（细胞生物学专业论文）brg1在dna损伤修复中的作用研究.pdf

独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作 所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： ，汐占、弓 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段 保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：圣盏： 日 期：丝丝：五：至 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：盥 日 期：丝竺：笪：至 电话： 邮编： r 、 一 一 -且矿 摘要 染色质高度紧密的折叠阻止了转录因子和辅因子与d n a 的结合，因而通过染色质重 塑以解除这样的抑制环境，对于转录活动的正常进行是至关重要的。目前，染色质重塑 至少是通过两种机制来完成的，一是通过依赖于a t p 的染色质改构复合物，另一是通过 组蛋白修饰酶复合物。前者的典型代表是s w i s n f 复合物，人类以b r g l 或b r m 作为 其a t p 酶催化亚基，b r g l 在基因的转录调控、复制、重组等方面起着重要的作用，但 该亚基在d n a 损伤修复中所起的作用还不是很清楚。 d n a 分子是生命体的遗传物质基础，细胞内的d n a 分子因物理、化学等多种因素的 作用，有可能导致多种类型的损伤。当d n a 受到紫外线照射时，主要产生环丁烷一嘧啶 酮二聚体( c p d ) 和嘧啶6 - 4 嘧啶酮光产物( 6 - 4 p p ) 。对于u 、，照射引起的d n a 损伤主要 是通过核酸切除修复途径进行修复的。 本文主要讨论了在u v 照射引起的d n a 损伤条件下，b r g l 与d n a 损伤修复的关系。 首先建立u v 照射引起的d n a 损伤模型，即通过不同剂量的u v 照射，并采用流式细胞术 对细胞凋亡程度进行检测，用以摸索适合的u v 剂量从而建立该模型。在该模型的基础 上，通过在s w l 3 细胞中瞬时转染b r g l 表达质粒及空载p b j 5 质粒( 对照组) ，经过3 0 j m 2 的u v 照射后，分别以o h 、6 h 、2 4 h 为修复时间进行细胞损伤后修复，最后对细胞早期 凋亡程度进行检测。经过统计分析，结果表明，转染了b r g l 表达质粒的细胞的早期凋 亡程度明显较对照组的程度低，尤其是经过2 4 h 的修复后，说明b r g l 的参与促进了d n a 的损伤修复。这一结果为b r g l 在d n a 损伤修复中所起作用的研究奠定了一定的实验基 础，也为今后深入探索b r g l 在该领域中具体的作用机制提供了线索，更有助于了全面 深入地理解改构复合物在细胞内扮演的各种重要角色。 关键词：u v 照射；d n a 损伤修复；b r g l ；流式细胞术 户 i p h婶j 一 - l a b s t r a c t h i g h l yc o n d e n s e dc h r o m a t i np r e v e n t st h eb i n d i n go ft r a n s c r i p t i o n f a c t o r sa n d t od n a t h e r e f o r e ，i t sc r u c i a lt or e l i e ft h er e p r e s s i v ee n v i r o n m e n tf o rt r a n s c r i p t i o n h r o m a t i nr e m o d e l i n ga c t i v i t i e s r e c e n t l y ，c h r o m a t i nr e m o d e l i n gi sc a r r i e do u tb ya t l e a s tt w om e c h a n i s m s ：a t p d e p e n d e n tc h r o m a t i nr e m o d e l i n g c o m p l e x e sa n d h i s t o n e m o d i f i c a t i o nc o m p l e x e s t h er e p r e s e n t i v eo ft h ef o r m e ro n ei st h es w i s n fc o m l e x ，t h e a t p a s es u b u n i to fw h i c hi sb r g1o rb r mi nh u m a n b r