（发酵工程专业论文）直接发酵法生产l色氨酸的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 本文以谷氨酸棒杆菌f c 2 2 为出发菌株，对直接发酵法生产i 广色氨酸进行了研 究。主要研究内容和结果如下： 1 采用对二甲氨基苯甲醛比色法对发酵液中的l 色氨酸含量进行了定量分析。 对比色法中影响【广色氨酸含量测定的因素进行了研究，并用单因素试验优化了实验 条件，得出了对二甲氨基苯甲醛比色法测定l 色氨酸含量的最佳检测条件，从而建 立了快速测定发酵液中i 广色氨酸含量的方法。在最佳检测条件下，l 色氨酸含量在 0 1 5 0m g l 浓度范围内线性关系良好，回归方程为a 5 9 3 n m = o 0 0 5 3 c 一0 0 0 0 7 ，相关 系数为r 2 = 0 9 9 7 5 ，回收率为9 8 5 - - 9 9 o 。 2 对出发菌株谷氨酸棒状杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) f c 2 2 的形态特 征和生理特性进行初步鉴定和分析，对该菌株的发酵培养基配方及发酵条件进行研 究，确定了发酵过程中影响l 色氨酸积累的主要因素，从而为诱变育种的筛选工作 做了准备。 3 以谷氨酸棒状杆菌f c 2 2 ( p h e + t y r + s m t r ) 为出发菌株，经紫外线( u v ) 、 硫酸二乙酯( d e s ) 逐级诱变处理，并采用磺胺胍( s g ) 、肉桂酸( c 玳) 作为抗性 药物，通过摇瓶初筛和复筛、单菌落分纯以及连续传代试验测定，定向选育出一株 遗传性状稳定的【广色氨酸高产菌株f c l 0 1 3 ( p h e + t y r + 5 m t r + s g r + c i n r ) ，在未经 优化的发酵条件下摇瓶培养3 天，平均可积累l 。色氨酸8 9 1g l ，比出发菌株f c 2 2 产量提高了1 2 0 。 4 研究了菌株f c l 0 1 3 的摇瓶分批发酵条件。采用正交设计试验法优化了种子 培养基组成配比；采用响应面分析试验法优化了发酵培养基组成配比；采用单因素 试验优化了发酵培养条件。在优化条件下，菌株f c l 0 1 3 摇瓶发酵7 2 小时，平均可 积累l 色氨酸9 7 9g l ，比出发菌株f c 2 2 提高了1 4 1 7 。 关键词：谷氨酸棒状杆菌，i 广色氨酸，检测，诱变育种，摇瓶发酵 中文文摘 中文文摘 l 色氨酸是具有吲哚基的中性芳香族氨基酸，是动物和一些真菌生命活动中必 须氨基酸。i 广色氨酸能调节消化及免疫功能，调节蛋白质的合成，在生物体的新陈 代谢、生长发育中有重要作用。由于其在食品、饲料、医药等领域有着广泛用途和 巨大市场空间，近年来很多研究者对【广色氨酸的生产进行了深入的研究。 l 色氨酸早期采用蛋白质水解法和化学合成法来生产，现在主要采用微生物法 来生产。微生物法可分为酶促转化法和直接发酵法。酶促转化法生产l 一色氨酸的不 足是：色氨酸合成酶会受到底物吲哚的强烈抑制，甚至会完全失活；底物l 丝氨酸 价格较高；吲哚水溶性较差，转化率不高。而直接发酵法可以利用l 广色氨酸高产菌 株，以廉价的葡萄糖、糖蜜等做原料，控制合适的培养条件，直接发酵积累l 色氨 酸。该法成本较低，工艺也较前两种简单。但由于【广色氨酸的生物合成途径比较长， 代谢流比较微弱，且l - 色氨酸生物合成的共同途径和分支途径中的调节机制比较复 杂，存在着多重反馈和弱化子系统调节作用，使得l 色氨酸发酵生产成为氨基酸发 酵工业中的难题之一。由于很难从自然界中找到能够大量积累【厂色氨酸的菌株，因 此选育高产稳产的l 色氨酸优良菌种是直接发酵法成功的关键。目前我国市场上销 售的l 色氨酸主要依靠进口，我国国务院已于2 0 0 4 、2 0 0 7 年将l 色氨酸生产列入 “鼓励外商投资产业目录”之中。 直接发酵法生产l 色氨酸的研究，对发展我国氨基酸发酵工业具有重大的意义。 本文对发酵液中i 广色氨酸的快速测定、出发菌株的生理特征和产酸特性、l 色氨酸 高产菌株的选育及发酵条件的优化进行了重点研究。 一、建立了快速测定发酵液中i 广色氨酸含量的方法 采用对二甲氨基苯甲醛比色法对发酵液中的l 色氨酸进行了定量分析。得出了 对二甲氨基苯甲醛比色法测定发酵液中l _ 色氨酸含量的最佳检测方法：将发酵液 3 0 0 0r m i n 离心1 0m i l l ，取上清液稀释适当倍数，准确取1m l 稀释后的发酵液与9m l 对二甲氨基苯甲醛储备液( 3 班) 于试管中混合均匀后，6 0 水浴1 5m i n ，加入o 5 亚硝酸钠溶液0 0 5m l ，混匀后再继续6 0 水浴5m i n ，取出冷却并静置1 0m i n ，以 硫酸储备液做试剂空白( 消除样品自身颜色的干扰) ，用1e m 比色皿在5 9 3n l n 波长 处测定吸光值。