健品等受到了广大消费 者的欢迎。 当前，我国菊芋种植区主要集中在甘肃、青海和内蒙一带。其种植一般是在大型加工 企业的推动下进行的。2 0 0 6 年底，又一个2 万亩菊芋深加工项目落户河南省台前县，该项 目总投资约5 0 0 万美元。项目分两期建设，一期为种植2 万亩菊芋( 洋姜) ，二期为菊芋 ( 洋姜) 深加工。据专家预计，项目投产后亩产量可达5 , 0 0 0 公斤，2 0 0 8 年起估计每年将 有5 , 0 0 0 吨的菊芋粉从该县出口到国外。从2 0 0 1 年春季开始，青海威德生物技术有限公 司在青海、甘肃、宁夏部分地区推广指导种植菊芋作物。2 0 0 4 年共种植菊芋2 万亩，其中： 青海省1 4 万亩，甘肃、宁夏两省区合计6 , 0 0 0 亩。到2 0 0 7 年，菊芋种植面积将达到1 2 万亩，其中：青海省8 万亩，甘肃、宁夏两省区合计4 万亩，菊芋产量将达到2 5 万吨。 2 0 0 8 年上半年，在伊利公司的带动下，另一1 0 万亩菊芋示范基地落户内蒙古通辽市。 菊芋是富有开发潜力的一种宝贵资源，可广泛用于食品、医药、保健品、饮料等行业。 研究表明，由于菊粉和低聚果糖都是益生素，能调整肠道内的微生物菌群的分配，选择性 地促进肠道内有益菌群的生长，从而促进钙的吸收，因而作为膳食纤维复合物已被正式认 可。由于人们越来越不欢迎在食品中添加蔗糖、葡萄糖等热值高并有一定副作用的食糖， 而果糖的热量低，甜度高，便成为了比较理想的食品用糖。菊芋已被列为国际组织认定的 新型果糖替代物和欧盟新作物发展计划的首选作物，市场潜力巨大，经济效益可观，因此 具有广阔的开发前景。 目前在我国对菊芋的利用还停留在腌菜食用、家禽饲料、防风固沙等用处。由于经济 价值低，农民缺乏种植的积极性。每吨菊芋块茎的收购价仅为3 0 0 - - , 7 0 0 元。菊芋块茎经过 江南大学博士学位论文 简单地去皮、切片、烘干、打粉后的菊芋粗粉的售价一般为每吨2 ，0 0 0 元。而在国际上，一 些发达国家，如日本在收购中国菊芋粗粉后经过精制提纯后的菊粉售价达到每吨4 0 ，0 0 0 元 左右。已有不少菊芋制品问世，主要是菊芋浓缩汁、菊芋粉等产品。因此研究菊芋深加工 技术，对推动农产品加工业的科技进步具有深远的意义。 菊芋的其它一些深加工制品的开发状况目前还不太令人满意，如以菊苣( 也是一种产 菊粉植物) 为原料生产菊粉和低聚果糖，已经实现了工业化，但目前尚未见有以菊芋作为 原料的报道。关于用菊芋为原料生产果糖，国外从2 0 世纪7 0 年代开始研究，国内从9 0 年代 开始研究，但到目前为止国内外均未达到工业化水平，其主要原因是尚无满足工业化生产 的酶制剂。 1 2 菊粉的特性 菊粉是由d 呋喃果糖经p ( 1 _ 2 ) 糖苷键聚合而成的一种直链结构多糖，果糖链的末端 有一分子的葡萄糖。菊粉的分子式表示为g f n 2 l 。其中g 为终端葡萄糖单位，f 代表果糖 分子，1 1 则代表果糖单位数。菊粉的平均分子质量是5 5 0 0d a 左右。此外，e m s t l 2 1 报道， 菊糖中还含有少量末端不连有g 的果聚糖( i n u l o n o s e ) 。 菊粉受植物种类、生长条件、加工方式等因素影响而使果糖聚合度不同，一般菊粉聚 合度为2 6 0 ，当聚合度为2 9 时称为低聚果糖。菊粉经内源酶水解得到两种构型低聚物g f n 型和f n 型：g f n 型末端连接葡萄糖，不具有还原性，f n 型末端连接果糖，具有一定还原性。 菊粉一般为白色粉末状物，无定性态，纯品无味，但一般菊粉中都混有少量单糖或双 糖而略带甜昧。菊粉熔点1 7 8 ，比重为1 3 5 易吸收空气中水分。菊粉可溶于水，微溶 于冷水和酒精，在水中溶解度随温度升高而增大，1 0 时溶解度为6 ，9 0 为3 5 ；且菊 粉溶解度还与其聚合度有一定关系，聚合度越大，其溶解度越小p ，4 j 。 菊粉是一种非消化性寡糖( n d o ) ，在自然界中大约有3 6 ，o o o , 中植物，包括双子叶植物 中的菊科、橘梗科、龙胆科等1 1 个科以及单子叶植物中的百合科、禾本科，都含有丰富的 菊粉【5 】。