（生物医学工程专业论文）脐带血干细胞的培养与收获.pdf

脐带血干细胞的培养与收获 h a r v e s to f s t e mc e l l sd e r i v e df r o mu m b i l i c a lc o r db l o o d a b s t r a c t u m b i l i c a lc o r d b l o o d ( u c b ) c o n t a i n sb o t hh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ( h s c s ) a n d m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( m s c s ) h s c sh a v eb e e nu s e df o rg e n et h e r a p y ，t u m o rd e p o l l u t i o n a n dh e m a t o p o i e s i sr c c o n s t i t u t i o n u c b m s c sa sa n o t h e rt y p eo fs t e mc e l l si nu c b 。c a nn o t o n l ys u p p o r tt h ee x p a n s i o no fh s c si nv i t r oa ss t r o m a lc e l l sb u ta l s oa l l e v i a t ec o m p l i c a t i o n s a n da c c e l e r a t er e c o v e r yo fh e m a t o p o i e s i sd u r i n gh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n t h e r e f o r , c o - c u l t u r i n gh s c sa n dm s c sd e r i v e df r o mh u m a nu c bi su s e f u lf o rc l i n i c a l a p p l i c a t i o n s i nt h i ss t u d ym i c r o c a r f i e r sw e r ea p p l i e dt op r o v i d es u r f a c ef o ru c b m s c st oa d h e r ed u r i n g t h ec o - c u l t u r e f i r s t ，w ed e s i g n e da no r t h o g o n a le x p e r i m e n tt oa n a l y z et h ef a c t o r si n f l u n c i n g t h ea d h e r i n go fu c b - m s c s ，i n c l u d i n gt h ea d d i t i o no fs e r u m ，t h ea d d i t i o no fc y t o k i n ea n dt h e t y p eo fm i c r o c a r f i e r i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a ts e r u l ni st h ei m p o r t a n tf a c t o rf o rt h ea d h e r i n g o fu c b m s c s t h e nc o n s i d e r i n gt h es a f e t yo fc l i n i c a la p p l i c a t i o n s ，w et r i e dt ou s ea u t o s e r u mf r o mu c bt o r e p l a c ef e t a lb o v i n es e r u m i tw a sv e r i f i e dt h a tt h ea u t o s e r u mh a dt h es a m ee f f e c ta st h ef b s a n db o t ht h eu c b h s c sa n du c b m s c sc a nb eh a r v e s t e ds i m u l t a n e o n s l ya f t e rt h ec u l t u r e i na d d i t i o n , t h et w ok i n d so fs t e mc e l l sc a nb es e p a r a t e de a s i l yw i t hs e d i m e n t a t i o na f t e rt h e c o c u l t u r eb e c a u s eo ft h ed i s t i n c ts i z ed i f f e r e n c eb e t w e e nc y t o d e x 3m i c r o c a r r i e ra n d s u s p e n d e dh s c s a n dt