毕业论文--冷胁迫条件下不同玉米自交系miR398基因靶基因表达研究.docx

目 录中 文 摘 要IAbstractII第一章文献综述1第一节 低温冷害的类型及其影响1第二节miRNA研究价值22.1研究现状2第三节 miR398简介33.1 miR398的发现33.2 miR398的靶基因33.3 miR398与逆境胁迫3第四节qRT-PCR简介44.1技术方法简介44.2应用5第五节 本研究的目的和意义5第二章 冷胁迫条件下RNA提取检测7第一节 材料与方法71.1 试验材料71.2 试剂配制71.3 试验方法8第二节 实验结果10第三章 冷处理差异表达miR398及其靶基因的验证分析11第一节 材料与方法111.1 miR398 的 qRT-PCR111.2 靶基因的 qRT-PCR12第二节 实验结果14第三节 结论15全 文 结 论16致 谢17参 考 文 献18中 文 摘 要玉米, 禾本科玉米属植物,为世界最主要的粮食作物和饲料作物，同时也是全世界总产量最高的农作物。我国玉米的主产区位于东北地区，同时玉米也是东北种植面积最大的作物。基于地理位置等因素，影响东北玉米产量最大的非生物胁迫是冷胁迫。所以，进行关于玉米冷响应机理的分析和研究非常必要。MicroRNA(miRNA)是由2124个核苷酸组成，由内源基因编码的非编码单链小分子RNA。miRNA对靶基因mRNA的作用方式主要有：一、切断靶基因的mRNA分子；二、抑制靶基因的翻译；三、结合抑制结合以上两种形式。通过以上的方式对靶基因的表达水平负调控，参与到转录后基因的表达中去，借此对植物的生长发育进行调控, 同时当受到外界胁迫时，会通过改变表达进而调节植物体内的多种逆境胁迫应答。本研究通过对两个玉米自交系中miR398及其靶基因的表达情况进行比较分析，从而对miR398在植物受到冷胁迫下的表达调控进行研究分析。为阐释苗期玉米miR398调控的抗冷分子机理打下良好的基础。关键词：玉米；非生物胁迫；miR398；基因表达调控；胁迫应答；冷响应机制AbstractMaize ,one of the worlds three major food crops, its production on the worlds food supply has an important impact. Northeast China is the main producing area of maize in China, and it is one of the largest abalone crops. Cold stress is one of the main abiotic stresses to limit maize yield in Northeast China. Therefore, it is very important to study the mechanism of cold response to maize. MicroRNA (miRNA) is a recently discovered small molecule RNA with a length of 21 to 24 nucleotides of non-coding proteins. It acts as a novel regulatory gene for the expression of small RNAs, which are involved in the regulation of plant growth and development by controlling the expression of the target gene at the post-transcriptional level by transcription or translation of the target mRNA. Induced expression changes in the plant a variety of stress response to the process of play an important regulatory role.The miR398 gene expression in cold maize was studied by comparing the miR398 gene in two maize inbred lines, which laid a good foundation for elucidating the molecular mechanism of miR398 regulation in maize.Keyword: Maize ; Abiotic stress; miR398; gene expression regulation; stress response; cold response mechanism20第一章 文献综述低温、干旱、盐碱、矿物质缺乏等是日常生产作业中对植物生长发育以及作物产量造成影响最大的非生物胁迫。