当【广色氨酸在0 - - 一1 5 0m g l 浓度范围内线性关系良好，回归方程为 v 福建师范大学李阳硕士学位论文 a 5 9 3 n m - - - - 0 0 0 5 3 c 0 0 0 0 7 ，相关系数为r 2 - - 0 9 9 7 5 。 用本法测定发酵液里的l 色氨酸含量，具有快速、简单易掌握、对仪器要求不 高、结果重现性好以及准确度高等优点，适合发酵工业中l 色氨酸的快速分析。 二、初步鉴定了出发菌株f c 2 2 的生理特性和产酸特性 通过生理试验，了解了出发菌株谷氨酸棒状杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) f c 2 2 的一些基本培养特征和生理特性。吲哚试验和营养缺陷型试验说明菌株f c 2 2 适合用作积累l 色氨酸的出发菌株。采用单因素试验对该菌株的发酵培养基配方及 发酵条件进行研究，了解了营养及环境因素对菌株f c 2 2 发酵积累l - 色氨酸的影响， 其中摇床转速及培养基中葡萄糖、玉米浆、硫酸铵含量对发酵积累l 广色氨酸的影响 较大。从而确定了最有利于【厂色氨酸积累的发酵培养基组成配比：葡萄糖6 0g l ， 玉米浆5 0g l ，硫酸铵3 0g l ，硫酸镁o 5g l ，磷酸氢二钾2 5g l ，磷酸二氢钾2 5 g l ；最优发酵条件：发酵培养基初始p n 为7 0 ，发酵温度为3 0 。c ，回旋式摇床转 速为2 6 0r m i n 。在上述条件下，采用液体肉汤培养1 2h 的菌液作为种子，取0 5m l 菌液接种于装有1 5m l 发酵培养基的2 5 0m l 三角瓶中，培养3 天，f c 2 2 可最高可 积累l - 色氨酸4 0 5g l 。 对出发菌株生理特性和产酸特性的了解，为下一步的诱变育种筛选工作做了准 备。 三、通过诱变定向选育出一株l 色氨酸高产菌株f c l 0 1 3 根据代谢控制发酵原理，以谷氨酸棒状杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m ) f c 2 2 ( p h e + t ) n 5 m t r ) 为出发菌株，采用紫外线( u v ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 逐级诱 变处理，依次赋予s g r ( 1 0g l ) 、s g r ( 1 5g l ) 、s g r ( 3 5g l ) 、c i n r ( 1 0 遗传标 记，经过摇瓶初筛和复筛、单菌落分纯以及连续传代试验测定，定向选育出一株l 色氨酸高产菌株f c l 0 1 3 ( p h e + t y r + 5 m t r + s g r + c i n r ) 。该菌株在未经优化的摇瓶 发酵条件下，摇瓶培养3 天，平均可积累l 色氨酸8 9 1g l ，比出发菌株f c 2 2 产量 提高了1 2 0 。 菌株f c l 0 1 3 经斜面连续传代5 代，经产酸验证试验和遗传标记验证试验，发 现该菌株未发生回复突变，产酸特性稳定。 四、确定了f c l 0 1 3 最适发酵条件 采用l 9 ( 3 4 ) 正交设计试验法确定了菌株f c l 0 1 3 发酵积累l 色氨酸的最适种子培 养基组成配比：葡萄糖4 0g l ，硫酸铵1 0g l ，玉米浆干粉4 0g r t , ，磷酸氢二钾1 5 中文文摘 班，磷酸二氢钾1 5g l ，硫酸镁o 5g l ，p h7 o 7 2 ，于2 5 0m l 三角瓶装液量2 0 m l ，1 1 5 灭菌1 5m i n 。 采用响应面分析试验法确定菌株f c l 0 1 3 发酵积累i 广色氨酸的最适发酵培养基 组成配比：葡萄糖7 7g l ，硫酸铵2 7g l ，玉米浆干粉5 9g l ，磷酸氢二钾2 5g l ， 磷酸二氢钾2 5 以，硫酸镁o 5 扎，p h6 8 7 0 ，1 1 5 灭菌1 5m i n 。 采用单因素试验法确定了菌株f c l 0 1 3 发酵积累l 广色氨酸的最适培养条件：取 3 0 c 、2 6 0r m i n 培养2 2h 的种子液o 5m l ，接种于装有1 5m l 发酵培养基的2 5 0m l 三角瓶中，于回旋式摇床上3 0 、2 6 0r m i n 振荡培养7 2h 。 在最适种子培养基、最适发酵培养基和最适培养条件下，菌株f c l 0 1 3 可积累 l 色氨酸9 7 9 舡，比出发菌株f c 2 2 提高了1 4 1 7 。 