（发酵工程专业论文）酒精发酵过程控制的研究.pdf

摘要 摘要 微生物发酵是一个具有高度非线性、时变性和迟滞性的过程，其内在机理非常复杂， 传统的测量方法难以实现对发酵过程中一些关键参数的在线测量，这使得对发酵过程进 行优化控制变得非常困难。本文应用工业发酵中常用的在线检测设备，对高密度和高强 度酒精发酵的过程控制进行了研究，在此基础上将软测量技术应用于发酵过程，进行葡 萄糖浓度的实时预测，从而建立一种葡萄糖反馈的在线智能流加方式。主要研究方法和 结果如下： 1 对酵母在摇瓶培养基上的培养条件进行了优化，得到培养的最佳条件为：以y e p d 为种子培养基，种子液最佳培养时间为1 2h ；培养基最适初始p h 为4 5 ；最佳接种量为 8 ；初糖浓度为4 0g l 。 2 在搅拌罐式生物反应器中，通过考察流加对酒精发酵的影响发现，在发酵前期采 用葡萄糖反馈流加有利于菌体的繁殖，发酵后期采用间歇流加有利于酒精的生成。从而 确定混合流加为较优的流加方式。 3 在搅拌罐式生物反应器中，利用不同溶氧控制策略进行高密度和高强度酒精发酵 的研究，得到较为优化的溶氧控制策略( 搅拌转速1 0 0r m i n ，通风量0 2 2 w m ，通风1 2 h ) ，发酵4 8h ，菌体密度达到5 5 6 亿个m l ，酒精度为1 6 5 ，发酵强度达到2 7 1 g l h 。 4 在软测量理论的基础上，提出针对发酵过程中关键生物量测量的数据驱动法，重 点以主元回归作为该软测量的实现方法。利用主元回归对酒精发酵过程中的葡萄糖浓度 进行预测，网络测试结果验证了软测量的可行性和有效性。在此基础上，本文设计了一 套生物发酵控制系统，实现了酒精发酵过程中葡萄糖浓度的在线测量与流加控制。该研 究为过程控制中关键生物量的在线测量和补料流加提供了一个新的思路、新的方向。 关键词：发酵；流加；溶氧；软测量；主元回归 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep r o c e s so fm i c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o nh a dt h ec h a r a c t e r i s t i co fn o n l i n i n g ， c h a n g a b i l i t ya n dp o s t e r i o r i t y , t h ei n n e rm e c h a n i s mo fw h i c hw a sv e r yc o m p l e x e d t h e t r a d i t i o n a lm e t h e o dc a n n o tm e a s u r es o m ei m p o r t a n tp a r a m e t e r si nt h ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o n o nl i n e ，w h i c hm a k e di t v e r yd i f f i c u l t t oc o n t r o lt h ew h o l ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o n o p t i m i z a t i o n a l l y t h i sa r t i c l et a k e dt h eo n l i n ed e t e c te q u i p m e n tw h i c hc o m m o n l yu s e do n i n d u s t r i a lf e r m e n t a t i o ns t u d yt h ep r o c e s sc o n t r o l l i n go fh i g hc e l l d e n s i t ya n di n t e n s i t ye t h a n o l f e r m e n t a t i o n ，a n dt h e nt o o kt h et e c h n o l o g yo fs o f t w a r es e n s o rp r e - e s t i m a t et h eg l u c o s e c o n c e n t r a t i o ni nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，w h i c hi no r d e rt oe s t a b l i s ha no n - l i n ef e e d i n g m e t h o do fg l u c o s ef e e d b a c k t h em a i nm e t h o d sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 c u l t i v a t i n gc o n d i t i o no fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei n t h i ss h a k i n gf l a s km e d i u mw a s o p t i m i z e da n dt h e no b t a i n e dt h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n ：u s i n gy e p da st h es e e dm e d i u m ， c u l t u r i n gs e e db r o t hf o r12h ，i n i t i a lp h4 5 ，i n o c u l a t i o ns i z e8 ，i n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n 4 0e d l 2t h ee f f e c to ff e e d i n gs t r a t e g yo ne t h a n o lf e r m e n t a t i o nw a si n v e s t i g a t e du s i n gs t i r r e dt a n k f e r m e n t o r , i ts h o w e dt h a t ，i nt h ep r o p h a s eo ff e r m e n t a t i o n ，g l u c o s ef e e d b a c kf e e d i n gw a s a d v a n t a g e dt ot h a l l ig r o w t h ；i nt h ea n a p h a s e ，d i s c o n t i n u o u sf e e d i n gw a sa d v a n t a g e dt ot h e s y n t h e s i z eo fe t h a n o l ，a n dt h e n ，w ed e t e r m i n e dm i x e df e e da st h er e l a t i v e l ys u i t a b l ef e e d i n g m o d e 3i ns t i r r e dt a n kf e r m e n t o r ，w es t u d i e dt h eh i g h c e l l d e n s i t ya n di n t e n s i t y e t h a n o l f e r m e n t a t i o n t h r o u g ht h ed i s s o l v e do x y g e nc o n t r o ls t r a t e g y , a n dg a i n e dt h eo p t i m i z e s t r a t e g y ( s t i r10 0r m i n ，a e r a t i o nr a t eo 2 2 v v m ，a e r a t i o nt i m e12h ) ：t h eb i o m a s sa m o u n t e dt o o 5 5 0 6 0b i l l i o n m l ，t h ef e r m e n t a t i o ni n t e n s i t yr e a c h e d2 71 g l h ，a n df e r m e n t a t i o nt i m e w a s4 8h 4t a k i n gt h et h e o r yo fs o f t w a r es e n s o ra st h es t u d yb a s i s ，w ep u tf o r w a r dt h em e t h o do f d a t e - d r i v e na i m i n gt om e a s u r et h ek e yb i o m a s si nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s t h ek e yo ft h e m e t h o dl i e di nt h a ti tt a k e st h ep r i n c i p a lc o m p o n e n tr e g r e s s i o n ( p c r ) a st h ew a yt or e a l i z e t h es o f t w a r es e n s o ra n dt h e nt o o kt h i sa l g o r i t h mt op r e e s t i m a t et h ec o n c e n t r a t i o no fr e s i d u a l s u g a ri nt h ep r o c e s so fe t h a n o lf e r m e n t a t i o n ，t h en e tt e s ta l s ot e s t i f i e dt h ef e a s i b l i t ya n d e f f e c t i v e n e s so ft h em e