日常生活中的众多重要的作物，好比玉米、水稻、大豆和甘蔗等，大多抗冷性差，易受冷胁迫危害。在它们长期的进化过程中,产生了多种抗胁迫机制,涉及到许多代谢过程以及生理和分子水平的表达调控, 其中胁迫应答基因在转录水平与转录后水平的表达尤为重要1。MicroRNA(miRNA)通过切断靶基因的mRNA分子，抑制靶基因的翻译，或者以上两种, 进而对靶基因的表达进行水平负调控，从而参与到转录后基因的表达中，对植物的生长发育进行调控。在受到外界胁迫时，还可以通过改变表达进而参与植物体内的多种逆境胁迫应答过程。东北是我国玉米的主要生产地区，基于地理位置等因素的影响，在每年的春季都会由于低温冷害的影响，导致大面积的产量降低，在低温冷害特别严重的年份，产量甚至降低高达20。由于外界环境影响，玉米产量波动较大，严重影响了玉米的高产稳产，同时使得玉米的品质也下降很多。由于目前对玉米需求量持续增长，选育出稳定高产的玉米品种，对于国家粮食安全问题具有十分重要。因此对于玉米冷响应机制的研究非常重要而且迫切。miR398在进化的过程中高度保守,因此适合于用来研究其表达机制。研究表明miR398的靶基因是两种Cu/Zn过氧化物歧化酶: 细胞质CSD1、叶绿体CSD2。miR398在多种逆境胁迫响应中的调控功能已得到广泛研究, 其在调节植物铜代谢平衡, 应答过量的铜、铁、镉等重金属胁迫, 蔗糖、臭氧、盐害等其他非生物胁迫, 以及病原菌生物胁迫中均扮演重要角色2。研究冷胁迫条件下不同玉米自交系miR398基因靶基因表达，可用于有效的筛选出抗冷能力强的玉米品种。第一节 低温冷害的类型及其影响 低温冷害 (low temperature, chilling or cold damage) 是主要影响我国东北地区玉米产量的灾害之一，指的是0以上（一般低于20）低温对作物的损害，简称为冷害。指的是当农作物所处环境温度降到生长发育时期所能够忍受的最低温度以下时，作物生理活动受到障碍，严重时生殖器官出现损害，从而导致农作物产量下降的现象。冷害主要存在两种分类方式，一种分类方式是依据在农业气象学中，对农作物的危害的特点划分，分为：一、延迟型。作物生长发育时期受到较长时间的低温侵害，植株生理活性降低引起作物生育期显著延迟，使得作物不能正常按时成熟，导致产量降低。二、障碍型。作物在生殖生长阶段，主要是指作物在孕穗期和抽穗开花期，遇短时间低温,生殖器官的生理机能被破坏而减产3。三、混合型。延迟型和障碍型同年度发生，比单一冷害造成更严重的危害。另一种分类方式则是从灾害角度将冷害分为三种类型：春季低温冷害、秋季低温冷害、东北夏季低温冷害。 在我国东北地区，农作物低温冷害是主要的农业气象灾害之一。东北地区是我国重要的玉米生产基地之一，由于地理位置等因素，该地区农业气候上容易遭受低温冷害，经常出现玉米延迟性低温冷害的现象，导致高温年增产，低温年降产，产量波动较大。一些严重低温的年份甚至会同时造成玉米品质的下降。第二节miRNA研究价值MicroRNA（miRNA），一类负转录后调节因子，已在植物中得到深入研究。目前已经通过实验克隆或计算方法数千种植物miRNA得到鉴定。这些小的非编码RNA由2024个核苷酸组成，由具有独特茎环结构的前体产生。已经证明植物miRNA调节参与多种发育过程（例如生长素信号的传导及RNA代谢和根、茎、叶等器官的生长发育）的许多基。此外，许多miRNA参与到植物对不同环境因素的胁迫应答中。越来越多的研究人员更加关注那些涉及胁迫的作物的miRNA及其在胁迫应答中的机理以及发挥的作用。因此，对于涉及胁迫应答miRNA的鉴定非常重要，特别是对于作物育种来说。2.1研究现状miRNA是生物体内一类重要的小分子RNA，自从首次在线虫中发现miRNA以来，迄今为止miRNA的研究已经取得了飞速的发展，目前研究已明确了miRNA在调控植物生长发育、激素信号转导、响应逆境胁迫、细胞程序性死亡以及新陈代谢等方面起着非常重要的作用，但对其具体作用机制的研究及报道还相当有限，尤其是miRNA在植物响应多种逆境胁迫中的作用途径的报道还较少。目前，研究miRNA如何实现对自身及其靶基因的调控，并揭示其作用机制，阐明miRNA在植物生长发育，尤其是抵御逆境胁迫等过程中的调控机理，已成为重要的研究方向。目前我们已经通过分子生物学的研究对特定植物中miRNA的种类和数量，少数miRNA与其靶基因之间的作用机制有了一定的了解。但是对于整miRNA研究领域仍然有太多的未知等待我们去学习。其中关于miR398的研究需要更进一步的深入和深化研究。