h ep r o b a b i l i t yo fc u l t u r eu c b m s c sw i t ha u t o s e r mw a sa b o u t71 4 l a s t l y ，w ei n v e s t i g a t e di ft h ec o n c e n t r a t i o no fa u t o s e r u mc a ni n f l u n c et h ee x p a n s i o no f u c b m s c sa n du c b h s c s f o u rc o n c e n t r a t i o n s ，2 8 ，5 6 ，8 3 a n d1 1 1 w e r e s e l e c t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ee x p a n s i o n so fu c b h s c sc u l t u r e d 丽t l l5 6 a u t o s e r u mi s1 8 8 士0 3 3f o l d s b e a e rt h a l lo t h e r s a n dt h ec o n c e r t r a n t i o nh a dl i t t l ee f f e c to n t h ee x p a n s i o no fu c b m s c s s o5 6 a u t o s e r u mi st h eo p t i m i z a t i o nc o n c e r t r a n t i o nf o r c o c u l t u r eu c b h s c sa n du c b m s c s k e yw o r d s ：a u t o l o g o u ss e r u m ；u m b i l i c a lc o r db l o o d ，u c b ；h e m a t o p o i e t i cs t e m c e l l s ，h s c s ；m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ；m i c r o c a r r i e r i i 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他己申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：j ；薄j 查丘垒- = 已绷划包盔d 盔本立l 丛l 作者签名： 盘熟基 日期一逻艺年王月l 日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目： 蚯晕垒翅蝈邑塑透番刍选蓥 学位论文题目： 监颦垒翅 i 些塑缝岙当公独 作者签名：盟熟丞日期：z 望年z 月厶日 导师签名：丝塑玺五日期：垄翌年z 月上日 大连理工大学硕士学位论文 引言 脐带血( u m b i l i c a lc o r db l o o d ，u c b ) 中所含的两种干细胞，造血干细胞 ( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，h s c s ) 和间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 均 具有重要的临床应用价值。h s c s 作为具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞【l 一， 不仅可以用于造血重建、肿瘤净化、基因治疗及生物免疫治疗，还可以作为细胞治疗的 种子细胞和基因治疗的载体细胞。但由于其数量有限，严重限制了其临床应用。 m s c s 作为中胚层具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在一定条件下 进行体外培养和诱导分化后能向神经、成骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和心肌等细胞方 向分化。m s c s 不仅可作为细胞治疗的种子细胞、基因治疗的载体细胞【3 叫，还可以作为 基质细胞支持h s c s 的体外扩增、加速造血重建功能的恢复及降低造血干细胞移植 ( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ，h s c t ) 引起的综合并发症的发生率。因此，在 同一个体系内实现同一来源的h s c s 和m s c s 的共培养，具有重要的临床应用价值。 然而，h s c s 和m s c s 分别具有悬浮生长和贴壁生长的生物学特性，体外必须同时 提供悬浮培养环境与动态贴附表面，才有可能在模拟体内微环境的条件下实现h s c s 和 m s c s 的共培养。微载体与适宜生物反应器相结合是解决此问题的可行方法。 微载体技术开始于1 9 世纪6 0 年代，微载体技术用于细胞培养开始于1 9 世纪6 0 年 代末期，最早使用离子交换凝胶( d e a e s e p h a d e xa 5 0 ) 作为载体 7 1 ，轻微搅动即可悬 浮在培养基中。由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。