v a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep r o d u c t i o no fl - t r y p t o p h a nb yf e r m e n t a t i o nu s i n gc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m f c 2 2a sa p a r e n ts t a i nh a sb e e ns t u d i e di nt h i sd i s s e r t a t i o n i t sm a i nr e s e a r c h c o n t e n t sa n d r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 l - t r y p t o p h a nc o n c e n t r a t i o ni nf e r m e n t e db r o t hw a sq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e dw i t h m e t h o do fp - d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d ec o l o r i m e t r y t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o r m e a s u r i n gt r y p t o p h a nw i t hc o l o r i m e t r ym e t h o dw e r ea n a l y z e d as e r i e so fe x p e r i m e n t s w e r ep e r f o r m e dt oo p t i m i z et h ec o l o r i m e t r i cc o n d i t i o n sa n dv a l i d a t et h ed e s c r i b e dm e t h o d b ys i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i n e a rr e l a t i o n s h i pw a sb e a e ri n 5 9 3i u t lw h e nt h ec o n t e n to fl - t r y p t o p h a nw a s0 , - 15 0m g l t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a s a 5 9 3 n m - = 0 0 0 5 3 c - 0 0 0 0 7w i t hi r - - 0 9 9 7 5 ，a n dt h er e c o v e r yw a s9 8 5 - - 9 9 o t h i s m e t h o di ss i m p l e ，a c c u r a t e ，r a p i d ，a n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y , s oi tc a nb ea p p l i e dt oq u i c k a n a l y s i so fl t r y p t o p h a ni nf e r m e n t a t i o ni n d u s t r y 2 t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp h y s i o l o g i c a lt r a i t so ft h eo r i g i n a ls t a i n c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mf c 2 2w e r ei d e n t i f i e da n da n a l y z e dp r e l i m i n a r i l y t h e f e r m e n t a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h em a i nf a c t o r s i n f l u e n c i n gl t r y p t o p h a np r o d u c i n gw e r ed e f i n e db ys i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t ，w h i c h p a v e dt h ew a y f o rs c r e e n i n gc o n d i t i o no fm u t a t i o nb r e e d i n g 3 b a s e do nt h em e a n so fm u t a t i o n sw i t l lu va n d d e s ， al - t r y p t o p h a n 1 1 i 曲p r o d u c e r f c1013w a s s u c c e s s f u l l y s c r e e n e dw h e nt h e o r i g i n a l s t r a i n c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mf c 2 2t r e a t e db yt h em e t h o do fr e p e a ts e l e c t i o n t h es t a i n f c l 0 1 3 ，r e s i s t a n tt os u l f o n a m i d ea n dc i n n a m a t e ，w a sa b l et oa c c u m u l a t el - t r y p t o p h a n 8 9 1g lu n d e rt h eu n o p t i m i z e df e r m e n t a t i o n t h em u t a n tt r a i tw a si n h e r i t e ds t a b l yf o r f i v eg e n e r a t i o n si ns u c c e s s i o n 4 i nt h i sp a p e rt h ec o n d i t i o n so fs h a k e - f l a s kf e r m e n t a t i o no fs t r a i nf c l 0 1 3w e r e s t u d i e d t h eo p t i m u mc o m p o s i t i o no ft h es e e da n df e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r eo b t a i n e d b yo r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n ta n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sf r s a ) r e s p e c t i v e l y t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea l s os t u d i e d u n d e rt h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n , t h e p r o d u c t i o no fl - t r y p t o p h a no ft h es t r a i nf c 1013w a su pt o9 7 9g l ，w h i c hw a s141 7 i 福建师范大学李阳硕士学位论文 p e r c e n tm o r et h a nt h a to ft h eo r i g i n a ls t a i nf c 2 2 k e y w o r d s ：c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ，l - t r y p t o p h a n ，d e t e r m i n a t i o n ，m u t a t i o n b r e e d i n g ，f e r m e n t a t i o n i v 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)奎田 学号2 q q 鱼! q 星墨一专业 筮醛工程所 呈交的学位论文( 论文题目：直接发酵法生产l 一色氨酸的研究) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除论文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研究工作做出贡 献的个人或集体，均已在论文中作了明确说明并表示谢意，由此产生的 一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 学位论文作者签名： 套硇 签字日期刎年 1 2 0 l 0 0 9 6 1 2 0 8 0 1 0 0 9 6 葡萄糖( a ) 硫酸铵( b ) 磷酸盐( d ) 。