t h o d o nt h i sb a s i s ，t h i st h e s i sd e s i g n e dad i g i t a lc o n t r o ls y s t e mf o rt h e b i o f e r m e n t a t i o nt or e a l i z et h eo n - - l i n ec o n t r o lo ft h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o na n df e e d i n gi nt h e p r o c e s so fe t h a n o lf e r m e n t a t i o n t h es t u d yp r o v i d e dan e ww a yf o rt h eo n - l i n em e a s u r e m , ：n t o ft h ek e yb i o m a s sa n dt h ef e e d i n gs t r a t e g yi nt h ep r o c e s sc o n t r 0 1 k e y w o r d s ：f e r m e n t a t i o n ；f e e d i n g ；d i s s o l v e do x y g e n ；s o f t s e n s o r ；p r i n c i p a lc o m p o n e n t r e g r e s s m n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是$ - a 4 篮导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 兰通囱墨 日 期： 璺堡生垒! 三 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 互量臼整 导师签名： e l 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 酒精发酵 1 1 1 酒精的简介 乙醇，俗称酒精，化学式c 2 h 5 0 h 。它主要以玉米、小麦、薯类、糖蜜或植物等为 原料，经发酵、蒸馏而制成。将乙醇进一步脱水后，经过变性处理成为变性燃料乙醇， 俗称燃料酒精。 近年来，随着全球石油资源这种有限的资源正以让人难以置信的速度被消耗，人们 开始把大量热情投放在生物能源上【1 】。生物能源是以可再生资源为原料生产的有利于环 境保护的能源物质，是提供可再生清洁能源的一条重要途径。燃料酒精生产技术成熟， 燃烧只产生水和二氧化碳，不增加其他污染物质，且燃料酒精便于储存、输送，并与现 有的加油站设施相容，和汽油相比燃烧时大大减少大气污染，因此，燃料酒精作为一种 高效清洁可再生能源成为最有潜力的替代能源之【2 j 。 1 , 1 2 发展燃料酒精的意义 燃料酒精是一种可再生的清洁能源，根据燃油中酒精含量的多少，燃料酒精的市场 可分为替代燃料( 添加高比例酒精的汽油醇) 和燃料添加剂两种。在众多的替代能源中， 燃料酒精能够得到更多的关注和更迅速的发展，是因为其具有以下独特的优势： ( 1 ) 缓解能源危机、保障国家经济安全【3 巧】 ( 2 ) 保护环境、减少污染 6 - 1 1 ( 3 ) 可以成为新的经济增长点，增加农民收入【1 2 j 从多方面考虑，酒精都是一种理想的替代型运输燃料。它比汽油对大气环境更有利， 能够以可再生资源生产，减少对不可再生的化石燃料的依赖。同时燃料酒精的应用还会 带动农村经济发展，增加农民收入。 国家在“十一五国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划) 申请指南中指出 在现代农业技术领域针对目前酒精、l - - 孚l 酸、酶制剂等大宗发酵产品生产中，原料利用 率低，生产周期长等问题，研究微生物细胞代谢调控工程技术、发酵过程能量平衡技术、 发酵过程质量平衡技术、高粘稠流体传质技术、在线智能流加和过程监控技术等，以实 现高强度和高密度发酵，降低发酵产品生产成本。从而建立高强度和高密度发酵生产新 技术。可见发展燃料酒精并对其进行智能控制具有非常重要的意义。 1 1 3 高强度酒精发酵 现今，许多科学家和科学工作者开始致力于应用生物技术对酒精发酵进行新菌种、 新工艺的开创性研究。而高强度酒精发酵现以成为当前酒精行业研究的热门课题。因此， 国内外就高强度酒精发酵进行了广泛的研究，并取得了明显的成绩。研究者多从分析限 制高效率( 高强度) 酒精发酵的因素着手，创造各种条件，以实现高效率酒精发酵。酒 江南大学硕十学位论文 ，精发酵强度的高低一方面取决于酵母菌本身的生长繁殖力、发酵力以及对发酵环境的耐 受能力，另一方面也取决于工艺对影响酵母菌发酵因素的控制上，具有了优良的生产菌 种，工艺条件的控制就显得非常重要。现在一般认为，影响高效率酒精发酵的因素有葡 萄糖浓度、酵母细胞密度及溶解氧浓度等方面【1 3 1 。 葡萄糖是酵母菌进行酒精发酵的主要基质，主要是供给酵母生长繁殖及生成酒精之 用，所以葡萄糖浓度控制适量与否直接影响酵母生长繁殖、发酵速度、发酵强度和发酵 时间。