随后 的几十年里，很多研究人员对微载体基质及表面都做了改良，增加其生物相容性并使其 更适宜细胞的贴附、生长。 影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面：在细胞方面，如细胞群 体、状态和类型；在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表 面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢；在培养环境中，如培养基组成、温度、p h 、 溶解氧以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。 由于正交实验设计法是研究与处理多因素实验的一种科学方法，特别适合于科学的 挑选实验条件，从中找出最优或较优的实验方案。因此，本论文采用正交实验方法考察 了微载体类型、是否添加血清和细胞因子，对原代u c b m s c s 在微载体表面的黏附的 影响，从而筛选出适宜u c b m s c s 在微载体表面黏附的相关条件。 另一方面，常规的培养体系中，一般添加胎牛血清等动物血清来为细胞的生长和扩 增提供各种营养成份。然而，这种体系培养扩增的细胞，在临床应用上存在免疫排斥反 应，而且还可能导致人与其他物种间病毒的传播。因而，越来越多的学者，开始使用人 脐带血干细胞的培养与收获 自体血清来替代传统的胎牛血清。本论文尝试提取了同一份脐带血的血清，添加在培养 基中来替代传统的胎牛血清，并考察了自体血清用量对两种共培养细胞扩增效果的影 响。 大连理工大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 脐带血来源的造血干细胞 1 1 1 定义、分类及来源 脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不 用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干祖细 胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来 源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。也是一种非常重要的人类生物资源。 造血干祖细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mp r o g e n i t o rc e l l s ，h s p c s ) 是具有自我更新和多向 分化能力的细胞，如图1 1 所示【1 1 。目前人们认为，h s c s 可以分为三类：长期自我更新 的h s c s ；短期自我更新的h s c s ；多功能性的h s c s 引。h s c s 通常有三个来源：骨髓、 外周血及脐带血。 _ b 删 n k c d l 器蕊膏姆d e n d r i t i c ltr-hsc s i r i i s c ，、垂g m p 吾= ( n 一 孓，1 厂 w ”唧珥 一et31一hr囊蚋c m p一忒，一 脐带血干细胞的培养与收获 脐血造血干细胞( c b s c ) 与骨髓、外周血相比，具有富含更早期的造血干祖细胞、 免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、成熟性t 细胞较少、采集和保存容易、无肿 瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、c d 3 4 + c d 3 8 。与c d 3 4 + c d 3 3 。的比例较高，在移 植过程中，脐血还可以减少移植物抗宿主病( g v h d ) 发生率，来源广泛等一系列优点， 这使得与脐带血有关的造血干祖细胞研究成为热点。特别是自1 9 8 8 年法国的g l u c k m 觚【3 】第一次利用脐带血移植来治疗一名患f a n c o n i 贫血病的儿童以来，脐带血移植得到 更加广泛的重视，国内外已竞相建立了众多的脐血库，表明人们对所保存的脐带血用于 治疗日后的各种疾病给予了无限的希望 1 1 2 临床应用及存在的问题 造血干祖细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mp r o g e n i t o rc e l l s ，h s p c s ) 在治疗贫血等血液疾病、 白血病等癌症病人高剂量放化疗后的造血重建、基因治疗和免疫治疗以及制备成熟血液 产品等方面有极重要的临床应用价值，因此多年来一直得到科研工作者和临床医生的高 度重视和关注。 然而单份脐带血只有5 0 1 0 0 毫升，所含的造血干祖细胞数量有限，直接用于细胞 移植时最多仅够3 0 公斤以下体重的儿童使用，不足以用于成人重建其骨髓的造血功能 【1 1 。据德国和美国联合收集8 7 1 个脐血标本分析，平均有核细胞含量为( 9 5 ) 1 0 8 ， 而用于干细胞移植至少每公斤体重要输入3 1 0 8 有核细胞或2 - - 5 1 0 6 c d 3 4 + 细胞d 1 。 目前，有两种办法可以增加可移植的c bm n c 数量，一个是移植混合的脐带血【5 】，另一 个就是体外扩增c b h s c s 。