第三节 miR398简介3.1 miR398的发现通过实验研究，Sunkar等人在多种逆境胁迫下构建出拟南芥的miRNA文库, 之后Jones- Rhoades和Bartel通过比较基因组学的方法发现miR398具有高度的保守性4。预示miR398可能在各种生物体中的逆境胁迫应答中起着不可忽视的重要作用。3.2 miR398的靶基因miR398的靶基因为两种Cu/Zn过氧化物歧化酶(CSD): 细胞质CSD1和叶绿体CSD2。miR398与其靶基因在不同植物中都具有着高度的保守性，表明 miR398及其靶基因对于植物在不利于自身生长发育的环境下的胁迫应答过程中起到重要的作用。3.3 miR398与逆境胁迫植物通过过量或者低量表达miRNA来对其靶基因进行负调控，从而使得植物在逆境胁迫下对外界环境做出应答。低温、干旱、盐碱、矿物质缺乏等逆境胁迫，会导致ROS在植物体内快速的产生，并且大量累积。而生物体中最主要的超化物歧化酶CSD则通过将有害的超氧自由基转化为过氧化氢,从而消除了生物体内的超氧自由基，减轻逆境下生物体受到的危害。Sunkar等发现, miR398在强光照、甲基紫精(Methyl viologen, MV)作用下表达受到抑制, CSD1、CSD2 mRNA转录上升。甲基紫精结合到叶绿体类囊体膜上, 将电子转移到O2, 在光下引发超氧自由基的持续产生。 Jagadeeswaran等报道臭氧、盐害等非生物胁迫下miR398表达下调。臭氧抑制miR398的表达, 臭氧胁迫去除后miR398水平逐渐恢复正常。但是, 不同于重金属胁迫下CSD1和CSD2均受到miR398的转录负调控, 臭氧、盐害胁迫下仅CSD1受到miR398的负调控。臭氧、盐害胁迫下miR398表达下调, CSD2表达也受抑制。这表明不同胁迫下CSD2的表达并不严格受到miR398的调控, 可能存在其他的调节机制。总之, 拟南芥中miR398的表达受到多种非生物逆境胁迫的诱导, 进而调控其靶标CSD表达, 揭示出miR398在逆境胁迫应答网络中的重要地位。第四节qRT-PCR简介实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 4.1技术方法简介 同位素标记法：借助同位素原子以研究有机反应历程的方法。可用于追踪物质的运行和变化规律，即用示踪元素标记的化合物，其化学性质不变，科学家通过追踪示踪元素标记的化合物，可以弄清化学反应的详细过程。具有灵敏度高、方法简便、定位定量准确、符合生理条件等特点。RNA试剂盒提取RNA：用于各种植物、动物、微生物的RNA提取，在每个试剂盒里都有一份说明使用说明书。实验者只需要按照说明书上的步骤操作即可。使用时无需配制其它试剂，非常方便，适合于RNA的快速提取。所提取的RNA完整性好、纯度高，可用于分子生物学后实验。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。PCR：PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 4.2应用 荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因定量检测,还能 准确定量疾病相关基因的表达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面.它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具体的试验选择合适的定量方式,从而得到更准确的试验结果。第五节 本研究的目的和意义miRNA是生物体内一类重要的非编码小分子RNA，自从在线虫中首次发现miRNA以来，迄今为止关于miRNA的研究已经取得了飞速的发展，研究表明miRNA几乎调控着植物体内种种代谢过程，包括植物生长发育、细胞分裂分化、激素信号转导以及逆境胁迫应答。研究miRNA及其靶基因的作用机制，阐明在植物生长发育，尤其是逆境胁迫应答过程中，miRNA所起到的调控作用，已经成为十分重要的研究方向。作为参与逆境胁迫应答miRNA的代表，miR398是目前研究已经比较透彻的miRNA。本研究通过对冷胁迫条件下不同玉米自交系miR398基因靶基因表达研究，从而进一步的了解miRNA在植物在非生物胁迫中的反应机制，进而有效的选育出稳定高产的玉米优质品种。第二章 冷胁迫条件下RNA提取检测目前，研究人员已经完成了对多种玉米miRNA的测序工作。但是，关于冷胁迫条件下玉米的 miRNA表达情况的研究一直没有进行。由于 miR398在玉米冷胁迫应答过程中有着十分重要的作用，本实验种植不同玉米自交系，并提取检测它们的RNA。第一节 材料与方法 1.1 试验材料具有耐冷性质的玉米自交系W9816 和作为对照的B73。 