糖浓度过高时，由于发酵液中渗透压大，不利于酵母细胞膜的半渗透作用，不利营 养物质的选择和吸收，不利酵母的生长繁殖，同时也不利于酵母细胞内酒化酶将糖份发 酵为酒精。糖浓度过低时，发酵液中营养物质被耗用而不足，使酵母处于饥饿状态，酒化 酶活力低、发酵率低、酒精度低【1 4 1 。因此，控制合理的糖浓度十分重要。 目前酒精厂在生产过程中对通风量问题有不同的工艺要求，很多酒精厂只是在酒母 培养阶段通风，在发酵期都不通风，认为会发生有氧代谢。然而，因氧气的存在使酵母 从发酵转变为呼吸的巴斯德效应主要发生在低糖度的时候( 再 断补充营养，使菌体在较长时间内保持较高的生长速率，从而提高菌体的浓度，最终提 高目的产物的生产强度( 单位体积单位时间内产物的产量) 。不仅可减少培养体积、强 化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，极大地提高 产品在市场上的竞争力【l 7 1 。 1 2 2 高密度培养的补料方式钆，。 1 2 2 1 非反馈补料 非反馈补料主要有恒速流加、变速流加、指数流加等方法。 恒速流加法：补充的营养按预先设定的速率流加，培养过程中细菌的比生长速率逐渐下 降，菌体总量呈线性增加。陈坚等【l8 】利用恒速流加法高密度培养产朊假丝酵母合成谷胱 甘肽，培养4 5h 获得细胞干重7 3 l 。 变速流加法：在菌体密度较高时营养物的流加速率不断增加，以满足细胞生长的营养需 求。叶冰等人i l9 j 利用变速补料方式，发酵结束时细胞干重最高可达8 0g l 。 2 第一章绪论 指数流加法：营养物的流加速率呈指数增加，菌体总量可在恒定的比生长速率下呈指数 增加，该法简便易行，前提是要预先设定比生长速率等过程参数。周宇苟1 2 0 等用此法流 加葡萄糖，比生长速率控制在0 1 5h - i , 培养2 7h 即获得o d 6 0 0 为1 1 9 。 1 2 2 2 反馈补料 反馈补料的反馈指标主要有基质浓度、p h 、溶氧、比生长速率等。反馈补料的优点 是控制准确，操作重复性好，技术要求较低。但所需在线测量设备较多，控制复杂。- 残糖浓度反馈法：利用葡萄糖浓度的离线或在线数据，维持培养基中较低的残糖浓度。 但化学法、酶法分析葡萄糖耗时过长，葡萄糖电极技术也尚未成熟，对流加的控制较为 滞后，菌体密度不够理想。靳志强【2 l 】等利用残糖反馈法获得了较高的菌体密度，菌体干 重达到3 8 8 9g l ，较分批培养提高4 3 8 。 p h - s t a t 法：培养过程中当葡萄糖耗尽时，培养基的p h 会升高，因此在p h 上升时反馈 流加一定量葡萄糖，利用葡萄糖代谢产生的有机酸代替通常调节p h 的酸液，使培养基 p h 保持恒定。该方法缺点是p h 变化并不完全是葡萄糖代谢的结果，容易造成补料的错 误。p a r k1 2 2 | 等利用p h s t a t 法培养b a c i l l u ss u b t i l i s 达到l8 4g l 。 d o - s t a t 法：培养过程中葡萄糖浓度降低到一定程度时，菌体代谢强度下降，消耗氧能 力降低，反映为培养基中溶解氧浓度急剧上升，因此可在溶氧上升时反馈流加葡萄糖。 l i m l 2 3 j 等利用d o s t a t 法培养重组毕赤酵母达到1 4 0 9 l 。 补氨关联补糖法：依据菌体每消耗1g 氨氮的同时需要消耗1 5g 葡萄糖的数量关系，可 在培养过程中用氨水控制p h ，根据补氨量反馈确定补糖量，e p p s t e i n 等【2 4 】采用此方案， 结合富氧培养的方法，曾得到1 1 1 4g l 大肠杆菌的干重。 由于微生物生长代谢的复杂性，非反馈补料方式很难达到需要的控制精度。而反馈 控制方式中，无疑是残糖浓度反馈补料法的控制精度和效果最好，但是由于葡萄糖电极 ；难以承受高温灭菌，且价格昂贵，所以很少用于工业化生产中。目前在工业化生产中应 用的最多是p h s l a t 和d o s t a t 法。虽然这两种控制方法能很好地控制发酵罐中的营养 物质不过量，但是其使得发酵罐中的营养物质长期处于一种匮乏状态。所以两这种流加 方式是以牺牲微生物的生长速率来控制代谢副产物的积累。也就是说这两种流加方式并 没使得发酵罐中的营养物质处于c r a b t r e e 效应的临界值，而是远远低于这个临界值，所 以使用这两种补料方式使得微生物长期处于基质匮乏状态，且由于d o 和p h 的很大的 波动，所以这两种流加方式也不能达到很高的菌体浓度。 1 3 微生物发酵过程控制研究概况 1 3 1 发酵工业的发展 发酵工业是既古老又年轻的工业，它的形成经历了漫长的岁月。这里的“古老”指 的是其历史悠久，而所谓的“年轻 是指我们对其生产过程知其然而不知其所以然，要 彻底了解和掌握其微生物生产机理、规律，则相距甚远，目前的工作只是起步而己。随 着社会的进步，人类生活水平的提高，发酵工程对人类生活的作用越来越重要。“发酵 3 江南火学硕士学位论文 泛指利用微生物制造或者生产某些产品的过程【2 5 】，发酵过程是一种极其复杂的生化反应 过程，不仅具有一般非线性系统的时变性、非线性、关联性、不确定性等特点 2 6 , 2 7 】，而 且由于发酵过程的中的一些重要参数如生物质浓度和产物浓度都不可以在线测量，所以 发酵过程的控制比一般的非线性系统更加复杂【2 8 1 。 