前者在免疫等方面存在很多问题，因此，在体外扩增c b h s c s 的研究日益受到重视。 目前，h s c s 已被应用于造血重建、基因治疗、肿瘤净化及免疫治疗等方面【9 。1 1 】，但 目前阻碍h s c s 广泛应用的主要问题是各种来源的干细胞数量有限，远远达不到临床应 用的需求。因此，最直接有效的方法是通过h s c s 的体外大规模扩增来解决该问题。 1 1 3 造血干细胞体外扩增的研究现状 造血干细胞的体外扩增被视作为造血治疗最有希望、可行的方式。到目前为止，前 人在h s c s 体外扩增方面做了大量的工作。m a d l a m b a y a n 等在2 4 孔板中培养纯化后的 u c b l i n - 细胞，其培养体系为在无血清的i m d m ( i s c o v c s sm o d i f i e dd u l b c c c o sm e d i u m ) 培养基中添加干细胞因子( s t e mc e l lf a c t o r , s c f ) 、酪氨酸激酶3 配体( t y r o s i n ek i n a s c3 l i g a n d ，f i t - 3 l ，f l ) 、血小板生成素( t h r o m b o po i e t i n ，t p o ) ，第8 天时总有核细胞( n u c l e a r c e l l s ，n c s ) 及c d 3 4 + 细胞分别扩增t 2 0 倍和1 2 倍【1 2 】。y a m a g u c h i 等在不添加血清，有基 质细胞支持的条件下，体外扩增c d 3 4 + 细胞两周，c d 3 4 + 细胞扩增了1 0 0 多倍【1 3 1 。c o l l i n s 大连理工大学硕士学位论文 等在转瓶内扩增脐带血及外周血来源的单核细胞( m o n o n u c l e a rc e l l s ，m n c s ) ，采用稀 释换液的方式使有核细胞扩增t 3 9 7 倍1 1 4 1 。k o l l e r 等在连续灌注生物反应器内培养骨髓来 源的单核细胞两周，总有核细胞、粒单系集落形成单位( g r a n u l o c y t e m a c r o p h a g e c o l o n y f ot r u i n g u n i t s ，c f u - g m ) 、红系爆式集落形成单位( e r y t h r o c y t eb u r s t f o r m i n gu n i t s ， b f u e ) 及长期培养起始细胞( l o n g - t e r mc u l t u r ei n i t i a t i n gc e l l ，l t c i c ) 分别扩增了l o 倍、2 1 倍、1 2 倍和7 5 倍【l5 1 。我校干细胞实验室也在旋转壁式生物反应器内培养脐带血 来源的单核细胞8 天，细胞总数，c d 3 4 + 细胞数及粒单系集落形成单位 ( g r a n u l o e y t e - m a e r o p h a g ec o l o n y - f o r m i n gu n i t s ，c f u - g m ) 分别扩增 4 3 5 5 4 - 8 7 6 倍、3 2 7 1 5 6 倍和2 1 7 q - 4 9 倍【1 6 j 。 虽然大量的h s c s 体外扩增系统已经建立起来，但由于体内造血微环境的复杂性以 及多影响因素之间的相互作用，如细胞因子、血清及基质细胞的支持作用等的影响，至 今仍然没有找至i j h s c s 体外扩增条件与扩增效果之间的定量关系，更没有一个标准化方 案来实现h s c s 的最佳扩增。另外，由于血清的成分复杂，其成分对细胞生长和扩增的 影响的不确定性，无论是添加细胞因子还是基质细胞都无法完全替代血清的作用。然而， 在现阶段的研究中，在有血清的培养体系中，一般添加胎牛血清( f e t a lb o v i n es e l r n l f b s ) ，或是胎牛血清和马血清，但是由于动物血清的使用，在移植成功后可能产生免 疫排斥反应，这将严重限制扩增后的h s c s 的临床应用。因此，本文考虑了添加入自体 血清。 1 1 4 造血干细胞体外培养的评价指标 h s c s 体外扩增后，评价指标主要包括总有核细胞( n u c l e a rc e l l s ，n c s ) 的扩增、c d 3 4 + 细胞的扩增、l t c i c 的扩增、c f u c s 的扩增。临床上h s c t 一般以n c s 数、c d 3 4 + 细胞数及c f u c s 数来衡量所需输注的细胞量，并认为输注后中性粒细胞及血小板的恢 复时间与输注的n c s 数及c d 3 4 + 细胞数密切相关。因此，本文对h s c s 体外扩增的评价 指标选定为n c s 、c d 3 4 + 细胞的扩增。 1 2 脐带血来源间充质干细胞 1 2 1 定义及特征 脐带血中含有丰富的干细胞，主要包括造血干祖细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e m p r o g e n i t o r c e l l s ，h s c s h p c s ) 和间充质干祖细胞( m e s e n c h y m a ls t e m p r o g e n i t o rc e l l s ，m s c s m p c s ) 。 