1.2 试剂配制异硫氰酸胍变性液： 贮存液：量取0.75mol/L柠檬酸钠(pH为7.0) 17.6 mL, 10% N-十二烷基肌氨酸 26.4 mL，混合后向其中加入经DEPC处理过的水484mL，之后加入异硫氰酸胍250g，加热到62左右，过程中为使其充分溶解应一直搅拌。室温下保存贮存液，最久不超过三个月。工作液：将0.35 mL 2-ME加入到50 mL贮存液中。（室温下保存，时间不超过 1 个月）。工作液中各成分的最终浓度为：异硫氰酸胍4mol/L、柠檬酸钠 （pH为7.0） 25mol/L、N-十二烷基肌氨酸 0.5%、巯基乙醇 (2-ME) 0.1mol/L其它溶液： 乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0) 2mol/L水饱和酚 (pH 3.5) 异戊醇49:1异丙醇(浓度100%)乙醇 (浓度70%，配制所使用的水需经DEPC处理) 水（经DEPC处理后高压灭菌）1.3 试验方法 1.3.1 试验材料种植及处理 先将玉米种子用蒸馏水浸泡 24 小时，后种在营养钵（基质草炭土：蛭石：珍珠岩比例 10:1:1）中。在人工气候箱中，生长至三叶一心期，设置温度 25/22 (日间/夜间)，相对湿度 60%/70% (日间/夜间)，光周期为日间16小时夜间8小时，光强度设置为450 mol m2 s1。之后在4环境下低温处理12小时。1.3.2 RNA 提取 1在液氮环境中，用研钵将0.5g新鲜玉米幼苗组织，快速的研磨成均匀而细致的粉末状颗粒。 2在冰中预冷离心管，向离心管中装入所得的全部粉末，将异硫氰酸胍变性液5 mL加入到离心管中，过程中缓缓摇晃离心管，使混合过程充分均匀。 3先向离心管中加入 2mol/l NaAc 0.5 mL，然后加入水饱和苯酚 5 mL，最后加入氯仿1 mL，边加试剂边缓缓摇动离心管，使其充分混匀。盖紧离心管后，连续缓缓倒转多次直至充分混合均匀，之后冰浴 15分钟。 4在4条件下 15000g 高速离心 15分钟，用另一干净的离心管装入离心得到的上层水相，向其中加入异丙醇（量与水相体积相等），混合均匀之后，在零下20冰箱冷冻1小时。 5在4条件下 13000g 高速离心 15分钟，用移液枪小心吸去上层清液，把沉淀溶于体积1.5mL异硫酸胍变型液中，再向其中加入等体积的异丙醇，混合均匀后放在零下20的冰箱中冷冻 1小时。 6在4条件下 13000g 高速离心 10分钟，用70%乙醇洗涤沉淀，晾干之后，每50g沉淀加入100l经过DEPC 处理后的水进行溶解，完成检测后，在零下70低温条件下保存。1.3.3 RNA 质量检测 需要对提取到RNA进行关于质量以及数量的检测。本实验利用电泳检测方法来检测 RNA 样品的性质，以确保使用合格的样品进行测序。变性琼脂糖凝胶电泳检测：所需试剂： 1.MOPS 缓冲液 (10) : 用适量的经DEPC 处理的水溶解 6.8g NaAc，再往其中加入41.86g MOPS，最后加入3.72g EDTA（DEPC处理水溶解），混合均匀后用 2mol/L 的 NaOH 将pH调节至7.0，最后定容到 1L，过滤灭菌之后，在避光条件下保存。 2.上样缓冲液：0.4%溴酚蓝，50%甘油，EDTA 1mmol/L， 0.4%二甲苯蓝 3.其它试剂：甲醛 (37%溶液，13.3mol/L)、去离子甲酰胺、溴化乙锭 (10mg/ mL) 、75%乙醇 试验步骤： 1用 75%乙醇将实验制胶所需的用具都冲洗一遍后晾干。 2制备琼脂糖凝胶：向洁净的烧瓶中加入0.5g琼脂糖，然后加入蒸馏水40 mL，在微波炉内加热溶化完全。 3待胶冷却至 65左右时，先向其中加入甲醛9 mL，然后加入10MOPS 缓冲液5 mL以及溴化乙锭0.5l，混匀后立即进行灌胶 (应注意避免气泡的产生)。 4制备样品：将500l 小离心管用DEPC 处理，向其中依次加入 10MOPS 缓冲液 2l、甲醛 3.5l、去离子甲酰胺10l、RNA 样品 4.5l，混匀；在60水浴中保温离心管10分钟，之后放在冰上降温两分钟；之后向每管中加入3l的上样所用的染料，混合均匀。 5上样步骤：凝胶制备好后，让凝胶的上样孔的一侧靠近阴极，缓缓的放在电泳槽中，之后缓缓加入1MOPS 缓冲液，液面高于胶面 1mm左右，最后小心翼翼的将梳子缓缓拔出，时刻注意要保持样品孔完好。向加样孔中用移液器加入30l左右制备好的样品。6电泳流程：盖上电泳槽，连通电源，上样孔一侧接负极，电压设置为7.5V/ mL，电泳两个小时，凝胶底部出现溴酚蓝时，关闭电源，停止电泳。电泳结束后，可用紫外灯对结果进行检测。第二节 实验结果通过电泳检测，可以看到三条清晰条带，长度依次是 28s, 18s, 5s 。可以得知所得的RNA片段比较完整没有降解。