早期，国内大多数发酵工艺的管理和控制，尚处于人工操作方式。技术管理人员对 工艺参数的设置、管理和操作基本上还是手工操作和人工监视，这大大影响了工艺水平 和管理水平的提高，以至出现生产不稳定、发酵系数低、能耗大、成本高等问题。随着 发酵工业中的发酵罐越来越大，并行控制的发酵罐越来越多，对于这样的发酵罐系统， 若操作控制不当，将会造成极大的经济损失。因此，对于发酵过程的参数检测、操作监 视、自动控制，己成为发酵生产管理及其自动化的关键问题。若能采用计算机技术对发 酵过程进行实时控制、管理和优化操作，不但能解决上述存在的问题，而且可以降低工 人的劳动强度，提高自动化生产水平。 九十年代初期，国内一些发酵工厂己普遍采用计算机进行在线控制。传统的操作方 式是开环的，尽管对环境参数! t 1 p h 值、发酵温度、溶氧浓度等都可以控制得很好，但由 于微生物生长过程，一些关键变量还是不可在线测量，使发酵过程控制问题依然很复杂， 并且控制效果不理想。所以，发酵工业的闭环控制滞后于一般的工业生产过程控制。近 几年人们将主元回归、专家系统、模糊逻辑控制以及神经网络等用于发酵过程的控制已 取得了一定的成果【2 9 3 引。 1 3 2 发酵过程的参数 发酵过程的参数例可以分为三类：物理参数、化学参数和生物参数。 物理参数 在发酵过程中，主要的物理参数有发酵温度、发酵罐压力、空气流量、发酵液体积、 冷却水流量、冷却水进出口温度、搅拌转速、泡沫高度等，这些参数都有成熟的传感器 可以直接实现在线测量。 化学参数 发酵过程中的化学参数有p h 值、溶解氧浓度，它们对于发酵过程非常重要，生化反 应都需要有合适的酸碱环境才能朝着期望的方向进行，而溶氧浓度则是限制菌体生长的 关键性因素之一，溶解氧浓度低于临界值会使发酵过程急剧恶化。近年来，己有成熟的 p h ，溶氧电极可以应用。 生物参数 发酵过程的生物参数包括微生物呼吸代谢参数、生物质浓度、代谢产物浓度、底物 浓度以及微生物比增长速率、底物消耗速率和产物合成速率。现在国内外几乎还没有可 以在线测量生物参数的仪器，这也是发酵过程控制比一般工业生产过程控制难度更大的 原因。 4 第一章绪论 1 3 3 发酵过程的建模 发酵过程模型建立的传统方法是基于能量和物料平衡方程建立机理模型。这种机理 模型需要对过程的动态特性、传输特性及生化反应特性有深入的了解。另外，机理模型 的预测能力十分有限，这是因为发酵过程本身是高度非线性和时变的，其动态特性常常 是部分未知的或是完全未知的【4 们。从8 0 年代起，就有研究文章将线性估计技术应用于发 酵过程，然而，实际的工业系统是非线性的，所以，希望所使用的模型要能反映真实工 业过程非线性结构的特性。因此，要求所使用的估计算法，要么本身具有非线性的特性， 或者用具有自适应的线性模型来近似非线性。 1 3 4 软测量技术概述 1 3 4 1 软测量技术的基本含义 软测量就是采用过程中比较容易测量的变量，构造推断估计器来推算出难以测量或 根本无法测量的被检测量的一种间接测量方法】。其估计值可作为控制系统的被控变量 或反映过程特征的工艺参数，为优化控制和决策提供重要信息。 软测量技术是依据某种最优化准则，利用由辅助变量构成的可测信息，通过软件计 算实现对主导变量的测量，也称为软仪表【4 2 1 ，它的核心是表征辅助变量和主导变量之间 的数学关系的软测量模型。因此，构造软仪表的本质就是如何建立软测量模型，即一个 数学建模问题。但是，软测量也并不完全局限于由辅助变量去估计不可测量这个范畴【4 引， 它可以推广到如下情况：在工业过程中，许多系统的输出不能及时地测量，这给过程的 控制和监测带来很大困难，通过历史测量和分析数据建立准确的过程模型，就可以将系 统的输出实时地反映出来。这种由工业过程输入值通过估计器( 软件模型) 实时得到系统 输出的方法也称为软测量技术。 采用软测量技术构成的软仪表，以目前可有效获取的测量信息为基础，其核心是利 用计算机语言编制的各种软件，具有智能性，可以方便地根据被测对象特性的变化进行 修正和改进。因此，软仪表在可实现性、通用性、灵活性和成木等方面均具有无可比拟 的优势，其突出的优点和巨大的工业应用价值不言而喻。 1 3 4 2 软测量技术的应用 由于软仪表可以像常规过程检测仪表一样为控制系统提供过程信息，因此软测量技 术目前己经在过程控制领域得到了广泛应用。相对于硬件检测设备，软仪表的开发成本 较低，配置比较灵活，维护相对容易，各种变量的检测可以集中于一台控制计算机上， 无需为每个待检测的变量配置新的硬件。软测量技术作为过程检测领域中一种新型的参 数测量技术，不仅用于实现众多目前难以用常规仪表直接测量的所谓难测参数的在线检 测，还可以为高级过程控制和在线稳态优化提供被控变量和其它的过程信息。 由于采用软测量技术一方面可以获取更多的过程信息，另一方面由于软仪表的载体 是计算机软件，可以通过合理的编程，综合运用各种所获信息实现过程的故障诊断和状 态监测等，并对生产过程进行评估和协调，因此软测量技术在过程监测和生产管理中也 江南大学硕+ 学位论文 有十分重要的作用。 事实上，软测量技术的思想早就被潜移默化地得到了应用【“4 7 1 。