m s c s 是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。在一定 条件下进行体外培养和诱导分化后能向神经细胞( 神经元和神经胶质细胞) 、成骨细胞、 软骨细胞、脂肪细胞、肌腱、肌肉和心肌细胞等方向分化，可作为细胞治疗的种子细胞 脐带血干细胞的培养与收获 和基因治疗的载体细胞，而且m s c s 在连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能， 可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。 间充质干细胞( m s c s ) 最初在骨髓中发现【1 7 1 ，然而在以后的研究中发现随着供者 年龄的增加，骨髓来源的间充质干细胞的数量及分化能力均有所下降1 8 1 。因而，越来越 多的研究人员将目光转向其他可能含有m s c s 的间质组织，后来研究发现m s c s 广泛分 布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐 带血等间质组织内【l 蝴1 1 。 脐带血来源的间充质干细胞( u c b m s c s ) 最早由a l e j a n d r oe r i c e s 等【z l j 在2 0 0 0 年从人的脐带血中获得，并从细胞形态学等方面予以证明。随后的研究中也有学者对脐 带血中是否能获取m s c s 提出质疑1 2 2 ，然而更多的研究实验还是证实了脐带血是间充质 干细胞的来源之一因，冽。 迄今的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想 替代物，而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子 标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、 易于工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1 2 2 临床应用及存在的问题 m s c s 已被应用于细胞移植治疗、基因治疗、生物组织工程及免疫治疗等方面。鼬 m 等近来的研究发现，将m s c s 与h s c s 共同移植时，能获得比单纯h s c s 移植更理想 的治疗效果。将人的m s c s 和人的u c b c d 3 4 + 细胞共同移植到n o d s c i d 小鼠时，发 现共同移植的小鼠外周血、骨髓和脾脏内能检测到比单纯c d 3 4 + 细胞移植组明显增多的 造血系细胞【2 5 1 。另外，由于m s c s 具有多向分化的干细胞特征，体外易于分离和扩增， 回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活，并且多种外源目的基因可整合至 m s c s 基因组d n a 中并能长期表达，因此，m s c s 作为一种理想的靶细胞可用于基因治 疗。除了通过细胞移植来修复受损组织和器官，m s c s 还能通过组织工程的方法参与受 损组织和器官的修复。l eb l a n c 等的研究表明，m s c s 无免疫原性，不刺激同种异体反 应，且能逃避细胞毒性t 细胞和自然杀伤细胞的溶解| 2 6 1 。他们还研究了当淋巴细胞在有 m s c s 存在的情况下被活化时淋巴细胞活化标志的表达情况，发现m s c s 能抑制血细胞 凝集素刺激的c d 3 + ，c d 4 + 和c d 8 + 淋巴细胞的增生，减少淋巴细胞活化标志的表达， 且抑制淋巴细胞增生。这些发现意味着m s c s 不仅自己不刺激同种异体反应，而且还能 抑制宿主的免疫反应，可用于有些免疫相关的疾病的治疗。其中最有意义的，就是在治 疗移植物抗宿主反应中的应用【2 刀。 大连理工大学硕士学位论文 但是目前u c b m s c s i 临床应用面临的最大的问题是按照传统培养方法，即培养基中 只添加胎牛血清，一般仅有2 0 - - - 3 0 的脐血样本能分离培养出m s c s ；而通过对培养条 件的优化，也只能将培养成功率提高到5 0 巧o 左右，如此低的培养成功率极大的浪费 了脐带血资源，有必要进一步对其原代培养条件进行优化，提高培养成功率。 1 2 3 脐带血来源间充质干细胞分离培养的研究现状 前人在提高u c b m s c s 培养成功率方面做了大量的优化工作。y a n g 等【2 引采用在 a m e m 培养基中添加l0 胎牛血清( f e t a b o v i n e $ e r u n l ，f b s ) 的方法，培养u c b m s c s ， 在4 11 分脐血当中仅有9 5 份成功地培养出了m s c s ，占总数的2 3 。而b o t h 等【2 9 】通过对培 养基以及接种密度等培养条件的优化，确定了骨髓m s c s 的适宜培养条件：m e m 培养 基要优于d m e m 培养基，细胞低密度接种优于高密度接种，添加地塞米松也能够促进细 胞的快速生长。b i e b a c k 等【3 0 j 通过优化u c b m s c s 的原代分离培养条件，使6 3 的标本可 以培养出形态及免疫表型符合m s c s 的细胞群。其优化条件为：从收集到分离培养的时 间不能超过1 5 d , 时，收集的量不少于3 3 m l ，单核细胞的数量要大于1 x 1 0 8 ，没有凝血或 溶血现象。