（分析化学专业论文）部分有机溶剂、离子液体及其混合物对青海弧菌q67的毒性效应.pdf

桂林工学院硕士学位论文 中文摘要 随着工业化社会的快速发展，成千上万天然或人工合成的化学物质不断地涌入人们的 生活环境，造成了日益加剧的环境污染，地球生物界特别是人类的生存和发展正受到严重 威胁。环境毒理工作面临着空前艰巨的使命，同时也展现着广阔的发展空间和前景。有机 溶剂作为科学实验和化学化工及相关行业生产中常用的载体试剂，由于其挥发性及自身毒 性，已广泛暴露于环境单元，成为主要的环境污染物之一。由于其优异的理化性质，离子 液体作为有机溶剂的替代品已逐渐广泛使用。然而离子液体毕竟是一种化学合成品，其对 生物体的潜在危害研究也势在必行。本文系统考察了有机溶剂、离子液体及其混合物对淡 水型发光菌青海弧菌q 6 7 ( v i b r i o - q i n g h a i e n s i ss p q 6 7 ) 发光强度的抑制毒性，探讨了化合物 结构、性质和组成的毒性差异，所得结果为两类溶剂毒性的评价和使用的选择提供理论依 据和数据支持。 首先，以v c d t a s t m 微孔板光度计为发光强度测试手段，应用毒性试验的微板发光法， 测定了乙腈，甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、四氢呋喃、异丙醇、苯酚、二甲亚砜、乙酰丙酮、 乙酸乙酯、正丁醇、甲醛，毗啶、乙酸甲酯、乙二醇、水合腈、m n - _ - - 甲基甲酰胺、1 甲 基- 2 一毗咯烷酮、m 肚二甲基乙酰胺等2 0 神有机溶剂，c 6 h 1 1 b f o n 2 、c m l 5 c t n 2 、c m l 5 b f , n 2 、 c g h i , i b f 4 n 、c g h i t b f a n 2 、c 9 h i t b r n 2 、c i i h t 3 b f o n 2 、c l l h l 3 c i n 2 、c t 2 h 2 3 b r n z 、c 1 4 h 2 7 b f 4 i n 2 、 c 1 4 i - 1 2 7 c i n 2 、c 1 6 h 3 1 c | n 2 等1 2 种离子液体对青海弧菌q 6 7 的毒性。结果表明，乙腈、甲醇、 乙醇、丙酮、乙醚、四氢呋喃和异丙醇7 种有机溶剂具有非单调的j 型剂量效应关系，曲 线都有效应浓度为零的零等价剂量( z e r oe q u i v a l e n td o s e ，z e d ) ；余下1 3 种有机溶剂和1 2 种 离子液体为典型的s 型剂量效应关系。接着，分别采用b i p h a s i c 、l o g i t 和w e i b u l l 非线 性函数对曲线进行模拟。得到完整的剂量- 效应曲线，并由此估算了各化合物对青海弧菌的 毒效应浓度如值。对比单个化合物模型估算的半数效应浓度负对数值( - l o g e c 5 0 ) ，可知1 2 种离子液体对青海弧菌的毒性最大者为5 4 4 5 ，这与苯胺甚至有机磷杀虫剂对青海弧菌的毒 性相当；2 0 种有机溶剂对青海弧菌的毒性均小于离子液体的毒性。 接着，分别运用均匀实验设计法和等效应浓度比法，测定了c 1 2 如b r n 2 、c 1 4 h 2 7 b f 她、 c 1 4 h ”c l n 2 、c l d l c l n 2 等4 种离子液体的混合物和c 矗1 1 5 c 1 n 2 、c 出j 5 b f 4 n 2 ，c 9 h 1 4 b f 4 n 、 c 9 h r i b f , v n 2 、c 9 h 1 7 b r n 2 、c h h l 3 c i n 2 等6 种离子液体的混合物对青海弧菌的联合毒性。对 等效应浓度比法和均匀试验设计浓度比法配置的离子液体混合物，根据单一化合物剂量效 应曲线( d o s e ，r e s p o n s ec u r v e ，d r c ) ，分别应用独立作用( i n d e p e n d e n ta c t i o n , i a ) 模型和剂量 n 桂林工学院硕士学位论文 加和( d o s ea d d i t i o n , d a ) 模型对混合物d r c 进行预测。结果表明，对前4 种离子液体的各种 混合物，d a 模型都能准确预测其毒性，而队模型高估混合物毒性。对后6 种离子液体的 各种混合物，除了e c j o 浓度比混合物例外，d a 模型能对其等效应浓度比混合物毒性做出 有效预测，而n 模型低估混合物毒性；i a 模型能对其均匀试验设计浓度比混合物毒性做 出有效预测，而d a 模型高估混合物毒性。 在乙腈、甲酵、乙醇、丙酮、乙醚、四氢呋喃和异丙醇7 种有机溶剂单一化合物对青 海弧菌发光毒性试验的基础上，结合单个溶剂d r c 曲线的三个特殊效应点，即z e d 效应 点、最大促进生长点e c 。五和e c s o 效应点，设计并测定了这几种有机溶剂的7 个等效应浓 度比混合物对青海弧菌的联合毒效应。结果表明，这7 种混合物对青海弧菌的毒效应曲线 仍为非单调的j 型剂量效应关系，且都存在效应浓度为零的零等价剂量。将甲醇、乙醇、 乙腈3 种有机溶剂z e d 效应对应的溶液分别与c 6 h 1 4 b f , 小1 2 、c l l h l 3 b f 4 n 2 、c l 征1 2 7 c i n 23 种离子液体e c h o 浓度对应的溶液组成混合物，检测各混合物对青海弧菌发光强度的影响， 评价了有机溶剂与离子液体混合液对发光菌的联合毒性。