不同的植物来源、收获季节、气候、土壤等生产条件以及生产加工过程将对菊粉 平均分子质量和聚合度产生重要影响。 表1 - 2 一些常见植物中菊粉的含量 t a b l e1 - 2t h ec o n t e n to fi n u l i ni ns o m ec o m m o np l a n t s 菊糖广泛分布在菊芋( h e l i a n t h u st u b e r o s u s ) 、菊苣( c i c h o r i u mi n t y b u s ) 、波罗门参 ( s a l s i f y ) 、蒲公英( a n d e l i o n ) 、大丽花( d a h l i a ) 等植物组织中，不同植物及同一植物在不同生 育期，即使在同一植物中均存在着不同聚合度的菊糖，其聚合度从2 6 0 ，分子质量为3 5 0 0 2 第一章绪论 5 5 0 0d a ，含7 5 - 8 5 果糖和1 5 2 5 葡萄糖【6 j 。 菊粉作为除淀粉外的一种能量储备物质存在于许多植物中，同时，它还用于保持植物 体内渗透压的平衡。菊粉易溶且分子的聚合度能够变化，植物可以在不改变总糖含量的条 件下通过调节液泡内菊粉分子的聚合度来调节细胞的渗透压。这使得同一植物在不同的生 长时期菊粉的含量和聚合度都存在着差异。 工业化生产中，菊粉主要从菊芋或菊苣块茎中提取。菊粉的提取方法主要有水热法和 微波法。严慧如1 5 j 报道的水热法比较简单，包括提取、纯化和干燥等3 个基本过程，王启为 等【6 】发现水热法提取菊粉的最佳工艺条件为：料水质量比为l ：1 ，一次性提取，提取温度为 9 5 ，提取时间为1 5m i n 。 工艺流程如下： 预处理过的菊芋_ 热水抽提_ 浓缩叶活性炭脱色_ 离心- 上清液用s e v a g 法除蛋白质， 重复4 5 次_ 9 5 乙醇沉淀_ 离心一过阳离子和阴离子交换树脂除杂质一真空干燥一粉 碎得产品。 1 3 微生物菊粉酶的研究现状 菊粉酶( i n u l i n a s e ) 是一类能够水解菊粉分子链中p 2 ，1 d 果糖糖苷键的水解酶，学名为 p 2 ，1 - d 果聚糖酶，又称为p 果糖苷酶、p 果聚糖水解酶和p 2 ，1 d 果聚糖水解酶( e c 3 2 1 ) 。 菊粉酶主要来源于菊科植物的组织和部分微生物。来源于植物的菊粉酶底物专一性较强， 仅作用于菊粉，而由微生物产生的菊粉酶大部分都能水解有d 2 和1 d 果聚糖果糖苷键的 糖，如菊糖、蔗糖和棉子糖，有一小部分仅能水解菊糖【7 ，8 】。 根据菊粉酶在微生物体内主要分布于细胞内、细胞壁和细胞外，分别称为胞内酶、胞 壁结合酶和胞外酶【9 j ，它们的比例主要受菌种、碳源、温度和p h 的影响。随着温度的 升高胞外酶比例下降，而其他两种酶比例上升：以菊粉或蔗糖为碳源培养微生物时， 前者胞外酶比例高于后者，其他两种酶则相反；胞外酶主要由真菌合成，细胞壁结合 酶主要产自酵母，适当的p h 使细胞壁通透性增大，提高了胞外酶比例，其他两种酶比 例下降。 根据菊粉酶酶切果聚糖链的方式分为内切酶( e c 3 2 1 7 ) 和外切酶( e c 3 2 1 8 0 ) 。内切菊 粉酶随机地断开菊粉链内部的糖苷键，水解得到的主要是低聚果糖，常由真菌分离出来； 外切菊粉酶作用于菊粉链的非还原性末端的糖苷键，逐一水解释放出果糖，可以得到高纯 度果糖，外切菊粉酶在胞内、胞壁、胞外都有分布。 据不完全统计，产菊粉酶的有丝状真菌1 7 个属4 0 余种；酵母菌l o 个属2 0 余种；细 菌1 2 个属1 0 余种【1 0 。1 3 】。国外研究证明，霉菌的菊粉酶活性高于酵母，其中以a s p e r g i l l u s 属和p e n i c i l l i u m 属微生物所产酶的活力为最高【1 4 】。 微生物来源的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。