g1p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h e r e g u l a t i o no fg e n et r a n s c r i p t i o n ，r e p l i c a t i o n , r e c o m b i n a t i o na n de t a l h o w e v e r , i t 、s s t i l l u n c l e a rt h a tt h ef u n c t i o nb r g1c a r r i e so u ti nd n a d a m a g ea n dr e p a i r d n ai st h eb a s i so fg e n e t i cm a t e r i a l ，w h i c hm a yg i v er i s et os o m ek i n d so fd a m a g ei n t h ee x i s t e n c eo fp h y s i c a la n dc h e m i c a lf a c t o r s c p da n d6 - 4 p pa r et h em a i np h o t o p r o d u c t s a f t e ru vi r r a d i a t i o n f o rt h i sk i n do fd a m a g e ，n u c l e u t i d ee x c i s i o nr e p a i r ( n z r ) i st h em a j o r r e p a i rp a t h w a y i nt h i sa r t i c l e ，w em a i n l yd i s c u s s e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eb r gia n dd n a d a m a g ea n dr e p a i r f i r s t l y , w es e tu pau v - i n d u c e dd n ad a m a g ea n dr e p a i rm o d e lt h r o u g h d i s t i n c td o s eo fu vi r r a d i a t i o na n dt e s t st ot h ec e l l u l a ra p o p t o s i sb yf l o wc y t o m e t r yi no r d e r t of i n ds u i t a b l eu vd o s e o nt h eb a s i so ft h i sm o d e l ，b r g1e x p r e s s i o np l a s m i da n dv e c t o r p l a s m i dp b j 5w e r et r a n s f e c t e ds e p a r a t e l yi n t os w 13 ，w h i c hw o u l dr e p a i rt h e m s e l v e sd u r i n g t h ed i s t i n c tr e p a i rt i m eo fo h ，6 ha n d2 4 ha f t e r3 0 j m 2u vi r r a d i a t i o n ，t h e nt e s t sw e r ec a r r i e d o u tt oj u s t i f yt h ec o n t e n to fp r i m a r yc e l l u l a ra p o p t o s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep e r c e n t a g e o fp r i m a r yc e l l u l a ra p o p t o s i so fs w13w i t ht r a n s f e c t i o no fb r g 1 e x p r e s s i o np l a s m i dw a s l o w e ro b v i o u s l yt h a nt h a tw i t ht r a n s f e c t i o no fv e c t o rp l a s m i dp b j 5 ，e s p e c i a l l ya f t e rt h er e p a i r t i m eo f2 4 h a l lo ft h e s ea b o v ei n d i c a t e dt l l a tb r g1t o o kp a r ti na n dp r o m o