图2.1测序样品总RNA电泳图 M： DL2000 Marker，从左到右依次是8个样品第三章 冷处理差异表达miR398及其靶基因的验证分析为确认miR398的测序结果，以及对其靶基因的表达情况进行分析。本研究qRT-PCR 对miR398 和通过生物信息学的方法预测得到的靶基因GRMZM2G058522进行验证。第一节 材料与方法 1.1 miR398 的 qRT-PCR 反转录引物使用 mi R398 特异的茎环反转录引物。反转录引物的设计参考 Varkonyi-Gasic等人的方法。荧光定量的上游引物为 mi R398特异的引物，设计方法详见 Varkonyi-Gasic等人的方法，下游引物为位于茎环 引 物 内 部 的 通 用引物(universal reverse primer ，URP) ，其序列为：GTGCAGGGTCCGAGGT。1. 反转录反应液 (1)按照下表中的成分比例对反转录所需反应液进行配制（在冰上完成）：组分体积终浓度5M-MLV 缓冲液2 LmiRNA特定的茎环结构反转录引物 (10 M)1 LdNTP 混合液 (每种10 mM)0.5 LRNA 模板-1 L0.4 gRNase抑制剂(40 U/L)0.2 LRTase M-MLV (RNase H-)(200 U/L)0.3L不含RNase的 dd H2O加至 10 L(2) 反转录程序过程： 保温在 16C 环境中30 分钟，让miRNA 和茎环引物结合充分,后再执行脉冲式的反转录程序，程序流程设定为30C 30秒，42C 30秒，50C 1秒，循环60次。最后使反转录酶失活（85C下处理5 分钟）。 2. 实时荧光定量 PCR(1) 按照下列组分配制PCR反应液组分体积最终浓度SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNase H Plus) (2)10 L1PCR的正向引物(10 M)0.8 L0.4 MPCR的反向引物(10 M)0.8 L0.4 MROX Reference Dye II (50)0.4 L逆转录反应液0.5 Ldd H2O（灭菌处理） 7 L总计20 L(2) Real Time PCR反应 进行两步法PCR扩增：第一步：在95环境下处理30秒进行预变性处理。反应进行一次。第二步：在 95环境下处理5秒，60环境下处理34秒进行PCR反应。反应进行40次。第三步：在 95环境下处理15秒，在 60环境下处理60秒，最后在 95环境下处理15秒进行融解曲线的分析。反应进行一次。 3. 实验结果处理 在反应结束后，分析处理Real Time PCR的扩增曲线，同时确认其融解曲线，同时制作标准曲线对PCR进行定量分析。 1.2 靶基因的 qRT-PCR 1. 去除基因组 DNA反应 (1) 配制反应混合液（在冰上完成）：取2 uL的 5gDNA Eraser Buffer，再加入1 uL的gDNA Eraser，之后加入1 uL的Total RNA，最后加入不含RNase的dH2O加至10uL。(2)室温下温育5 分钟，若不直接用在下一步反应中则保存在4环境下。2. 反转录反应流程 (1) 在冰上进行反应液配制过程。完成后分装到每个反应管中，每个装入10 L。摇晃混匀后，立即进行反转录反应。 组分体积Prime Script RT Enzyme Mix I1 LMaster Mix 10L步骤 1 配置的反应液10 L逆转录引物混合液1 L5Prime Script Buffer 2 (for Real Time)4 L不含RNase的dH2O4 L总计20 L(2) 在37温育15 分钟，进行反转录反应，然后在85下保温5秒使反转录酶失去活性。反转录所得的产物储存在 4环境下。3. 实时荧光定量 PCR (1) 按照下列组分配制 PCR 反应液组分体积终浓度SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNase H Plus) (2)10 L1PCR 的正向引物 (10 M)0.8 L0.4 MPCR 的反向引物 (10 M)0.8 L0.4 MROX Reference Dye II (50)0.4 L逆转录反应液1 LdH2O（经灭菌处理）定容至20L(2) Real Time PCR反应：进行两步法PCR扩增：第一步：在95环境下处理30秒进行预变性处理。反应进行一次。第二步：在 95环境下处理5秒，60环境下处理34秒进行PCR反应。反应进行40次。第三步：在 95环境下处理15秒，在 60环境下处理60秒，最后在 95环境下处理15秒进行融解曲线的分析。反应进行一次。4. 实验结果处理 在反应结束后，分析处理Real Time PCR的扩增曲线，同时确认其融解曲线，同时制作标准曲线对PCR进行定量分析。 