而迟作华等p l 】通过比较不同的分离方法、接种密度、首次换液时间及不同的 培养基对u c b m s c s 原代培养过程的影响，确定了u c b m s c s 培养的优化条件：羟乙基 淀粉沉淀法优于f i c o l l 分离法，5x 10 m 2 是脐 1 1 1 m s c 培养的适宜接种密度，首次换液时 间为7 天时可使u c b m s c s 的培养成功率达至f j 5 4 5 。到目前为止，通过对u c b m s c s 原代培养条件的改进与优化，可使u c b m s c s 的培养成功率提高到5 0 巧0 。但该培养 成功率仍然不能很好的利用脐带血资源，限制了其在临床上的应用，因此进一步提高 u c b m s c s 的原代培养成功率显得尤为重要【2 9 】。大连理工大学范秀波等人0 2 】在i m d m 添加1 0 f b s 及i l 3 ，g m c s f 使u c b m s c s 的原代培养成功率达到9 0 。 在另一方面，现在对于m s c s 的体外培养大多采用胎牛血清等动物血清，然而培养 体系中添加动物血清，收获的细胞在临床应用是势必会有疾病传播，免疫反应等潜在的 危险【3 3 彤j ，这将进一步限制m s c s 在临床上的应用。因此，有学者提出应用人自体血清 来替代胎牛血清等动物血清。采用人自体血清培养脐带血来源的m s c s 的研究报道尚少， 国内有四川大学的张勇刚等p 6 j 首次成功应用人自体血清培养人脐带血来源的间充质干 细胞，并与胎牛血清培养的细胞做了对比，实验结果表明，人自体血清可以将u c b m s c s 的原代培养成功率提高3 9 7 1 2 ，高于胎牛血清的5 2 8 。 脐带血干细胞的培养与收获 1 3 造血干细胞与间充质干细胞的共培养 1 3 1 临床应用价值 目前，h s c s 已被应用于造血重建、基因治疗、肿瘤净化和免疫治疗等方面1 1 0 3 7 1 ， 尤其是h s c t 已成为癌症患者放化疗后造血功能重建的常规方法。另外，由于m s c s 具 有高度自我更新及多向分化能力，其可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞 【3 1 o 除了以上两种干细胞的单独应用外，h s c s 与m s c s 的联合应用在临床上也逐渐展 露头脚。在h s c t 过程中，联合移植自体m s c s 不仅能够促进造血重建，还能够有效的 降低伴随h s c t 并发症的发病率【3 引。另外，在脐带血中，h s c s 与m s c s 同时存在，在 以往的研究中，原代实验往往只单独培养获取其中一种细胞。如果能在一次原代实验中 同时获得这两种干细胞，并将二者扩增，这不仅是对资源的有效利用，更为以后两种细 胞在临床上的联合应用提供同体细胞。因此，共培养h s c s 和m s c s 具有重要的临床应 用价值。 1 3 2 研究现状及存在的问题 脐带血来源h s c s 与m s c s 的共培养研究，目前报道尚少，本实验室范秀波等1 3 9 】 人，在不添加血清、只添加细胞因子组合( s c f1 5n g m l ，f l5n g m l 一，t p o6n g m l ， i l 一3l5n g m l ，g - c s fln g m l ，g m c s f5n g m l 以) 及a c 胶珠包被基质细胞支持 的条件下，采用微载体与生物反应器相结合的策略，考察了u c b h s c s 与u c b m s c s 在转瓶及旋转壁式生物反应器( r o t a t i n gw a l lv e s s e lb i o r e a c t o r ，r w v b ) 内的共培养。 结果表明，在r w v b 中的扩增效果最佳，1 2 天内n c s 扩增了3 7 0 3 倍：c f u c s 扩 增了5 1 1 2 倍；c d 3 4 十c d 4 5 + c d l 0 5 ( h s c s ) 细胞扩增了5 2 0 4 倍； c d 3 4 c d 4 5 - c d l 0 5 + ( m s c s ) 细胞扩增了1 3 9 1 2 倍。而骨髓来源h s c s 与m s c s 的 共培养研究也处于起步阶段。c h e n 等利用无血清培养基m e y l o c u l t t m ，通过添加高剂量 的细胞因子组合( s c f5 0 n g m l ；i l - 31 0 n g m l 一；i l 61 0 n g m l d ) 在r w v b 内成功的 扩增了骨髓来源的h s c s 和m s c s ，使其分别扩增了8 倍和2 9 倍1 4 0 1 。但是，由于c h e n 等采用的是h s c s 与m s c s 悬浮共培养方式，在h s c s 与m s c s 分离收获时存在一定的 难度。为了解决该问题，我们提出一种新的共培养模式，即将m s c s 贴附在微载体表面 与h s c s 进行悬浮共培养。这种共培养模式的优点在于可以通过自由沉降的方法实现 h s c s 与m s c s 的分离收获。 大连理工大学硕士学位论文 1 3 3 共培养模式 细胞支持h s c s 体外扩增的模式主要分两大类：一类为静态共培养；另一类为动态 共培养。静态共培养又可分为直接接触与间接接触共培养两种模式。