文献报道在细菌【1 4 1 、酵母 菌和霉斟1 6 1 中有一些微生物产菊粉酶，但大多数微生物产外切型菊粉酶【1 7 1 ，对产内切型 菊粉酶的微生物的报道较少【1 8 ，1 9 1 ，只有少数青霉和曲霉能产内切菊粉酶而且还伴随有外切 江南大学博士学位论文 菊粉酶2 0 2 1 1 。外切菊粉酶和内切菊粉酶在性质上非常相似，给二者的分离带来了困难。 表1 3 不同研究者在不同条件下所得的菊粉酶的比较 t a b l ei - 3c o m p a r i s o no fi n u l i n a s ea c t i v i t yo b t a i n e db yd i f f e r e n tr e s e a r c h e su n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n 8 s f e ，s u c r o s ef a t t ya c i de s t e r 产菊粉酶的菌种一般是从腐烂的菊芋或菊苣的根际土壤中分离，并利用以菊粉为唯一 碳源的分离培养基分离筛选得到的。g u i l l e r m o 等用r b ( r e m a z o l 晰l l i a n t ) 亮蓝染料法瞄j ，筛 选得到两株高产菊粉酶的菌株v i r 9 和v i r 6 4 。s h a m a 从菊苣根部的土壤中分离出青霉菌， 再经n t g u v 和e t b r - u v 处理后，其菊粉酶活力有所提高，表明产菊粉酶的微生物在经过 诱导有机突变的物质处理后，菊粉酶活有所提高1 2 引。另一方面，由于菊粉酶合成工艺中存 在明显的底物抑制现象；所以，进一步降低发酵培养基中可发酵糖的浓度是提高黑曲霉产 酶的前提。而在多菌种混合发酵体系中，由于不同菌种的生长速率不同，其耗糖速度也不 一致，故可以通过引入多菌株培养体系，以达到降低培养基中残糖浓度的目的。因此，为 了进一步提高黑曲霉产菊粉酶活力，本研究采用多菌株、液态发酵工艺，并对菊粉酶生产 工艺进行了探索。结果表明，黑曲霉和乳酸菌混合培养可以显著提高菊粉酶的合成水平， 为菊粉酶的合成提供了新的思路。 1 4 菊粉酶的应用 酶法水解可彻底水解菊粉产生果糖和少量葡萄糖，菊粉酶的这种功能使得它在将来成 为一种工业用酶有着许多潜在优势，菊粉酶法生产果糖和果葡糖浆的工艺简单，只需一步 酶解，生产成本低；总糖中果糖含量可高达7 0 9 0 ，可直接制备高果糖浆。罗英等人用 黑曲霉a l 1 5 4 产生的菊粉酶直接水解菊芋提取液，在p h 5 0 ，温度6 0 ，底物浓度1 0 2 0 ( 总糖浓度) 条件下，酶用量仅需3 0u g 菊粉，酶解时间仅1 0h ，底物降解率达9 7 2 ， 降解产物中果糖占总糖的8 6 1 【2 4 】。另一方面，利用菊粉外切酶或菊粉内切酶和菊粉外切 酶的协同作用，以水解菊糖一步生成果糖，该工艺简单，果糖产率高达9 0 。利用菊粉酶 水解菊粉生产果糖的研究报道很多，但是，目前尚没有选育出能够满足工业化酶制剂生产 的高活力菌株，所以，这些严重影响了菊粉酶在果糖生产上推广应用。 国外此项研究主要利用微生物菊粉酶生产超高果糖浆，现在正研究菊粉酶及产生菌的 固定化技术和应用于菊粉的水解工艺【2 5 1 。但由于酶的稳定性和某些作用机制上存在一些问 题，尚未见投入工业生产或中试的报道。国内此项研究起步较晚，有少许研究也仅仅局限 于菌种筛选和酶的性质研究【1 5 ，2 0 1 。 4 第一章绪论 另外，菊粉酶被应用于开发菊芋资源的酒精生产中。利用菊粉酶生产酒精，国外相关 研究较多1 2 6 2 7 j ，用产菊粉酶菌a s p n i g e ，与酒精酵母同步糖化菊芋或菊粉发酵产酒精的研 究，几乎能完全将菊粉发酵成酒精。国内也有相关报道，葛向刚2 s 】以菊芋粉为底物，利用 黑曲霉s l 0 9 和塞尔雏亚酵母z 0 6 采用同步糖化与发酵法，3 0 发酵6 0h ，使发酵醪酒精体 积分数达到1 9 o ，转化率为理论转化率的8 6 。