第二节 实验结果冷处理条件下miR398及其靶基因表达情况 qRT-PCR分析图3.1 miR398及其靶基因冷胁迫条件下表达情况分析zma-miR398a-3p在冷处理后上调表达，其靶基因GRMZM2G058522的表达量降低。第三节 结论结果发现冷处理后，B73和W9816的miR398的表达均上升，且对照组B73的上升更为明显；而miR398的靶基因GRMZM2G058522的表达均下调，且在具有抗冷特性的W9816中下调变化不明显一些。可知两种玉米自交系在相应短期冷胁迫时的表现有所不同。玉米中miR398的靶基因预测结果GRMZM2G058522，它的注释是SOD9。在拟南芥中的miR398的靶基因是两个Cu/Zn超氧化物歧化酶胞质：细胞质CSD1以及叶绿体CSD2。当拟南芥受到来自外界的氧化胁迫的时候，CSD1 以及CSD2两者的表达量均上调。而miR398的表达则因为氧化胁迫而下调，其表达量的降低对CSD1和CSD2的转录出的物质的积累有着十分重要的作用，从而进一步的影响到植物的氧化胁迫应答过程，对植物的抗氧化胁迫非常的重要。在遭受到外界的冷胁迫的时候，miR398的表达的情况比较复杂而且变化较多，不同的研究材料和研究方法，出来的结果也会不同。例如有研究表明在对小麦的4低温环境处理和拟南芥16处理时，miR398的表达量降低。而其他研究中比如在对拟南芥4低温处理的时候，miR398表达量不发生明显变化。在李老师的测序研究中，4低温处理的时候，具有抗冷特性的W9816的miR398的表达量上升明显，而对照组B73的表达另则没有出现明显的变化。但是在上面的qRT-PCR验证的实验过程中，两者miR398的表达量都出现了明显的上升现象。因此可以认为这种miR398表达量上升的情况可能是由于植物受到了氧化胁迫的影响。全 文 结 论经测序以及实验结果的分析，确认其靶基因为GRMZM2G058522。玉米在遭受低温胁迫时通过上调miR398来响应低温胁迫，miR398通过负调控其靶基因GRMZM2G058522来参与到低温胁迫应答中，下调GRMZM2G058522的表达量，来减轻低温对玉米幼苗造成的损伤。致 谢感谢我的导师李世鹏老师，有幸成为李老师的学生，在他亲切关怀和悉心指导下完成了本论文。他严谨的科学态度，一丝不苟的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华的人格魅力深深地感染且激励着我。感谢李老师从课题的选择和项目最后的完成一直以来对我的指导和支持，在此毕业之际谨向李老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！感谢植物科学学院的各位老师对我的教育培养，以及一直以来的指导和帮助，在此，我要向诸位老师深深地鞠上一躬。感谢实验室的每位师兄师姐，感谢你们在实验过程中对我的无私帮助和指导。特别感谢董海潇学长、薛英杰学长在实验过程中的帮助和指导。感谢给我提供参考文献的学者们，谢谢他们提供的大量文献，使我在整个实验过程中以及写论文过程中有了参考的依据。感谢我的每位同学，正是你们的帮助和支持，我才能克服一个个困难，解决一个个疑惑。特别感谢与我一起完成大学生创新实验的各位同门，给予了我不少的帮助。从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在此请接受我最诚挚的谢意！最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们！参 考 文 献1 杨光,刘宏魁,李世鹏,吴颖,苏胜忠,单晓辉,王帅,原亚萍. 玉米抗冷种质筛选及相关基因研究A. 2012年全国玉米遗传育种学术研讨会暨新品种展示观摩会论文及摘要集C. 20122 Guan Q, Lu X, Zeng H, et al. Heat stress induction of miR398 triggers a regulatory loop that is critical for thermotolerance in Arabidopsis J. The Plant journal : for cell and molecular biology, 2013, 74(5): 840-851.3 高懋芳,邱建军,刘三超, etal.我国低温冷冻害的发生规律分析J.中国生态农业学报, 2008, 16(5): 1167-72. 4马树庆,刘玉英,王琪.玉米低温冷害动态评估和预测方法 J.