玉米浆对种子质量影响最大， 有机氮源玉米浆中含有多种生长因子对种子生长有明显的促进作用。对于葡萄糖， 种子培养基中一般含量不高，因为糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸使p h 降低，从而容易引起菌种的衰老。由表5 2 可知，各因素的最优水平为a 2 8 2 c 3 d 2 。 所以，根据正交试验结果确定最适种子培养基配比为( g l ) ：葡萄糖4 0 ，硫酸铵1 0 ， 玉米浆4 0 ，磷酸氢二钾1 5 ，磷酸二氢钾1 5 ，硫酸镁0 5 。采用d p s 软件对所得到 的正交试验结果进行方差分析 8 8 1 9 结果如表5 3 所示。 表5 - 3 正交试验方差分析 t a b l e 5 - 3t h ev a r i a n c ea n a l y s i sr e s u l t 注tf o 0 1 ( 2 ，1 8 ) = 6 0 1 ，f o 0 5 ( 2 ，1 8 ) = 3 5 5 由表5 3 可以看出，种子培养基中玉米浆、葡萄糖、硫酸铵的含量对最终l 广色 氨酸产量影响都达到了极显著水平，种子培养基中磷酸盐对最终l 色氨酸产量的影 响较小。由于正交试验所确定的最适组合a 2 8 2 c 3 d 2 未被包含在正交表的九个试验 5 8 舻一l墨淌叭蝴跏懈淌观懈 平 一 一曲凹n黔跖的卯记 一7 8 8 8 8 7 8 7 7一一哪蚴掀喜|嗍她懈饥 一7 8 7。7。7 8 一一一一一一一泌吣 昧躺一，23 4 5 6 7 8 9怼硒髓 第5 章l 色氨酸摇瓶分批发酵条件的研究 中，为了进一步确认试验结果，采用最适条件：葡萄糖4 0g l 、硫酸铵1 0g l 、玉 米浆4 0g l 、磷酸氢二钾1 5g l 、磷酸二氢钾1 5g l 、硫酸镁o 5g l 进行验证。结 果见表5 4 。 一 表5 - 4 正交试验结果验证 t a b l e 5 _ 4t h ev e r i f i c a t i o no ft h ee x p e r i m e n t 由表5 - 4 验证结果可知，验证试验的【广色氨酸产量在正交试验中处于较高水平， 试验结果较理想。 5 4 2 种子培养时间的确定 种龄过短接种后会出现发酵前期菌体生长缓慢，发酵周期延长，产物的形成时 间推迟；种龄过长虽然有充足的菌量，但接种后会导致菌体过早衰退，目的产物的 积累能力下降。一般来说，种子的菌龄选取对数生长后期，即菌浓接近高峰时所需 的时间 5 7 3 。按5 3 3 所述方法绘制种子生长曲线，结果如图5 1 所示。 目 c o e 寸 赵 米 督 图5 - 1 种子生长曲线 f i g 5 1c _ r r o w t hc u r v eo fs e e d 从图5 - 1 可以看出，菌体约4 小时后进入对数期，约2 4 小时以后进入稳定期。 一般选取对数期后期到稳定期前期的菌体作为种子，此时菌体繁殖力强、数量多。 根据上图结果，取2 2 小时作为最适种子培养时间。 5 9 福建师范大学李阳硕士学位论文 5 4 3 接种量对产酸的影响 一般来说，接种量过小会使菌体生长缓慢、培养周期延长，导致产量下降。接 种量较大虽然可以缩短菌体繁殖时间，能够提前形成目的产物，但菌体过快、过稠 的生长会造成营养基质缺乏或溶氧不足而不利于产物的发酵积累n 卯。为此对不同接 种量做了研究。每个发酵摇瓶( 含1 5m l 发酵培养基) 里的接种量为分别为o 3 、o 5 、 1 0 、1 5m l ，发酵后的结果如图5 2 所示。从图中可以看出当接种量对l 色氨酸产 量影响较小，当接种量为0 5m l 时，菌种发酵积累l 色氨酸的量达到最高。 j 删 m 熊 聚 甾 酶 蛐 o 5l 接种量( m l ) 图5 - 2 接种量的影响 f i g 5 - 2e f f e c to fi n o c u l a t e dv o l u m eo i ll - t r pp r o d u c t i o n 5 4 4 发酵培养基的优化 虽然通过单因素试验可以确定各个成分的最适浓度，但单因素分析没有考虑因 素间的交互影响。响应面分析( r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ) 可将多个因素与试验所得 结果关系用函数近似，从而把因素和试验结果之间的关系函数化，从而对因素与因 素之间、因素与响应值之间的相互关系进行研究，优化试验结果8 0 3 0 响应面方法广 泛应用于培养基和发酵条件的优化 8 9 j 0 本实验选取对发酵产酸影响比较大的葡萄 糖、硫酸铵、玉米浆三个因素，采用响应面分析法( r s a ) 来重点考察它们之间的 相互联系及对l 广色氨酸产量的影响。