工程技术人员很早 就采用体积式流量计( 例如孔板流量计) 结合温度、压力等补偿信号，通过计算来实现气 体质量流量的在线测量，而7 0 年代就已提出的推断控f l ；t j ( i n f e r e n t i a lc o n t r 0 1 ) 策略至今仍可 视为软测量技术在过程控制中应用的一个范例【4 8 - 5 0 1 。然而软测量技术作为一个概括性的 科学术语被提出是始于8 0 年代中后期。至此，它迎来了一个发展的黄金时期，并且在全 世界范围内掀起了一股软测量技术研究的热潮。1 9 9 2 年国际过程控制专家t j m a v o y 在 著名学术刊物a u t o m a t i c a 上发表了一篇题为“c o n t e m p l a t i v es t a n c ef o rc h e m i c a lp r o c e s s c o n t r o l ”的i f a c 报告【5 1 1 ，明确指出了软测量技术将是今后过程控制的主要发展方向之 一，这对软测量技术的研究起了重要的促进作用。 经过多年的发展，目前己提出了许多构造软仪表的方法，并对影响软仪表性能的因 素以及软仪表的在线校正等方面也进行了较为深入的研究。软测量技术在很多实际工业 装置上也得到了成功应用，井且其应用范围不断地在拓展。早期的软测量技术主要用于 控制变量或扰动不可测的场合，其目的是实现工业过程的复杂( 高级) 控制，而现今该技 术己渗透到需要实现难测参数在线测量的各个领域。软测量技术己成为过程控制和过程 检测领域的一大研究热点和主要发展趋势之一。 1 3 4 3 发酵过程的软测量技术 发酵过程作为一种复杂的生化反应，它比一般的非线性系统更加复杂，主要表现在： 发酵过程中有复杂的物理、化学反应过程，发酵过程的参数众多，并且没有合适的测量 这些参数的仪器，这使得发酵过程的建模和控制很困难，所以迄今为止，对发酵过程的 控制还没有很好的方法。由于缺少对过程参数的测量、监测和控制的实时系统，使得发 酵产品的成本高、操作费用高。降低发酵过程的能耗、降低成本和提高产品的产率是发 酵过程控制的一个目标，而实现这个目标最重要的一环，就是能够在不增加实际仪表的 基础上实时地获得过程参数。软测量技术是解决发酵过程中普遍存在的一类难以在线测 量变量估计问题的有效方法。它克服了人工分析及使用在线分析仪表的诸多不足，是实 现在线测量控制及先进控制优化控制的前提和基础。在软测量技术中一般采用人工神经 网络 5 2 , 5 3 】、主元回归 5 4 , 5 5 】、最小二乘法【5 6 - 58 1 、模糊数学【5 9 】等多种方法进行发酵过程控制 的建模。 1 4 立题意义 所谓发酵过程控制，就是把发酵过程的某些状态变量控制在某一期望的恒定水平上 或者时间轨道上。很多情况下，过程的最优化就是靠把某些状态变量定值控制在某一水 平或者程序控制在某一时间轨道上才得以实现的。所以在工业化大生产中工艺条件的控 制就显得非常重要。 在线控制是当前发酵过程控制的发展趋势。实现发酵过程的在线优化和控制，需要 在线测定一些过程参数，然而，现实中能够用于大规模工业生产，而且操作维护简易、 性能稳定、价格低廉的检测设备并不多。能够最真实地反映过程内在状况和本质的基质 6 第一章绪论 浓度、产物浓度、细胞浓度等的在线测定设备价格昂贵、操作维护复杂、基本上仍然停 留在实验室的水平。工业上较为成熟的可测量变量一般只有p h 、d 0 、发酵罐进出口处的 气体分压等为数不多的几个。因此，除了不断地开发适用于生物过程的新型传感器和在 线检测技术，当前如何能够有效地利用为数不多成熟的在线检测设备对发酵过程进行控 制也是急需研究的课题之一。为此，本文应用工业发酵中常用的在线检测设备，对高密 度和高强度酒精发酵的过程控制进行了研究，在此基础上将软测量技术应用于发酵过程 控制，进行底物浓度的实时预测，从而建立一种营养物质的在线流加方式。该种流加方 式较好地把发酵罐中的营养物质控制在了一个合适的水平，在很大程度上节约人力物 力，并且具有较强的稳定性与可靠性。是把控制学中先进的控制手段与传统发酵行业结 合的一次很好尝试，具有重要的学术和应用价值。 软测量模型是建立在较优的发酵工艺控制条件的基础之上的，因此，首先利用流加 和溶氧控制策略对高密度和高强度酒精发酵进行了研究，得到了较为优化的工艺控制条 件，为模型的建立奠定了基础，也为实际酒精发酵尤其是糖蜜酒精发酵工艺的改进提供 了一定的实验基础；其次，提出针对发酵过程中关键生物量测量的数据驱动法，重点以 主元回归作为该软测量的实现方法，用主元回归对酒精发酵过程中的可以实现在线测量 的葡萄糖浓度进行预测，网络测试结果验证了该方法的可行性和有效性，为解决类似发 酵过程优化控制中不易测量生物量( 基质浓度、菌体浓度、产物浓度等) 的在线测量问题 提供了一个新的思路。在此基础上，设计了一套生物发酵控制系统，实现了酒精发酵过 程中葡萄糖浓度的在线测量与流加控制。该种控制方法以工业中成熟的发酵设备为基 础，易于工业化生产，有望为工业化生产提供一种新兴微生物发酵控制方法。 