， 关键词：青海弧菌q 6 7 ；有机溶剂；离子液体；独立作用；联合毒性：剂量效应曲线；非 线性最小二乘拟合 1 1 1 桂林工学院硕士学位论文 a b s t r a c t w i mf a s td e v e l o p m e n to fi n d u s t r ya n da g r i c u l t u r e ，al o to fn a t u r a la n d o rs y n t h e t i c c h e m i c a l sw e r eg r a d u a l l yr e l e a s e dt oe n v i r o n m e n t , i n d u c i n gm o r _ ea n dm o r es e r i o u sp o l l u t i o n v a r i o u se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n sh a v ep o s e dg r e a tt h r e a tt ow i l d l i f ea n dh u m a nh e a l t h a c c o r d i n g l y , t h er e s e a r c h e r sw o r k i n gi nt h ee n v i r o n m e n t a lt o x i c o l o g yf i e l df a c ee x t r e m e l yh a r d t a s k , w h e r e a st h et o x i c o l o g i c a lw o r ka 托a l s oo fg r e a ti m p o r t a n c ea n dp e r s p e c t i v e o r g a n i c s o l v e n t sh a v eb e e nw i d e l yu s e di nl a b o r a t o r ye x p e r i m e n t sa n dc h e m i c a li n d u s t r i e sa sc a r r i e r s o l v e n t s a n db e e nr e l e a s e di ng r e a ta m o u n ld u et ot h e i rw i d e s p r e a dd i s t r i b u t i o na n dp o t e n t t o x i c i f i e s o r g a n i cs o l v e n t sa r ec o n s i d e r e da so n eo f c r i t i c a lp o l l u t a n t s i o n i cl i q u i d sb e a rav a r i e t y o fp h y s i c o - e h e m i e a lp r o p e r t i e s a n dt h e r e b yt h e yh a v eb e e nu s e da st h ea l t e r n a t i v e so fo r g a n i c s o l v e n t ss t e pb ys t e p h o w e v e r , b e c a u s ei o n i cl i q u i d sa r eak i n do fm a n - m a d ec h e m i c a l s ，i ti s q u i t en e c e s s a r yt 0p e r f o r me x p e r i m e n t st oe x a m i n et h e i rp o t e n t i a lt o x i e i t i e st oo r g a n i s m s i nt h e p r e s e n tt h e s i s ，t h el u m i n e s c e n c ei n i f i b i t i o nt o x i e i t i e so fs o m eo r g a n i cs o l v e n t s , i o n i cl i q u i d sa n d t h e i rm i x t l 雎st oaf r e s h w a t e rp h o t o b a c t e r i a , h b r i o - q i n g h a i e n s i ss p 川6 7 ，w e r ce x a m i n e d s y s t e m a t i c a l l y , a n di nt u n lt h et o x i cd i f f e r e n c e si n d u c e db ym o l e c u l a rs t r u c t u r e s ，p r o p e r t i e sa n d c o m p o n e n t so fc h e m i c a l sw e f ed i s c u s s e d t h e s ef i n d i n g sa 北a v a i l a b l ei ne v a l u a t i o no ft h et o x i c e f f e c t so f b o t ho r g a n i cs o l v e n t sa n di o n i cl i q u i d s ，a n dt h e i rs u i t a b l ea p p l i c a t i o n s f i r s t , t h et o x i e i t i e so ft w e n t yc o m m o n l yl l s c d ，w a t e r - s o l u b l eo r g a n i cs o l v e n t s ( a c e t o n i t r i l e ， m e t h a n o l ，e t h a n o l ，a c e t o n e ，e t h e r , t e t r a h y d r o f u r a n , i s o p r o p a n o l ，p h e n o l ，d i m e t h y l s a l f o x i d e ，a c e t y l a g e t t o n e , e t h y la c e t a t e ，n - b u t h a n o l ，f o r m a l d e h y d e ，p y r i d i n e ，m e t h y la c e t a t e ，e t h y l e n eg l y c o l ， h y d r a z i n eb y a t e ，m n - d i m e t h y lf o r m a m i d e , 1 - m e t h y l 2 - p y r r o l i d o n e ，m n - d i m c t h y la c e t a m i d e ) a n dt w e l v ei o n i cl i q u i d s ( c 6 h n b f 4 n 2 ，c f f i t s c i n 2 ，c l h l 5 b f 4 n 2 ，c 9 h i 屉f 剁，c g h t 7 b f 4 n 2 , c g h ) t b r n 2 c n h t 3 b f 4 n 2 , c , h 1 3 c i n 2 ，c 1 2 h 2 3 b r n 2 ，c l # - 1 2 7 b f , n 2 c | 4 1 2 7 c 1 n 2 。