t e dd n a d a m a g e a n dr e p a i r t h er e s u l t sm a d ef o u n d a t i o nf o rt h er e s e a r c ho ft h er o l eo fb r g1o nd n ad a m a g e a n dr e p a i r , a l s op r o v i d e dc l u e sf o rf u r t h e re x p l o r i n gt h es p e c i f i cm e c h a n i s mo fb r g1o nt h i s f i e l d ，a n dh e l p u s t ou n d e r s t a n d g e n e r a l l y a b o u tv a r i e s i m p o r t a n t r o l e st h e c h r o m a t i n r e m o d e l i n gc o m p l e x e sp l a yi nc e l l s k e y w o r d s ：u vi r r a d i a t i o n ；d n ad a m a g ea n dr e p a i r ；b r g1 ；f l o wc y t o m e t r y 玎 一 ： l p ，j 目录 文摘要i 文摘要i i 录i i i 言1 吾l 、染色质改构复合物”1 ( 一) 染色质改构复合物的分类l ( 二) 依赖a t p 的染色质改构复合物的作用机制5 ( 三) 染色质改构复合物与转录调控8 ( 四) s w i s n f 改构复合物与肿瘤发生及发育1 0 ( 五) 染色质改构复合物与核受体1 3 ( 六) 染色质改构复合物与d n a 甲基化1 4 ( 七) 染色质改构复合物与d n a 损伤修复1 5 二、本论文研究的内容与意义1 8 第一部分材料与方法2 0 一、实验材料”2 0 ( 一) 细胞及其培养试剂2 0 ( 二) 质粒2 0 ( 三) 抗体2 0 ( 四) 试剂2 0 ( 五) 仪器设备2 2 二、实验方法2 2 ( 一) 细胞的培养及冻存2 2 ( 二) 质粒的大量制备2 3 ( 三) 脂质体转染方法2 3 ( 四) w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i s 2 4 ( 五) 流式细胞仪检测细胞凋亡2 5 第二部分结果与分析”2 6 一、u v 照射引起d n a 损伤模型的建立2 6 二、b r g l 对于u v 照射引起的d n a 损伤修复的影响2 8 ( 一) s w l 3 ( b r g l - - ) 细胞具有较高的脂质体瞬时转染效率2 8 ( 二) b r g l 可促进d n a 的损伤修复2 9 i i l 第三部分讨论3 3 一、b r g l 的参与促进了u v 照射引起的d n a 损伤修复3 3 结论和主要创新点3 5 参考文献3 6 致谢4 4 在学期间公开发表论文及著作情况“4 5 i v ? 东北师范大学硕士学位论文 己i 吉 jie j 、染色质改构复合物 核小体是染色质的基本单位，由1 4 6b p 的染色质d n a 围绕双拷贝的核心组蛋白h 2 a 、 、h 3 、h 4 形成核小体的核心结构n 1 ，核小体之间的连接d n a 上由组蛋白h 1 结合，由 此形成了1 i n m 的核小体串珠样结构，并由此进一步的折叠缠绕及自我组装形成了染色 质高级结构心3 1 。然而，染色质结构的高度紧密性使得一些细胞核活动的正常进行遇到 障碍，例如，一些基本转录因子及序列特异性调控因子由此不能与相应靶基因的启动子 结合，因而使基因的转录活动不能顺利进行。所以，对于真核细胞而言，所有与d n a 有 关的活动都必须克服染色质结构的紧密性，需要一些具有酶活性的多亚基的复合物来调 整染色质的结构。 迄今为止，发现至少有两类高度保守的染色质修饰复合物。一类是依赖于a t p 的染 色质改构复合物h 3 ，另一类是对组蛋白进行共价修饰的组蛋白修饰酶复合物晦1 。前者是 利用水解a t p 获得的能量，改变组蛋白与d n a 之间的相互作用；后者是对组蛋白的尾部 进行共价修饰，包括赖氨酸的乙酰化、赖氨酸和精氨酸的甲基化、丝氨酸和苏氨酸的磷 酸化、赖氨酸的泛素化、谷氨酸的多聚a d p 核糖基化、赖氨酸的苏素化j 】。这些经过 修饰的组蛋白作为染色质特异位点的标志，为高级染色质结构的组织者及与基因表达相 关的蛋白提供识别位点哺1 。 ( 一) 染色质改构复合物的分类 所有依赖a t p 的染色质改构复合物都包含有一个a t p a s e 亚基，此亚基属于s n f 2 蛋 白超家族。