顾天成【7 】等对以菊芋为原料，将酿酒酵母 细胞与菊粉酶共同固定化发酵生产乙醇的最适发酵条件进行了探讨。实验结果表明，当温 度为3 0 ，p h 值为5 5 ，发酵液糖度为2 0 ，反应器连续流动流速为1 3 5m l m i n 时，发酵 速度最快，酒精转化率最高，在发酵2 4 h 时酒精转化率达9 8 5 ，发酵醪中乙醇体积分数达 1 1 9 8 。 然而，在菊粉酶的研究与应用中，一直存在一些问题。由于我国菊粉酶的研究始于9 0 年代初，目前已有一些关于菌株筛选、诱变、酶的分离提纯及酶学性质研究，及实验室小 规模发酵方面的报道【1 7 珈】，但绝大多数仍停留在实验室研究阶段。国内外科研工作者在工 程菌的构建、菌株的诱变、培养基组成和培养条件的优化、酶学特征等方面做的大量的工 作【2 l 倒j ，但菌株的产酶活力仍不能满足工业化水平。所以寻求高效的菊粉酶合成诱导剂， 探索其诱导机理，并优化其产酶条件在推动菊粉酶的工业化应用上意义深远。 1 5 同步糖化与发酵菊芋生产酒精的研究 利用菊芋生产酒精自2 0 世纪三十年代以来研究不断深入，较为常用的工艺有两步法， 即先糖化后发酵，该工艺成本较高；另一种为一步法，是利用具有产菊粉酶的酵母，直接 发酵生产酒精，该法的最终发酵醪酒精含量较低；同时二者的转化率也较低。2 0 世纪九十 年代开始出现同步糖化与发酵( s s f ) 利用菊芋生产酒精，生产周期为5d t 2 6 倒j 。 研究表明，在使用菊芋为原料的同步糖化与发酵生产酒精工艺中，由于鲜菊芋的水分 在7 5 左右，总糖含量为2 0 左右，所以直接利用菊芋的根茎发酵生产酒精的最终发酵醪 酒精浓度低于1 1 ，经浓缩的菊芋汁由于糖的浓度较高，抑制了酵母的活力，使其发酵醪 最终酒精浓度低于1 5 ，而且发酵不彻底，周期较长。虽然直接利用经提纯的菊粉，采用 同步法经过5d 的发酵可以把酒精浓度提高到2 1 3 ，但菊粉价格目前较高，不适合用于 酒精的生产。在同步糖化与发酵中，由于在发酵过程中糖的浓度始终保持在较低的水平， 使酶活和酵母的活力都得到了充分的发挥，所以将发酵周期缩短到了4 8h ，同时达到了9 0 的转化率。 1 6 乳酸的生产方法 乳酸是一种重要的有机酸，2 0 0 1 年，世界乳酸的总产量为1 3 万吨，2 0 0 2 年超过2 0 万吨， 并逐年上升。据推算，目前世界l 哥l 酸市场需求量为7 0 万吨，美国、日本需求量为3 0 万吨， 其余是欧洲占大部分。据国外预测，至u 2 0 1 0 年，全世界l 乳酸需要量将猛增n 5 0 0 万吨左右， 主要消费领域为食品工业，其次是医药、化妆品等；特别需要指出，国外己开发成功用l 乳酸为原料生产乳酸树脂肠衣线、胶卷、“双降解”塑料技术，即将投入大规模推广阶段， 江南大学博士学位论文 将会成为促进发展l 乳酸的强大推动力。另外各国聚乳酸的生产和应用开发，将为消灭 p s “白色”污染产生划时代的影响，市场潜力巨大。世界著名的a d m 、d u p o n t 、d o w 、c a r g i l l 等公司都将聚乳酸作为一个环境友好且具有广泛应用的全新聚合物平台而加以大力开发， 并力图早日形成新产业。乳酸的生产方法一般有发酵法、酶合成法和化学合成法三种。 1 6 1 发酵法 发酵法生产乳酸是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为底物，利用乳酸菌或霉菌合成乳酸 的工艺。按生产菌合成乳酸的代谢途径及生成产物的不同，可将乳酸发酵分为同型乳酸发 酵( h o m o f e r m e n t a t i o n ) 、异型乳酸发酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o n ) 和混合酸型乳酸发酵( m i x e da c i d f e r m e n t a t i o n ) t 2 9 _ 3 2 1 。 1 6 1 1 同型乳酸发酵