c t d - i n c l n 9t o h b r i o - q i n g h a i e n s i ss p q 6 7 ，w e r ee x a m i n e db yu s i n gav e r i t n s t ml u m i n o m e t e rw i t hs t a n d a r d 9 6 一w e l l m i e r o p l a t e s t h en o n - m o n o t o n ej - s h a p ed o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i p s o fl u m i n o u s i n t e n s i t yw e r co b s e r v e di nq 6 7t r e a t e d 稍t hs e v e ns o l v e n t s ，i n c l u d i n ga c e t o n i t r i l e , m e t h a n o l ， e t h a n o l ，a e e = t o n e ，e t h e r , t e t r a h y d r o f u r a n , a n di s o p r o p a n o l ，b u tt h et y p i c a ls - s h a p ed o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p sw c r r ef o u n d 谢t ht h i r t yr e m a i n e do r g a n i cs o l v e n t sa n dt w e l v ei o n i cl i q u i d s t h e s e o b t a i n e dr e l a t i o n s h i pc u r v e sw e r cf u r t h e rf i t t e dw i t hs o m en o n l i n e a rf u n c t i o n ss a c ha st h e 桂林工学院硕士学位论文 b i p h a s i c ，l o g i t a n dw e i b u l l ，a n di nt u r nv a r i o u se f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n s ( e c x ) o ft o x i c a n t si n q 6 7w g r em e a s u r e da c o u r a t e l y c a l c u l a t i o no fp e c s 0 ( - l o g e c s 0 ) v a l u e sb a s e do ni n d i v i d u a l d o s e - r e s p o n s ec u l n e r e ) m o d e l ss h o w e dt h em a x i m u mp e c s ov a l u eo fo n ei o n i cl i q u i di s 5 4 4 5 s u g g e s t i n gt h a ti t st o x i c i t yt oq 6 7i sc o m p a r a b l ew i t ht h a to fa n i l i n ee 啪o r g a n i c p h o s p h o r u si n s e c t i c i d e ；t h et o x i c i t i e so ft w e n t yo r g a n i cs o l v e n t sa r ca l ll e s st h a nt h o s eo fi o n i c l i q u i d s s u b s e q u e n t l y , t h ep h o t o b a e t e d u ml u m i n e s c e n c ei n h i b i t i o nt o x i c i t i e so fm i x t u r e so ff o u r c o m p o n e n t s ( c t 2 h 2 3 b r n 2 ，c 1 4 h 2 7 b f 4 n 2 ，c 1 4 h 2 7 c 烈2 ，c t 6 h 3 1 c i n 2 ) a n d s i x c o m p o n e n t s ( c , h 1 5 c i n 2 ，c s h l 5 b f 4 n 2 ，c s h t 4 1 3 f 4 n c g h i t b f 4 n 2 ，c g h l 7 b r n 2 ，c l i h l 3 c i n 2 ) w l 豇 et e s t e d m m i x t u r e so fi o n i cl i q u i d sw 啪p r e p a r e db yu s i n ge q u i v a l e n t - e f f e c tc o n c e n t r a t i o nr a t i om e t h o da n d u n i f o r md e s i g nc o n c e n t r a t i o nr a t i om e t h o d , r e s p e c t i v e l y t h en l i x 眦s 7d r c sc a nb ep r e d i c t e d t h r o u g hi n d e p e n