根据亚基的同源性，可分为s w i s n f 、i s w i 、c h d 、i n 0 8 0 、r a d 5 4 亚家族徊3 。 1 s w i s n f 家族 染色质改构复合物的典型代表是2 0 世纪9 0 年代初在酿酒酵母中发现的酵母交换型 转换蔗糖不发酵复合物( y e a s tm a t i n gt y p es w i t c h s u c r o s en o n f e r m e n t i n g ， s w i s n f ) 1 0 。1 2 o 该复合物由约1 1 个亚基组成，包括具类解旋酶功能的s w i 2 s n f 2 亚基 及s w i1 a d r 6 、s w b 、s n f i 、s n p 5 、s n f 6 、s wp 5 9 、s wp 6 1 、s wp 7 3 、s w p 8 2 、r f 9 3 a n e l 等，分子量约2 1 03 k d a 。 对于酵母而言，有两种类型的s w i s n f 复合物，即s n i s n f 和r s c ( r e m o d e l st h e s t r u c t u r eo f c h r o m a d n ) 复合物( 图i - i ) ，前者以s w i 2 或s n f 2 作为催化亚基，后者以s t h l 为a t p 酶亚基。r s c 存在于两类功能不同的复合物中，以包含r s c i 或者r s c 2 为两复 合物的区别n 钔。在细胞内，r s c 复合物的含量远比s w i s n f 复合物的含量丰富得多。 s w i s n f 和r s c 复合物具有不同的功能，酵母r s c 复合物对于细胞生长是必须的，而 东北师范大学硕士学位论文 s w i s n f 复合物则不是。 在果蝇中也鉴定出与酵母s w i s n f 同源的复合物。该复合物以b r a h m a 为催化亚基， 有与b r a h m a 结合的相关蛋白( b a p ) 和与多溴区相关的b a p ( p b a p ) 两种形式，前者包 含o s a 亚基，后者包含多溴区及b a p l 7 0 亚基u 司。 从人类细胞中纯化出与酵母s w i s n f 复合物同源的多亚基复合物的分子量约为 2 m d ，以h b r g i 或h b r m 作为其a t p 酶催化亚基，两者约有7 4 的序列同源性，在体外表 现出相似的生化活性n h 羽，尽管如此，两者在许多细胞生命活动，如增殖和分化，发挥 着不同的功能。s w i s n f 复合物可分为两种类型，即b a f ( b r g l h b r m - a s s o c i a t e d f a c t o r s ) 和p b a f ( p o l y b r o m o a s s o c i a t e db a f ) 。这两种类型的复合物有着相似的亚 基组成，但b a f 2 5 0 只存在于b a f 复合物中，而b a f 2 0 0 和b a f l 8 0 是p b a f 的特有亚基n 蝴3 。 s w i s n f 复合物约有1 0 1 2 个b a f s ，且绝大多数在酵母s w i s n f 和r s c 复合物中都存在 同源物。尽管b r g i 单独作用时就能够对核小体进行有效的改构，但在核心b a f 亚基 ( b a f l 7 0 、b a f l 5 5 、b a f 4 7 ) 的共同参与下，能使染色质改构接近最佳水平啪】。事实上， s w i s n f 复合物不仅仅分为两种类型，还可有多种形式，可以有组织特异性的亚基组成， 也可以与其他因子结合，如h d a c i 2 ，p r m t 5 ，n u m a c 复合物中辅激活子相关的精氨酸甲 基转移酶1 ( c a r m l ) ，转录辅抑制子m s i n 3 a ，肿瘤抑制因子b r c a i 2 蔬矧等。此外， 该复合物的亚基还能与d n a 复制因子，例如，存在于威廉综合征转录因子( w i l lj a m s s y n d r o m et r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，w s t f ) 复合物中的t o p o i i 等结合瞳刀。 通过对r a d 5 4 复合物a t p 酶结构域的x 射线晶体结构的研究，发现该亚基含有七 个亚结构域，在结构上形成了两个片状结构，能够与d n a 结合，称为d e x d 和解旋酶基 序啪瑚1 。此外，酵母s w i s n f 复合物的s w i 2 s n f 2 亚基，在其c 端含有一个溴区，对组 蛋白尾部乙酰化的赖氨酸有识别作用啪_ ；s w i l 亚基含有一个结合富含a t 序列的a r i d 结构域，后在果蝇的o s a 亚基、酵母r s c 复合物的r s c 9 亚基以及哺乳动物的b a f 2 5 0 、 b a p l 7 0 亚基中均发现了该结构域：s w i 3 亚基有两个已知的与d n a 和组蛋白相结合的结 构域，称为s w i r m 和s a n t 。