依据b o x b e h n k e n 中心组合设计原理 9 0 3 j 以 葡萄糖、硫酸铵和玉米浆3 个因素为自变量，以l 一色氨酸产量为响应值，进行了三 因素三水平的响应面试验设计。采用软件s a s v 8 1 对所得数据进行统计分析，并对 所得的方程微分求最大值以预测最优点四1 。试验因素与水平的选取如表5 5 所示， o 8 6 4 2 o 第5 章l 色氨酸摇瓶分批发酵条件的研究 试验设计与试验结果如表5 - 6 所示： 表5 - 5 因素水平编码表 t a b l e 5 - 5t h ec o d i n gl e v e lo ft h ef a c t o r si nt h ee x p e r i m e n t 表5 - 6 响应面分析试验安排及结果 t a b l e 5 6d e s i g na n dr e s u l t so fr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y 用s a s 软件进行回归模拟，得到反应l 色氨酸产量与各因素关系的回归方程： 未编码： y 1 = - 3 0 4 0 5 + 0 3 5 1 6 * x 1 + 0 2 9 4 6 7 6 x 2 + 0 7 6 7 0 0 9 x 3 0 0 0 2 4 4 8 x 1 木x 1 0 0 0 0 2 3 3 木x 1 * x 2 + o 0 0 0 5 7 5 x 1 木x 3 0 0 0 4 1 9 6 x 2 * x 2 0 0 0 0 811 x 2 * x 3 0 0 0 6 6 7 4 * x 3 * x 3 编码后： y 1 = 9 6 4 3 3 3 3 + 0 6 9 3 7 5 x 1 + o 3 5 8 7 5 * ) ( 2 + o 7 9 2 5 * x 3 0 9 7 9 1 6 7 x 1 x 1 0 0 7 * x 1 母x 2 + o 1 7 2 5 x l 木x 3 0 9 4 4 1 6 7 x 2 x 2 o 1 8 2 5 x 2 牛x 3 1 5 0 1 6 6 7 x 3 宰x 3 6 1 m配鳄佗弱叭m肿斛m凰 丘t z吼e&反z丘e 7 8 9 9 9 o 0 o o d l d 1 d 0 l o o o d ，以0 j l l o o o o o o o 以d l o o o o d d l 0 o o 2 3 4 5 6 7 8 9 m n 抡b m ：2 福建师范大学李阳硕士学位论文 所得的回归方程的方差分析结果如下表所示： 表5 7 响应面实验方差分析 t a b l e 5 - 7t h ev a r i a n c ea n a l y s i sr e s u l to fr e s p o n s es u r f a c et e s t x 1 x 2 x 3 x l * x l x l * x 2 x l * x 3 x 2 * x 2 9 2 * 9 3 x 3 * x 3 3 8 5 略1 3 1 0 2 9 6 1 3 5 0 2 | 1 4 s 3 s | 1 0 0 6 | 口们9 6 口1 1 9 0 2 5 3 2 9 1 5 1 口1 3 3 2 2 5 8 3 2 6 1 6 4 3 8 5 0 3 1 3 1 0 2 9 6 1 3 s 0 2 址s 3 5 4 0 0 6 l i 口们9 6 口1 1 9 0 2 5 3 2 9 1 5 1 0 1 3 3 2 2 5 8 3 2 6 1 6 4 1 9 6 7 2 7 2 s 2 6 帖8 5 2 5 6 7 1 8 4 1 8 艴7 5 4 口1 口q 1 趣q 日6 8 8 1j i | i 1 6 8 1 7 5 9 0 6 8 0 6 9 8 地5 们5 6 口0 0 6 7 9 4 9 0 7 1 1 3 3 1 口口昭8 7 3 a 6 0 8 0 6 9 口7 6 h 4 4 2 9 4 7 0 7 7 2 口b 的3 4 6 口4 9 9 8 口a 0 1 2 6 7 13 8 5 1 3 11 0 2 9 6 1 3 15 。