动态共培养可以分 为自体悬浮、自体贴壁及异体免疫隔离共培养三种模式。其具体定义如下： ( 1 ) 直接接触共培养：将h s c s 直接接种到经过照射的基质细胞表面1 4 1 1 。 ( 2 ) 间接接触共培养：通过膜材料，如t r a n s w e l l 膜板将h s c s 与基质细胞隔离开1 4 2 j 。 ( 3 ) 自体悬浮共培养：自体基质细胞，如m s c s 与h s c s 动态悬浮共培养m 。 ( 4 ) 自体贴壁共培养：将自体基质细胞，如m s c s 粘附到微载体表面与h s c s 动态悬 浮共培养。 ( 5 ) 异体免疫隔离共培养：利用微胶珠或微胶囊的免疫隔离特性，将异体基质细胞， 如m s c s 包埋在微胶珠或微胶囊内与h s c s 动态悬浮共培荆4 引。 对于h s c s 与m s c s 的共培养，将共培养模式( 4 ) 和有效的反应器类型相结合， 既可以保证自体m s c s 支持h s c s 的体外扩增，同时也可保证养料的充分共给，培养过 程中可以很好的保证h s c s 与m s c s 的同步体外扩增。 然而，h s c s 和m s c s 分别具有悬浮生长和贴壁生长的生物学特性，体外必须同时 提供悬浮培养环境与动态贴附表面，才有可能在模拟体内微环境的条件下实现h s c s 和 m s c s 的共培养。微载体与适宜生物反应器相结合是解决此问题的可行方法。 1 3 4 共培养体系 细胞体外培养模式一般分为两大类：静态培养体系和反应器培养体系峭j 。静态培养 体系主要指t 形瓶、孔板和培养皿，如图1 2 所示；反应器培养体系主要包括转瓶、 r w v b 、灌注式生物反应器、气升式生物反应器和固定床生物反应器，如图1 3 所示【8 ， 4 4 - 4 6 o ( 1 ) 静置培养 包括多孔培养板、培养皿以及各种规格的组织培养瓶，非常适宜造血细胞的实验研 究与探索，而且培养基与试剂用量也比较节省。虽然静态培养体系已被广泛的应用到细 胞培养方面，但是仍然存在一些缺点【4 7 】：1 ) 培养液缺乏有效混合而导致细胞因子等营 养成分、溶解氧、p h 以及代谢产物等物质在培养基中形成浓度梯度；2 ) 静态培养系统 的各种参数一般都难以在线监测和控制；3 ) 需要人工换液等操作并增加受污染的危险 性；4 ) 二维静态培养远离人体内的三维生长环境，在一定程度上易造成千祖细胞的分 化。因此，需要发展适宜的三维动态共培养体系，即生物反应器，来改善培养环境和条 件以制备出数量和质量均有保证的造血干祖细胞。 脐带血干细胞的培养与收获 图1 2 静态培养装置 ( a ) 6 孔板；( b ) 9 6 孔板；( c ) t 形瓶；( d ) 培养皿 f i g 1 2 d e v i c e so f s t a t i c c u l t u r es y s t e m a ) 6 w e l lp l a t e ：( b ) 9 6 w e l l p l a t e ；( c ) t - f l a s k ：( d ) d i s h ( 2 ) 生物反应器：在生物反应器中动态培养c b h s p c s 。 动态培养系统能提供均一的环境，在取样、数据采集和培养条件控制等方面都优于 静态培养。整个装置可以自动化，全封闭系统可以减少或避免污染，节约人力和空间， 同时也能够保证培养条件的相对稳定，易于放大、细胞收获方便、细胞培养环境易于控 制、检测和优化等特点。 干细胞扩增所需的生物反应器技术与传统的动物细胞培养有很多不同，传统的动物 细胞培养的目的是生产蛋白或病毒等生物制品，对细胞的纯度和分化程度等要求不高， 而扩增干细胞时细胞本身是目的产物，既需要保持其多向分化潜能等特点，又对细胞纯 度和致瘤性等临床移植的安全性有更高的要求，因此，不能照搬传统的生物反应器技术， 而应该研究适宜于干细胞扩增的新培养模式。 目前已应用到造血干细胞扩增的生物反应器主要有：灌注式，固定床式，搅拌式， 气升式和中空纤维膜式以及旋转壁式生物反应器等。v a n z a n t 等人在1 9 9 4 年应用连续灌 注培养方式，对脐带血和外周血来源的造血干细胞进行了扩增研究，1 4 天时总细胞、 c f u g m 和l t c - i c 细胞分别扩增t s 0 、8 0 和2 0 倍嗍。灌注式反应器中作用在造血细胞上 的剪切流动会对细胞造成一定程度的损伤，另外，由于培养基的持续灌注，大部分随培 大连理工大学硕士学位论文 养基一起流动的造血细胞无法与静止的基质细胞保持近距离接触，从而影响了扩增效 果。 1 9 9 9 年m e i s s n e r 和b i s e l l i 掣4 5 1 人应用固定床和流化床，以多孔玻璃珠为床层载体， 将入骨髓来源的基质细胞或小鼠的基质细胞系m 2 1 0 8 4 固定化在载体上，与人的脐带血 和外周血来源的造血干细胞进行了直接共培养研究。结果表明，流化床的扩增效果很差， 造血祖细胞数量持续降低，固定床能维持或使造血干祖细胞有一定增加。1 9 9 8 年k i m 应 用s p i n n e r 搅拌式生物反应器对人骨髓来源的造血干祖细胞进行了扩增研究，在添加基 质细胞条件培养基和若干生长因子的条件下，总细胞数和c f u g m 细胞数可以分别增加 3 倍和1 7 倍【4 9 】。华东理工大学的夏泉鸣，谭文松等人【5 0 j 也在转瓶内扩增了人脐g i t c d 3 4 + 富集细胞，发现转瓶内的c d 3 4 + 细胞的扩增情况要好于孔板内的细胞。