s w i r m 是一个含有8 5 个氨基酸残基的保守结构域，研究表 明，s w i r m 对d n a 和寡聚核小体有较高结合能力。对于s w i 3 而言，该结构域对于其正 确组装入s w i s n f 复合物及体内该复合物活性的发挥都是必须的。在一些依赖a t p 的 改构复合物，如r s c 、i s w i 、组蛋白修饰酶a d a 2 、n c o r 、s p r i 中均发现了该结构域的 存在。s a n t 结构域约含5 0 个氨基酸残基，在结构上与c - m y b 的d n a 结合结构域有关b 副。 通过对果蝇i s w i 复合物的s a n t 结构域进行结构及生化分析，结果表明该结构域可能与 组蛋白的结合有关。b r g i ( 或b r m ) 作为人s w i s n f 的催化亚基，包含多个结构域， 大部分已经通过原始序列分析得到鉴定，包括一个在进化上保守的a t p 酶结构域、保守 的c 末端溴区、a t 发夹形基序及包含q l q 、h a s 、b r k 结构域的n 末端结构域阱1 ( 图i - 2 ) 。 2 s w f b 2 揪糯删呐，- 6 p s w l 订s n f l r脯 秽1 童苎! ! ! 堕- ：曼墨! ! 堕。铲童悬! l 缎：童苎量曼鲢鳗奠、。“一 锯钰，蔓i 曼窆墨至 璺墨主事。l 递戛芝璺f 竖蒸，。，：彳 缓戳；囊盈豳誓筮z 鑫盎群，j 旁黼蕾豳她：i 0 ；= = ：。量圈瑟。溺鹈彩巍荔骥 图i - is w i s n f 家族成员 ( 引自v a m s ikg a n g a r a j u ，b l a i n eb a r t h o l o m e w 2 0 0 7 1 9 ) lp a i 酮 o m o 粤卧唑。 = = = 二盈匝 口 i s w 船n 1 2 ts t h ll 。 s a n ts l i d e i s w i 口圜 】 二珊 p h dc h r o m o m i - 2 ( c h d ) 二 口嘎盈匾 【二二二 n - 1 e r m i n a ia t p a 始c 1 e r m i n a i q l qh s a b r kd e x h c h e l i c c lb r o m o a t - h o o k 广 b r g l ，匕= = = = 口= 正0 墨盈墨盔臣= = j 卫1 6 4 7 图l - 2s w l s n f 、i s w i 、c h d 、i n 0 8 0 家族a t p a s e 结构域 ( 引自k e v i nwt r o t t e r , t r e v o rk a s c h c r 2 0 0 8 【1 6 】) 2 i s w i 家族 该家族的最初成员d n u r f 和d c h r s c ，是通过对用于体外检测转录因子与核小体各位 点结合活性的果蝇幼虫提取物所进行的生化分析时发现的汹瑚3 。后又在酵母，人、鼠中 发现了许多该家族的成员。i s w i ( i m i t a t i o ns w i t c h ) 复合物约3 0 0 - 8 0 0k d a ，包含2 至4 个亚基。i s w i 是此类改构复合物的a t p 酶催化亚基，由s w l 3 、a d a 2 ，n v o r 和t f i ib ( s a n t ) 结构域组成1 。s a n t 结构域与t f i i i b 的d n a 结合结构域类似，可能在i s w i 复合物对d n a 的非特异性结合中起着重要作用。 在果蝇中，i s w i 组装入三个不同的复合物中，即n u r f 、a c f 和c h r a c ( 图卜3 ) 。n u r f 东北师范大学硕士学位论文 包含b p t f n u r f 3 0 1 、i s w i 、n u r f 一5 5 和n u r f 一3 8 四个亚基m 1 。该复合物a t p 酶亚基的 催化活性由核小体特异激活而非d n a ，但对于s w i s n f 复合物而言，核小体和d n a 同样 能够激活其a t p 酶活性。研究表明，n u r f 复合物在体外和体内都能激活转录啪】，其作 用机制可能是该复合物能引起核小体沿着d n a 相对移动。a c f 复合物能持续不断地将组 蛋白多聚体沿着d n a 排列以便形成一种长期的周期性的核小体排布啪，4 0 oa c f 所介导的 这种染色质组装需要组蛋白伴侣n a p l 参与。 在酵母中根据与d l s w i 的高度同源性，鉴定出i s w i l 和i s w l 2 两个i s w i 基因。