组培常见问题.doc

植物组培过程中污染产生的原因及防治措施一、 污染的原因 污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。组织培养中污染是经常发生的，常见的污染病原是细菌和真菌两大类。细菌污染常在接种1-2d后表现，培养基表面出现黏液状菌斑。真菌污染一般在接种后3d以后才表现，主要症状时培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层。 造成污染的原因也很多，主要有 (1) 培养基及各种使用器具灭菌不彻底 (2) 外植体消毒不彻底 (3) 接种时不严格无菌操作 (4) 接种和培养环境不清洁 (5) 培养容器原因，包括盖子和封口膜等。二、 材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染，操作人员不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染。2 污染的预防措施 2.1灭菌要彻底 在组培生产中，各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121-123条件下灭菌20-30min。若出现灭菌时间不足或温度不够，培养一段时间后就会在培养基表面产生细菌性的污染。一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。 2.2环境消毒 不清洁的环境也会使培养的污染率明显增加，尤其是在夏季，高温高湿条件下污染率更高。接种和培养环境要保持清洁，定期进行熏蒸或喷雾消毒。高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好，但对人体有一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次。平时读接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2%来苏尔消毒。臭氧消毒机对环境消毒效果较好，而且使用灵活方便，对人体的伤害也相对较小。 2.3严格无菌操作 在接种时要严格无菌操作，避免人为因素造成污染。为了使超净工作台有效工作，防止操作区域本身带菌，要定期读一过滤器进行清洗和更换。对内部的过滤器，不必经常更换，但每隔一定时间要检测操作区的带菌量，如果发现过滤器失败，则要整块更换。此外还需要测定操作区的风速，通过调压旋钮使操作区的风速达到无菌操作需要的20-30m/min。植物组培过程中培养物的玻璃化及其防治方法 当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，苗体趋于透明，其茎、叶表面无蜡质，这种现象通常称为玻璃化。玻璃化为组培苗的生理失调症，它的出现会使组培苗生长 缓慢、繁殖系数有所下降，玻璃化的嫩茎不宜诱导生根。 1 导致玻璃化的主要因素： 材料差异，在不同的种类、品种间，组培苗的玻璃化程度有所差异。 激素水平过高,若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，易引起玻璃化现象。 培养基水势，培养基中离子种类,比例不适。 环境温度、光照强度和通气性。温度过低或过高,光照时间强度不足及培养容器中空气湿度过高，透气性较差所造成的通气不良,易造成组培苗含水量高,从而发生玻璃化现象。 琼脂浓度降低、有杂质等。 2 常用的防治措施有 增加光照强度和光照时数。 降低细胞分裂素含量。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落 酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生 增大培养基中琼脂的含量，以降低培养基的水势 降低NH4+浓度，减少培养基中含氮化合物的用量 增加容器通风，最好进行 CO2施肥，这对减轻组培苗玻璃化的现象有明显的作用； 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻组培苗玻璃化的现象发生；组培苗瘦弱或徒长的防治措施正常的组培苗应当叶色浓绿、植株粗壮。如果在增殖阶段出现芽苗瘦弱、徒长或节间过长，这种苗转入生根培养时能够生根，在环境条件较好的情况下，也会稍转粗壮，但总体看来，苗的株型、叶色、叶片大小等性状还是差于生长正常的增殖苗；有时即便是正常或健壮的增殖苗，若生根阶段培养基不适宜或培养的环境条件得不到保障，往往根原基及根还未形成，就很快表现出小苗徒长，节间明显伸长，叶片变细、变薄、变嫩并出现黄化。这样的苗进行过渡培养时，会出现萎蔫和烂根，很容易死亡，过渡成活率极低。 对组培苗瘦弱的原因分析如下。 (1)细胞分裂素浓度过高，产生了过多的不定芽，这些密集的芽若不及时进行转移和分切，很快就开始变成瘦弱苗。 (2)温度过高，高温有利于苗的生长，多数品种适宜的温度是25左右，在过高的温度条件下，苗木的伸长速度快，叶片变薄、变长。 (3)光照不足，组培苗会变黄、变弱、变细并加速生长，使苗在短时间内变得更瘦弱。 (4)培养基水分过多，在琼脂含量不足会引起植株徒长变弱。 (5)通气不良，在使用不透气膜时，会增加瓶内湿度，从而使苗表现嫩弱。 以上因素同时出现时，对苗的不良影响明显大于单一因素，各个因素之间相互促进又相互制约。因此控制瘦弱苗，培养粗壮苗应通过多个因素共同调节才可能获得理想的效果。 减少和避免徒长和瘦弱苗的产生，可从以下几个方面考虑。 (1)根据品种特点减少细胞分裂素用量，加速继代转瓶的速度，适当降低接种密度。 (2)利用空调降低培养室温度。(3)提高光照强度和延长光照时间，充分利用较强的自然光做光源，调整摆放位置和密度。(4)调整培养基硬度，改用透气膜做封口，进行培养基及环境因子的综合调控，力求获得最优质健壮的组培瓶苗。植物组织培养技术原理之灭菌方法常用的灭菌方法： 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。1、湿热灭菌（培养基） 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在o1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到01MPa时压力01-015MPa，20min。对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。防止高压灭菌培养基变化的方法：(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时采取有效措施。(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。 2、灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3、紫外线和熏蒸灭菌（空间）(1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。(2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按58mlm3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。4、喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。褐变和玻璃化1、初代培养外植体的褐变外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。 褐变的主要原因:植物品种:研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异。生理状态:由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。培养基成分：浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。培养条件不当：如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。减轻褐变现象发生的方法选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。连续转移 对容易褐变的材料可间隔1224h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。 2、继代培养时材料的玻璃化实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；减少培养基中含氮化合物的用量；增加光照；增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。组培苗瘦弱或徒长的防治措施正常的组培苗应当叶色浓绿、植株粗壮。如果在增殖阶段出现芽苗瘦弱、徒长或节间过长，这种苗转入生根培养时能够生根，在环境条件较好的情况下，也会稍转粗壮，但总体看来，苗的株型、叶色、叶片大小等性状还是差于生长正常的增殖苗；有时即便是正常或健壮的增殖苗，若生根阶段培养基不适宜或培养的环境条件得不到保障，往往根原基及根还未形成，就很快表现出小苗徒长，节间明显伸长，叶片变细、变薄、变嫩并出现黄化。这样的苗进行过渡培养时，会出现萎蔫和烂根，很容易死亡，过渡成活率极低。对组培苗瘦弱的原因分析如下。(1)细胞分裂素浓度过高，产生了过多的不定芽，这些密集的芽若不及时进行转移和分切，很快就开始变成瘦弱苗。(2)温度过高，高温有利于苗的生长，多数品种适宜的温度是25左右，在过高的温度条件下，苗木的伸长速度快，对于一些有节间的品种如香石竹、满天星、菊花等，组培苗会变得特别瘦弱。对一些无节间种类如非洲菊、勿忘我、情人草等的影响相对小一些，主要是叶片变薄、变长。(3)光照不足，组培苗会变黄、变弱、变细并加速生长，使苗在短时间内变得更瘦弱。(4)培养基水分过