李群良，谭文松等 人还研究了脐血细胞在搅拌悬浮生物反应器中的生长特性，为开发搅拌悬浮生物反应器 大规模生产造血细胞提供实验依据。本实验室刘洋等【1 6 j 贝0 应用旋转壁式生物反应器使脐 带血来源的单核细胞、c d 3 4 + 细胞及c f u g m 细胞在2 0 0 d , 时内分别扩增了4 3 5 5 士8 7 6 倍、3 2 7 a ：1 5 6 倍和2 1 7 士4 9 倍。该反应器的扩增效果远远好于t f l a s k 。 1 4 微载体 1 4 1 微载体技术 从上面的分析可以看出，动态培养具有其特有的一系列的优缺点，不太适合黏附细 胞的大规模培养。为了克服反应器的缺点，1 9 6 7 年v a nw e z e l 等【7 】提出了用 d e a e s e p h a d e xa 5 0 作为微载体( m i c r o c a r r i e r ) 进行动物细胞培养的技术。这样锚地 依赖性的细胞既能贴附在微载体的固体表面进行生长，又可将已贴附细胞的微载体投入 到大规模培养用的生物反应器中。 1 9 7 7 年l e v i n e 等【5 l j 报道，在d e a e s e p h a d e x 的表面电荷密度合适时，动物细胞 可能生长在高浓度的微载体上。自此，微载体培养技术作为锚地依赖型细胞培养的有效 手段得到了迅速发展。 脐带血干细胞的培养与收获 图1 3 反应器培养体系示意“4 5 1 a ： 转瓶；b ：旋转壁式生物反应器；c ：固定床生物反应器： d ：气升式生物反应器；e ：灌注式生物反应器；f ：灌注式生物反应器的灌注沟槽 a ：s p i r m e r f l a s k ；b ：r o t a t i n g w a l l v e s s e l ；c ：f i x e db e db i o r e a c t o f ：, d ：a i r - l i f t b i o r e a c t o r ；, e ：p e r f u s i o n b i o r e 黜t o r , f ：p e r f u s i o n g l d o v e o f p e r f u s i o n b i o r e a c m r 大连理工大学硕士学位论文 1 4 2 微载体定义 微载体是指直径在6 0 2 5 0 p a n ，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚 糖或者各种合成的聚合物组成。自v a nw e z e l 用d e a e s e p h a d e xa5 0 研制的第一种微 载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上( 如表1 1 所示 1 5 2 ) ，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、p h e m a 微载体、甲壳质 微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体 有三种：c y t o d e x l 、2 、3 ，c y t o p o r e 和c y t o l i n e 。 微载体在应用上有如下优点：表面积体积( s ) 大，因而单位体积培养液的 细胞产率高：一克的微载体可以提供1 5 倍于7 5 c m 2 培养瓶培养面积的表面积1 5 2 1 。；由 于采用均匀悬浮培养，把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，建有两种培养方式的优点； 可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；培养基利用率高：由于微载 体的表面积体积大，微载体培养体系就可以有效地节约培养基用量以及细胞因子、血清 等昂贵的添加物；放大容易，国外已有公司以1 0 0 0 l 规模培养人的二倍体细胞来生 产b 干扰素；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；培养系统占地面积和空间 小；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好。 1 4 3 微载体的培养原理 微载体技术的原理是将对细胞无害的颗粒，即微载体加入到培养容器的培养液中， 作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状 态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个 阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺 展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主 要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。 由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。 因此，微载体的密度应该略高于培养基的密度( 1 0 2 ：g c m 3 1 1 0g c m 3 ) ，从而保证轻微 的扰动就可以使微载体悬浮。