i s w l l 蛋白能形成两个不同的复合物i s w i l a 和i s w i l b ，前者有着较高的核小体排布活性。 i s w l 2 被视为酵母c h r a c 的同源物，在不同物种的改构复合物中有着结构和功能上高度 的保守性。i s w l 2 有着核小体排布活性，但没有检测出其有核小体破坏活性h 1 蜘。 k e 刖晒p id r a e l a n o g a s t c rlh u l p i e r nl鲥j 啭咖 i s 柚 l ai s w l bi s w 2 蚶c h r a cn u r fw c r f m c f w i c hh c h 姐c 附$ n f 2 h c o h e s l nn o r cm w i c h p鼬 i s w 2 i s w i i s w b 副稍e s n f 2 h h s n f z h h 骊f 2 i i h s n f 2 i l - h s n f 】轴椭辅n im 驯f 2 h i 蝴蛔 躺，缝l 缱! j 藏巅堍弘，赫哟，藤影h 躺， m 旺 卸s b 1 2 | 黼删 “嚆蘸：，矿。赣滋巍，龇，绷黼： 1 爹蚺。，”确倍c 。“。”朗“? 计“p “”蟹h c h r k l l m l a l - 2 p s 0 曩蝴。蕊鲰；c h r a c l 4 k h n k l 5h i ) a c i - 2 p 明 i k 柏0 1麟 鸭 嘶 g , 目r f s $ 喙“_ 。厶。，? 船o ；如? 一i 蝴姒p 秘 纸舶i m d d 2 & | h 啦! 弧1 & 2 图1 3i s 、家族成员 ( 引自v a m s ik ，g a n g a r a j u ，b l a i n eb a r t h o l o m e w 2 0 0 7 9 ) 3 c h d 家族 c h d 一1 最初是在老鼠中分离得到的，兼有s w i 2 s n f 2 的a t p 酶家族和h p l 染色质 结构域( c h r o m a d o m a i n ) 蛋白家族的特征h 3 1 ( 图i - 4 ) 。与h p l 不同，c h d l 并不位于凝 集的染色质，具有与d n a 小沟结合的基序3 。染色质结构域和解旋酶结构域是c h d l 与 染色质结合所必须的。在酵母中分离的c h d l 是一种依赖于a t p 的核小体改构因子，能 够使核小体沿着d n a 重排。但不同于s w i s n f 复合物，由c h d l 所介导的核小体移动并 没有暴露大部分的核小体d n a m l 。 4 i n 0 8 0 和s 职1 家族 i n 0 8 0 和s w r l 是分别包含1 5 和1 4 个不同亚基的复合物( 图1 - 5 ) 。i n 0 8 0 蛋白是 i n 0 8 0 复合物中最大的亚基，包含一个保守的a t p 酶结构域阳1 。通过对i n 0 8 0 和人类 ( h i n 0 8 0 ) 及果蝇( d i n 0 8 0 ) 中其同源物进行比较，发现该亚基有两个保守的结构域， 一个是位于n 端的t e l y 基序，一个是位于c 端的g t i e 基序。除了i n 0 8 0 ，该复合 物还含有肌动蛋白及其相关蛋白，a r p 4 、a r p 5 、a r p 8 ：另外，有两个亚基r v b l 和r v b 2 在i n 0 8 0 复合物中约有6 个拷贝，与细菌r u v b 和d n a 解旋酶有着同源性m 1 。酵母中， 4 东北师范大学硕士学位论文 一旦缺乏i n 0 8 0 ，不仅使转录调控发生错误，而且对d n a 损伤试剂有着高度的敏感性， 表明i n 0 8 0 可能不仅仅调控转录，在d n a 修复中也起着重要作用n l 伯3 。 s x e r e v i s m r1d m e l a n o g a s t t rl m m u g u l u $ ih s a # e n s c h d lm i 2c h 0 1c h d lm i 2n u r o a t r x ，i d 弘c 1 1 d 4 | c h d pc h d l c h 棚，c h d 3 -c h d 3 1 c h d -a t r x - 娜h d a c 丘2h d a c l & 2 i r b a o 柏r b a 0 4 , b 缎 i ( a r o s l 工& 7r b a p 4 6 a i a i o s m 阳w - 3 m w 口 硎ds u b f 硼n i l yi st h el e t nc h a r m t e r i z e da n da 啊h i v eu h d _ i r b l i a h i 嘲：jp r o t e i n s 图l - 4c h d 家族成员 ( 引自v a m s ikg a n g a r a j u ，b l a m eb a r t h o l o m e w 2 0 0 7 9 】) n 0 8 0iy s w r lih i n 0 8 0 l 0 8 0 s w r l ah i n o b o n i b _ 心p o ， 7 r p e a r p 5 a r p 5 憎a r p 4b f s 3 ，a r p a 鼬杰!