1 5 本论文的主要研究内容 l 摇瓶中酵母培养条件的初步优化 2 流加对菌体生长和酒精发酵的影响 3 利用溶氧控制策略进行高密度和高强度酒精发酵的研究 4 软测量模型的构建和葡萄糖反馈在线流加方式的实现 7 江南大学硕士学位论文 第二章摇瓶中酵母培养条件的初步优化 2 1 引言 微生物的生长和代谢产物的积累既受到菌种本身的影响，也受到营养和环境条件的 影响，其生物合成途径、产物种类及其性质、产量及产率与p h 值、接种量和初始糖浓 度等多种因素有密切关系。因此，选择合适的发酵条件是极其重要的。本研究以单因素 实验初步优化了酵母发酵培养条件，为酵母在发酵罐上的扩大化生产奠定一些实验基 础。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 试剂与原材料 葡萄糖化学纯安徽丰源生物化学股份有限公司 蛋白胨( 鱼粉)分析纯国药集团化学试剂有限公司 酵母粉分析纯英国o x o i d 公司 无水乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司 琼脂条状国药集团化学试剂有限公司 2 2 1 2 仪器与设备 j y 0 7 0 7 电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司 7 2 1 分光光度仪上海精密科学仪器有限公司 s b a 4 0 b 生物传感仪山东省科学院生物研究所 超净工作台苏州净化设备厂 h y g a 全温摇瓶柜太仓市实验设备厂 s e v e n m u l t i 型p h 电导率离子综合测试仪 上海梅特勒托利多仪器有限公司 座式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂 电热恒温培养箱上海森信实验仪器有限公司 台式离心机上海安亭科学仪器厂 2 2 2 菌种与培养基 菌种：酿酒酵母( 实验室保藏) 平板保藏及活化培养基( l ) ：蛋白胨1 0 ，酵母膏1 0 ，葡萄糖2 0 ，琼脂2 0 。 种子培养基( l ) ：葡萄糖4 0 ，蛋白胨l o ，酵母膏1 0 ，自然p h 。 发酵培养基组成( l ) ：葡萄糖4 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏1 0 ，自然p h 为5 0 。 流加培养基( l ) ：葡萄糖7 0 0 培养基灭菌条件：1 15 0 c 下灭菌2 0m i n 。 第二章摇瓶中酵母培养条件的初步优化 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 种子活化方法 接一环生长良好的斜面酵母至5 0 2 5 0m l 的培养基中，3 0 0 c ，1 0 0r m i n ，于摇床上活 化2 4h 。 2 2 3 2 种子培养基的摇瓶培养法 将活化后的种子液以1 0 的接种量接入到5 0 2 5 0m l 的种子培养基中，3 0 0 c ，1 0 0 r m i n ，于摇床上培养1 2h 。 2 2 3 3 发酵培养基的摇瓶培养法 将培养好的种子液以8 接种量接种到5 0 2 5 0m l 发酵培养基中培养，3 0 0 c 、1 0 0 r m i n 。 2 2 4 分析方法 2 2 4 1 葡萄糖的测定 采用s b a 4 0 b 生物传感仪( 山东省科学院生物研究所产) 测定：发酵时每隔一定 时间取一次样，发酵液经5 0 0 0r m i n 离心机离心5m i n 取上清液。将待测液稀释到测定 范围内；利用s b a 4 0 b 生物传感仪，进行测定。 2 2 4 2 菌浓的测定 将菌悬液作适当稀释，用可见分光光度计于6 0 0 n m 下测定吸收值( o d 6 0 0 ) 。用相同 稀释倍数的空白培养基作对照，扣除对照中固形物的吸收值，o d 6 0 0 = o d 6 0 0 读数稀释 倍数。 2 2 4 3p h 值的测定。 采用精密酸度计测定p h 值 2 3 结果与讨论 2 3 1 种子液最佳培养时间的确定 在种子培养过程中，随着培养时间的增加，菌体密度逐渐增加，但是菌体量生长到 一定量后，由于营养物质消耗和代谢产物的积累，菌体会逐渐趋于老化，因此，对于种 子来说种龄的控制是非很重要，一般以菌体处于生命力旺盛的对数期为宜。图2 1 为酵 母种子的生长曲线，一开始酵母种子经历一段时间的延滞期，大约为6h 左右进入对数 生长期，1 4h 左右进入平稳期，最终的菌体o d 达到1 2 。由于种子的对数生长期较长， 为了确定种子液的最佳培养时间，本实验将种子液分别培养8h 、1 0 h 、1 2h 、1 4h 、1 6h 后接入发酵培养基中培养1 2h 。考察不同接种时间对菌体生长的影响，从图2 2 中可以 看出种子液培养1 2h 进行接种菌体生长最好。 9 江南大学硕十学位论文 o 5l o1 52 02 5 时间( h ) 图2 1 酵母的生长曲线 f i g 2 1g r o w t hc u r v eo fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 1 01 21 41 6 时间( h ) 图2 - 2 接种时间对菌体生长的影响 f i g 2 - 2e f f e c to fi n o c u l m i o nt i m eo ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg r o w t h 2 3 2 培养基初始p h 对茵体生长的影响 培养基或环境中的p h 值与微生物的生命运动有着密切的联系。