应用生态学报, 2006, 17(10):1905-10.5 丁艳菲；王光钺；傅亚萍；朱诚；miR398在植物逆境胁迫应答中的作用-综述（2010年02期） 6Xiaoyan Lu, Qingmei Guan, Jianhua Zhu.Downregulation of CSD2 by a heat-inducible miR398 is required for thermotolerance in Arabidopsis-Plant Signaling & Behavior, 2013, Vol.8 (8)7 Kim S W, Li Z, Moore P S, et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs J. Nucleic Acids Res, 2010, 38(7): e98. 8R Sunkar，T Girke，PK Jain，JK ZhuCloning and characterization of microRNAs from rice.Plant Cell, 2013, 17(5):1397-4119 X Sun，G Fan，L Su，W Wang，Z Liang，et-Identification of cold-inducible microRNAs in grapevine-Frontiers in Plant Science, 2015, 6:59510Chen Y, Jiang J F, Song A P, et al. Ambient temperature enhanced freezing tolerance of Chrysanthemum dichrum CdICE1 Arabidopsis via miR398 J. Bmc Biology, 2013, 11:12111Barrera-Figueroa,B.E.,Wu,Z.,Liu, R., 2012. Abiotic stress-associated microRNAs in plants: discovery, expression analysis,and evolution.Front. Biol. 8, 189e197.12Feng, H., Zhang, Q., Wang, Q., Wang, X., Liu, J., Li, M., Huang, L., Kang, Z., 2013. Target of tae-miR408, a chemocyanin-like protein gene (TaCLP1), plays positive roles in wheat response to high-salinity, heavy cupric stress and stripe rust. Plant Molecular Biol. 83, 433e443.13R. Sunkar, MicroRNAs with macro-effects on plant stress responses, in: Seminars in cell & developmental biology, Elsevier, pp. 805e811.14Yang, C., Li, D., Mao, D., Liu, X., Ji, C., Li, X., Zhao, X., Cheng, Z., Chen, C., Zhu, L., 2013. Overexpression of microRNA319 impacts leaf morphogenesis and leads to enhanced cold tolerance in rice. Plant Cell Environ. 36, 2207e 2218.15Zhang, X., Zou, Z., Gong, P., Zhang, J., Ziaf, K., Li, H., Xiao, F., Ye, Z., 2011. Overexpression of microRNA169 confers enhanced drought tolerance to tomato. Biotechnol. Lett. 33, 403e409.16赵永平 玉米自交系B73低硝酸盐响应miRNA及其靶基因鉴定-中国农业科学院，作物遗传育种， 201317Yushi Luan, Weichen Wang, Ping Liu-Identification and functional analysis of novel and conserved microRNAs in tomato-Molecular Biology Reports, 2014, Vol.41 (8), pp.5385-539418 Juszczak I, Baier M. The strength of the miR398-Csd2-CCS1 regulon is subject to natural variation in Arabidopsis thaliana J. Fe