曼迪!m 9 叠 r v b 2r v b 2 v m 4 9 b k 2h i e s 2 ，p a p 1 ，z 一：，1 n 矗；h l e s 6 4 c 1 8 0 r f 3 7 缸l ! 妊i ! a r r d l 雨l f l4 a r p 6 f u 9 0 5 z h h p 0 a o r l s w c sn f 哪 l e s l v p s 7 1i s w c t m c r s l l e s 3 v p s 7 2 s w c 2 h l 柏l 口 j e s 4y f 9 j e s sb d f l s w c l t s w c 3 s w c 4 g o d l 图1 5i n 0 8 0 家族成员 ( 引自v a m s ikg a n g a r a j u , b l a i n eb a r t h o l o m e w 2 0 0 7 t g ) ( 二) 依赖a t p 的染色质改构复合物的作用机制 关于s w i s n f 复合物在体内的改构机制仍然很不清楚，可能因为启动子的不同而不 同，与局部s w i s n f 的浓度、待改构区域的染色质结构、与d n a 结合的调控因子的参与， 或可能作为组蛋白多聚体受体的其它d n a 的参与有关。关于依赖a t p 的改构复合物对于 染色质重塑的机制，目前有以下几种模型： 1 滑动模型 通过对改构复合物进行研究，发现这些复合物能够使围绕核小体表面的d n a 发生暴 露。对于该现象的一个可能的解释是滑动模型，即s w i s n f 以a t p 水解释放的能量对 核小体进行重塑，结果组蛋白多聚体滑行到同一个d n a 分子的另一位点，称为顺式滑行 1 4 9 ；或滑行到不同d n a 分子的某一位点，称为反式滑行嘞一妇( 图2 - 1 ) 。顺式滑行或反式 滑行可能取决于s w i s n f 相对于核小体的比率。研究表明，s w i s n f 能在较低的比率( 1 ： 东北师范大学硕士学位论文 2 0 0 ) 下高效地进行顺式滑行，而反式滑行则需要高出前者1 0 倍以上的比率才能进行n 9 1 。 这样，经过改构复合物的作用，组蛋白八聚体与d n a 发生相对移动，改变了核小体的位 置，同时，使核小体d n a 的限制性酶切位点暴露，并促使转录因子与相应序列元件结合。 但是当前研究体内核小体结构和位置的方法还不能清楚地区别已经被重塑的或没有核 小体结合的d n a 区域，也不能很好地区分顺式或反式滑行后的核小体状态。 对于滑行模型的最初解释是“扭转扩散川翱。布朗能波动足够使核小体边缘的d n a 螺旋扭转，导致d n a 与组蛋白之间的相互作用被另外涉及相邻碱基对的作用所取代，而 围绕在组蛋白八聚体周围的这种扭转缺陷的传播导致了核小体相位的改变。根据此模 型，当d n a 围绕核小体表面扭转时，是根据其自身的轴发生的转动。 几乎所有改构复合物都能改变核小体的平移位置。有实验通过对由大约2 4 0 3 5 0 b p 围绕且能区分不同平移位置的寡聚核小体进行研究，首次证明了改构复合物n u r f 、 c h r a c 、i s w i 能够改变核小体相对d n a 的位置旧朋1 。另外，通过既定d n a 片段对核小体 起始和终点的不同位置进行分析，证明了酵母s w i s n f 能通过顺式滑行的方式使核小体 的相对位置改变嘶1 。在一些利用核小体阵列进行的个别的实验中，发现s w i s n f 能在 d n a 连接区封闭一定的限制性酶切位点，表明s w i s n f 能够在原先可以进入的位点安放 核小体嘲1 。后利用原子能显微镜对经由h s w i s n f 改构前后的核小体阵列进行观察，发 现核小体的排布发生了明显的变化旧，。 研究表明改构复合物能改变核小体的平移位置，引发了人们的思考，是不是这样的 改构过程都是通过滑行的方式进行的? 事实上，这种方式还是存在很大争议的。其中， 滑动模型不能解释大量的裸露d n a 是如何在紧密排列的核小体区域产生的。因为此模型 从定义上讲，要求平移性的安放核小体以暴露d n a ，所以，滑动并不能增加裸露核小体 d n a 的数量，而仅仅是改变它们的位置，对染色体改构可能还有其他的机制存在。另外， 有研究表明，h s w i s n f 和y s w i s n f 能引起闭合的环状核小体阵列拓扑结构的改变阳川， 而核小体的平移性安放并不能引起稳定的拓扑结构变化，因为核小体在标准的构象中已 经适应了一种拓扑结构且其后变化不大。