d e n ta c t i o n0 a ) a n dd o s ea d d i t i o n a ) c o n c e p t sb a s e do ni n d i v i d u a ld r c m o d e l s t h er e s u l t si m p l i e dt h a tt h et o x i e i t i e so f m i x t u r e sc o m p o s e do ff o r m e rf o u ri o n i cl i q u i d a c o u l db ea c e u r a t e l yp r e d i c t e db yd am o d e l s ，w h e r e a sw e r eo v e r e s t i m a t e db yi am o d e l s f o rt h e m i x t u r e sc o m p o s e do fl a t t e rs i xi o n i cl i q u i d s ，t h et o x i c i t i e so fm i x t u r e sd e s i g n e dt h r o u g ht h e e q u i v a l e n t - e f f e c tc o n c e n t r a t i o nr a t i om e t h o dc o u l db ee f f e c t i v e l yp r e d i c t e db yd am o d e l se x c e p t e c l 0r a t i om i x t u r e 。w h e r e a sw e r eu n d e r e s t i m a t e db yi am o d e i s ；t h et o x i c i t i e so f l i = i 【t u f e s d e s i g n e dt h r o u g ht h eu n i f o r md e s i g nc o n c e n t r a t i o nr a t i om e t h o dc o u l db ee f f e c t i v e l yp r e d i c t e db y i am o d e l s ，w h e r e a sw e r eo v e r e s t i m a t e db yd am o d e l s t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a ti o n i cl i q u i d s a l eb yf a rn o te n v i r o n m e n t a l l yb e n i g ne n o u g ha n d t h e yw o u l dp o s ep o t e n t i a lt h r e a tt oo r g a n i s m s b a s e do nt h ei n d i v i d u a lt o x i c i t yt e s t so fs e v e no r g a n i cs o l v e n t s ，n a m e l ya c e t o n i t r i l e ， m e t h a n o l ，e t h a n o l ，a c e t o n e ，e t h e r , t e t r a h y d r o f u r a na n di s o p r o p a n o l ，t h el u m i n e s c e n c ei n h i b i t i o m o f t h e i r m i x t u r e s w 它r ed e t e r m i n e d t h e m i x t u r e s o f s e v e n o r g a n i cs o l v e n t s w e r e d e s i g n e d t h r o u g h t h ee q u i v a l e n t - e f f e c tc o n c e n t r a t i o nr a t i om e t h o da c c o r d i n gt ot h r e es p e c i f i ce f f e c t - p o i n t si n i n d i v i d u a ld r c m o d e l s ，i n c l u d i n gt h ez e r oe q u i v a l e n td o s e ( z e d ) ，m a x i m u mp r o m o t i n gg r o w t h c o n c e n t r a t i o n ( e c m j n ) ，h a l f e f f e c tc o n c e n t r a t i o n ( e c s 0 ) t h en o n - m o n o t o n ej - s h a p od o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p so fl u m i n o u si n t e n s i t yw e r ea l s of o u n di nq 6 7t r e a t e dw i 山t h e s em i x t u r e s f u r t h e r e x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e d1 0e x a m i n et h ec o m b i n e dt o x i c i t i e so fm i x t u r e so fo r g a n i cs o l v e n t s a n di o n i cl i q u i d st oq 6 7 t h em i x t u r e sw c r ep r e p a r e du s i n gt h es o l u t i o n sd e s i g n e dw i t hz e d p o i n t so f t h r e eo