它的影响是多方面 的，因为环境的p h 会影响到细胞膜所带的电荷，从而引起细胞对营养物质吸收状况的 改变。此外，还可以通过改变培养基中有机化合物的离子化程度，而对细胞施加间接的 影响，改变某些化合物分子进入细胞的状态，从而促进或抑制微生物的生长，还可影响 环境中有害物质对微生物的毒性；同时p h 还影响培养基中某些营养物质的分解或中间 代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。 另外，酿酒酵母对酸度耐受性的高低是评价酒精酵母优劣的重要指标。在生产中经 常人为的调高发酵液的酸度，尽管对酵母的生长有所影响，但是能大大抑制杂菌的生长。 因此，有必要研究培养基的初始p h 对发酵的影响。从图2 3 可以看出，p h 越低对菌体 生长影响越明显，自然条件下p h 为5 ，当p h 为4 5 时其生长状态同在自然p h 下相差 不多，因此我们在酒精发酵过程中将p h 控制在4 5 左右。 1 0 4 2 0 8 6 4 2 0 rhl，llr1。r。l 包 豇 t & 第二章摇瓶中酵母培养条件的初步优化 m 一川1 川1 接种量 图2 4 接种量对酵母生长的影响 f i g 2 4e f f e c to fi n o c u l a t i o ns i z eo ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg r o w t h 接种量的大小与菌种特性、发酵条件等有关，不同的微生物其发酵的接种量是不同 的。本实验考察了不同的接种量对菌体生长的影响，结果见图2 4 。 接种量的大小直接影响发酵周期，接种量小，菌体生长缓慢，对数生长期持续时间 长；接种量大，延滞期越短，酵母细胞的生长越快，可缩短生长达到高峰的时间，细胞 较快地达到稳定期，使产物的合成提前。由图2 4 可以看出，当接种量为8 时菌体浓 度最高。 2 3 4 酒精浓度对酵母生长的影响 + 酿酒酵母的代谢产物乙醇对其自身的生长繁殖及发酵具有抑制作用，酵母菌种不 同，对乙醇的耐受能力是不同的，为此本试验在培养基中加入不同含量的酒精。分别按 照o ，l ，3 ，5 ，7 ，9 的浓度将酒精加入培养基中培养1 2h ，考察其对菌 体生长的影响。从图2 5 可以看出，培养基中含酒精越少，菌体生长地越好，随着酒精 浓度的升高，对菌体生长的抑制越明显，然而在酒精浓度达到5 的时候，酵母的细胞 仍能保持接近1 2 的o d 值，体现了对酒精一定的耐受性。当酒精度高于7 时，菌体的 繁殖速度非常缓慢，抑制非常明显。 r-l。pll 江南大学硕十学位论文 2 0 1 5 童1 0 。 5 0 o2468 时问( h ) 一u 凸一1 一3 一一5 一7 o 一9 图2 - 5 酒精浓度对茵体生长的影响 f i g 2 - 5e f f e c to fe t h a n o lc o n c e n t r a t i o no ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg r o w t h 2 3 5 初糖浓度对酵母生长的影响 基质浓度对菌体生长有很大的影响，我们考察了不同基质浓度下酵母菌的生长状 况，从图2 - 6 中可以看出，随着葡萄糖浓度的升高，菌体密度也随之增加，菌体的o d 值最高达到2 3 。而当葡萄糖浓度大于1 5 0g l 时，菌体密度开始随着葡萄糖浓度的升高 而降低；从图中菌体生长曲线可以看出，随着葡萄糖浓度的升高，菌体的生长速率逐渐 2 5 2 0 昌1 5 心 口 o1 0 5 0 051 01 52 02 53 0 时问( h ) + 4 凸一1 0 + 1 5 一x 一1 9 一x z b 图2 - 6 初糖浓度对酵母生长的影响 f i g 2 6 e f f e c to fi n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg r o w t h 降低。说明在发酵初期葡萄糖浓度较高对酵母的发酵产生很大的抑制作用，使菌体的生 长受到抑制，不能很快达到较大的菌体浓度，因而发酵过程缓慢。一般而言，在发酵过 程中，我们希望菌体浓度能够很快达到一个较高的水平，因此，控制底物浓度在合适的 水平变的非常重要。 2 3 6 间歇流加发酵对菌体生长的影响 从上面的研究中发现，当初使葡萄糖浓度较高时，菌体生长就会受到一定的抑制， 而选择较低的初始糖浓度时，虽然有利于菌体生长，但葡萄糖过早的消耗完，不能满足 生长需要，最终菌体浓度不高。针对这一特点，采用流加发酵工艺来减轻或消除底物抑 制对发酵的影响。本实验考察了间歇流加发酵对酵母发酵的影响，摇瓶培养基的初始浓 1 2 第二章摇瓶中酵母培养条件的初步优化 度为4 0g l ，每隔2h 时取样分析葡萄糖的消耗情况，当葡萄糖浓度较低时，流加高浓 度葡萄糖，补料后将葡萄糖的浓度控制在6 0g l 左右。从图2 7 可以看出，采用间歇流 加方式，最终菌体的o