舱4 4 5 1 3 5 4 0 0 6 4 1口们9 6 1口1 1 9 0 2 5 13 2 9 1 5 1 1口1 3 3 2 2 5 18 3 2 6 1 6 4 3 8 5 的1 3 1 陀0 6 1 3 5 娌獬 3 5 4 0 0 6 4 口叭9 6 8 1 1 9 0 2 5 3 2 9 1 5 1 b 1 3 3 2 2 5 8 3 2 6 1 6 4 1 9 6 7 2 7 2 5 2 6 8 s 2 5 6 7 1 8 4 1 8 7 5 4 口1 0 们蚺 口6 0 8 1 驰 1 6 8 1 7 5 9 日6 8 0 6 9 8 4 2 5 4 1 5 6 0 0 嘶7 9 4 a 0 7 0 3 3 1 n 0 0 3 8 7 8 0 0 0 8 0 6 9 o 7 6 4 4 4 2 a 4 7 0 7 7 2 8 0 3 拍 0 | 1 4 6 9 的 口0 0 1 2 6 7 r o d e l92 3 4 6 8 9 42 6 0 7 6 61 3 3 2 3 5 4孽口惦3 9 692 3 拍8 9 42 6 叮6 61 3 3 2 3 5 4 o 0 0 5 3 9 6 e r r o r 5口9 7 8 5 9 2 口1 9 5 7 1 8 5 o 9 7 8 5 9 2 o 1 9 5 7 1 8 i o t a l1 42 4 4 4 7 5 31 42 4 4 4 7 5 3 注：f o 0 0 l ( 1 ，5 ) = 4 7 1 8 ，f o 5 ( 1 ，5 ) - 2 7 7 8 ，f o o l ( 1 ，5 ) = 1 6 2 6 ，f 0 0 5 ( 1 ，5 产6 6 1 f o 0 0 5 ( 9 ，5 ) = 1 3 7 7 ，f o o k 9 ，5 ) = 1 0 1 6 ，f o 0 5 ( 9 ，5 ) - - 4 7 7 从回归方程各项系数的方差分析可以看出，x 1 、x 3 、x 1 2 、x 2 2 、x 3 2 项都大于 f o o l ( 1 ，5 ) ，这说明葡萄糖、硫酸铵和玉米浆的影响是极显著的，f 方p j = 1 3 3 2 f o o k 9 ，5 ) = 1 0 1 6 说明确立的模型也是显著的。f ( x 1 x 2 ) f ( x 1 x 3 ) f ( x 2 x 3 ) ，说明葡 萄糖和硫酸铵之间的互作效应小于葡萄糖和玉米浆之间的互作效应，且都小于硫酸 铵和玉米浆之间的互作效应，但是它们都比f o 0 5 ( 1 ，5 ) 小，即交互作用都不明显。模 型可信度分析结果如表5 8 所示。 表5 - 8 模拟可信度分析 t a b l e 5 - 8t h er e f i a b i l i t ya n a l y s i so ft h em o d e l 6 2 第5 章l 色氨酸摇瓶分批发酵条件的研究 上表中相关系数为r 2 - - 9 60 0 ，表明所确立的模型的模拟程度很好，回归方程 可以为培养基的组成配比和卜色氨酸产量之间的关系提供了台适的参考。 利用s a s 程序可以得到的等高线和相应的响应面。如图5 - 3 所示。 6 06 67 2 9 0 q f i x e d o v e l s ：t = 2 sf i x e dr e v e l s ：硅镕= 2 5 图5 - 3 响应面分析的平面图及立体图 f i g5 - 3 i c h n o g r a p h y a n ds t e r e o g r a p ho f r s a o n l - t r pp r o d u c t i o n 福建师范大学李阳硕士学位论文 各因素对l 色氨酸的产量的影响趋势可由图5 3 可直观的给出，由平面图和立 体图都可以看出x 1 、x 2 和x 3 存在极值点。为了求出最优培养基配比和该配比对 应的l 广色氨酸理论最大产量，对未编码的回归方程取一阶偏导，整理得方程组： 0 3 51 6 0 4 0 0 0 4 8 9 6 x 1 - 0 0 0 0 2 3 3 x 2 + 0 0 0 0 5 7 5 x 3 = 0 。0 2 9 4 6 7 6 0 0 0 0 2 3 3 x 1 0 0 0 8 3 9 2 ) ( 2 0 0 0 0 811 x 3 = o 0 7 6 7 0 0 9 + 0 0 0 0 5 7 5 x 1 - 0 0 0 0 811 x 2 0 0 1 3 3 4 8 x 3 = 0 解上述三元一次方程组得x 1 = 7 7 4 6 ，x 2 = 2 7 2 5 ，x 3 = 5 9 1 4 。即稳定点( x 1 ，x 2 ， x 3 ) 对应的实际值为：葡萄糖浓度x l - - 7 7 4 6g l 、硫酸铵浓度x 2 = 2 7 2 5g l 、玉米 浆干粉浓度x 3 = 5 9 1 4g l 。将解得的值带入原方程，可得【广色氨酸最大估计值为 y - - 9 9 1e e l 。为了实际操作更为方便确定发酵培养基的最优配比( g r l ) - 葡萄糖7 7 ， 硫酸铵2 7 ，玉米浆干粉5