由核小体运动引起的对连接d n a 扭转后的任 何瞬时改变，都会在未扭转的模板上得到迅速的恢复。所以，此方式还是有着一定的局 限性，可能还有一些染色体改构的其他机制存在。 2 组蛋白突变体交换模型 s w r l ( s i c kw i t hr a t 8t s ) 复合物的发现引发了人们对一种新的依赖a t p 的改构 复合物的改构机制的研究。几乎在同一时间内，有3 个实验组发现了这个包含约1 3 个 亚基的复合物与组蛋白突变体h 2 a z 相作用洲引。近些年来，对于h 2 a z 取代标准的h 2 a 这一过程，在酵母中得到广泛的研究。s w r l 复合物的催化亚基s w r l 能水解a t p ，使 h 2 a h 2 b 与h 2 a z h 2 b 二聚体发生交换嘲( 图2 - 2 ) 。在体外，s w r l 能够将h 2 a z 融入 酵母基因组大约2 5 个染色质位点，这些位点通常位于酵母基因启动子的两侧旧1 。哺乳 动物细胞中，h 2 a z 通常位于活性染色质。有研究表明，含有h 2 a z 的核小体在转录激 活中较含有h 2 a 的核小体易于发生解离，表明前者较不稳定，更易被发生取代1 。此类 6 东北师范大学硕士学位论文 核小体的不稳定性，部分由于h 2 a z h 2 b 与h 2 a h 2 b 相比较不稳定。h 2 a z 已在g a l l 启动子处的核小体中被分离出，可能在该基因的激活中起着一定的作用呻5 1 。 然而，另一些研究表明，包含h 2 a z 的核小体反而比含有h 2 a 的核小体更加稳定， 不易被改构复合物所移动。支持该观点的证据有，h 2 a z 存在于哺乳动物异染色质的臂 间呻3 ：另外，包含h 2 a z 的核小体部分抵制d o t l 和s e t 2 的甲基化以及n u a 4 复合物参 与的乙酰化呻 。因此，对h 2 a z 的不同研究导致了相矛盾的观点。 ( a ) u a s ( b ) u a s 图2 1 滑动模型 ( a ) 顺式滑行( b ) 反式滑行 ( u a s ：u p s t r e a ma c t i v a t i n gs e q u e n c e ，上游激活序列：引自s u d a r s a n a mp ，w i n s t o nf 2 0 0 0 ( 4 9 ) 电面二毡 1 1 2 九z 赶2 b d i m e r d i m e r 8 彰4 图2 - 2 组蛋白突变体交换模型 ( 引自s t e v e nh c n i k o f f 2 0 0 8 1 6 6 ) ) 3 重获环模型 该模型认为s w i s n f 能直接与核小体d n a 的大部分相结合，这种相互作用有助于将 核小体d n a 从组蛋白八聚体表面剥离，并于核小体表面形成d n a 环旧1 ，使得转录激活 子或抑制子能与裸露的d n a 相结合，但该过程中整个核小体没有发生平移性的位置改 变旧1 ( 图2 - 3 ) 。根据此模型，脱离的d n a 部分可以重新与原先的核小体结合，或与组 蛋白八聚体的不同位点相作用，在核小体表面产生d n a 环或泡。d n a 环围绕着组蛋白八 7 壁窆 东北师范大学硕士学位论文 聚体沿着一定的方向传播，从而使核小体d n a 的不同位点发生裸露，但仅需要很少的能 量，因为每次传播时，d n a 环前方的d n a 与组蛋白之间相互作用的破坏，致使环后方这 种相互作用同样发生变化瞄引。近期的研究倾向于该模型，认为s w i s n f 利用a t p 水解的 能量使组蛋白和d n a 解聚并与组蛋白八聚体一起沿d n a 双螺旋随即转位，从而使整个 d n a 双链上的位点都有机会与其他因子接触，呈开放状态口。 图2 3重获环模型 ( 引自v a m s ik g a n g a r a j u ，b l a i n eb a r t h o l o m e w 2 0 0 7 t 9 1 ) 除以上所述模型之外，涉及到核小体d n a 或核心组蛋白，或两者共同发生构象变化， 使核小体改变了原有的标准构象，从而也导致了其相对位置的改变m 1 。另外，核心组蛋 白八聚体的部分或全部的解离，随后又在新的d n a 位点重新组装，也会使原先核小体 d n a 裸露m 1 。 尽管已经获得了一些关于依赖a t p 的染色质改构复合物改构机制的线索，但我们对 于具体改构机制的理解仍处于初级阶段。将来的工作，包括这些改构复合物的动力学和 热力学分析及改构后产物的结构信息，将有助于深入理解改构复合物的改构机制。 ( 三) 染色质改构复合物与转录调控 通过对y s w i s n f 各亚基的突变体在染色体整体水体上进行基因表达的研究，表明 该复合物涉及到约6 酵母基因的表达。同样，包含