r g a n i cs o l v e n t s ( m e t h a n o l ，e t h a n o l ，a c e t o n i t r i l e ) a n ds o l u t i o n sd e s i g n e dw i t he c s o p o i n t s o ft h r e ei o n i cl i q u i d s ( c d t l 4 b f 4 n 2 ，c h h l 3 b f 4 n 2 ，c i d 4 2 7 c t n 2 ) ，a c c o r d i n gt ot h e e q u i v a l e n t - e f f e c tc o n c e n t r a t i o nr a t i om e t h o d v 桂林工学院硕士学位论文 l ( e o r d s ：h b r i o - q i n g h a i e n s i ss p q 6 7 ；o r g a n i cs o l w n t ；i o n i cl i q u i d ；i n d c p c n d c n t 刎叫 c o m b i a e x it o x i c i t y ；d o s e - r c s p o 嘴c u r v e ；n o n l i n e a rl e a s ts q u a r e sf i t t i n g v l 桂林工学院硕士学位论文 符号 本论文所有图中符号所代表含义如下： 代表实验测定值 代表空白对照值 代表实验测定点拟合线 代表剂量加和m ) 预测线 代表独立作用( l a ) 预测线 。一| | 桂林工学院硕士学位论文 研究生学位论文独创性声明和版权使用授权说明 独创性声明 本人声明：所呈交的论文是我个人在刘海玲和刘树深教授指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文中作了明确的说明并致以了 谢意。 学位论文作者( 签字) ：二、蒡 签字日期：弛哕名0 牡 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求 提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目 录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文：在不以 赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 学位敝储( 签瓤) 越砝 指导教师签字；石叁竺! ! 兰终 签字日期：丝呸! ：型 桂林工学院硕士学位论文 1绪，论 1 1生态毒理学研究任务、内容和方法 经典毒理学是研究化学物质的测定、事故、特性、效应和调节的中毒有害作用机理和 保护作用的一门学问。主要研究内容是外源性化学物的有害作用及机理。基本上包括两个 方面：其一，毒性的质和量的评价( 或评定) 。所谓质的评价是指引起有害作用的能力，而量 的评定是毒物的剂量效应关系等；其二，研究在一定条件下的作用机理【1 】。 生态毒理学在传统毒理学的基础上发展起来，是研究有毒有害物质及各种不良环境因 素对环境生物毒性效应的- - f 7 综合性学科。随着人类活动及现代工业的高度发展，环境中 污染物在不断增加，对环境造成严重污染，危及全球，严重破坏了生态平衡，威胁着人类 健康。生态毒理研究成为保护人类健康及其环境的重要环节。 2 0 世纪8 0 年代以来【l 2 】，生态毒理学在探讨、建立毒物对生态系统影响的各种试验研 究方法方面，在为人类活动排入环境的毒物安全评价提供生态学参数方面，以及在毒物对 生物种群、生物群落产生的效应等方面，都获得一些有意义的研究成果，使生态毒理学逐 步成为环境生物学的一个发展中的新的分支学科。生态毒理学是生态学与毒理学之间相互 渗透的边缘学科。有毒物质在到达靶生物以前，要受到环境的干预。这里所说的靶生物【3 】， 就是有毒物质直接作用的生物群体，可以是一个生物种群，也可以是一个生物群落：这里 所说的环境，既包括非生物环境，也包括靶生物以外的其他生物种类。毒物、环境、机体 三者之间存在着相互作用的关系。生态毒理学就是研究这种相互关系【4 】。它包括：( 1 ) 在毒 物到达靶生物以前，环境以何种方式影响毒物特性，如毒物在迁移、转化、归宿过程所发 生的特性的变化；( 2 ) 环境如何影响机体对毒物的反应；( 3 ) 毒物如何影响环境和机体，如毒 物渗入饵料引起生物灭亡等。 生态毒理学研究方法主要包括生物试验( b i o a s s a y ) 和人群调查。由于毒理学必须阐明环 境因素对生物体的作用，因此必然要求应用各种生物体( h y i n go r g a n i s m ) 作为实验材料。在 毒理学中可用作生物试验的有各种哺乳动物、水生动物、植物、昆虫，微生物等。但是， 最常用的仍是哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、家兔，豚鼠和猴等，根据不同的毒理学试验 要求，选用不同的动物【5 6 】。动物实验方法是毒理学的主要实验方法，可采用整体动物、 离体的动物脏器、组织、细胞、亚细胞甚至d n a 进行根据采用的方法不同，可分为体内 实验( i nv i v ot e s t s ) 和体外实验伽v i t r ot c s t s ) ；也可分为微观( 实验室) 研究和宏观( 群体和环境 桂林工学院硕士学位论文 生态发育) 研究。动物体内实验法，又称为整体动物实验法，使试验动物在一定时间内，参 照人体实际接触一定剂量的环境有害因素，包括受试化学物的途径、方式和方法，然后观 察动物可能出现的形态和功能的变化，研究毒理学作用及机理的实验方法忉。 动物体外实验法，是利用离体器官、组织及所分离的细胞( 称为原代细胞) 或经多次传代 培养( 称为株) 的细胞，在保持器官、组织处于生活状态下( 或使细胞处于存活条件下) ，与受 试因素接触，按实验研究的目的，观察不同终点( e n d p o i n t ) 毒性反应的实验方法。体外实验 的优点是省时，耗费低，并容易控制实验条件。 人群和现场调查，即采用流行病学和卫生学调查的方法，根据已有的动物实验结果和 环境因素如化学物的性质，选择适当的指标，观察生态环境变化和受试因素接触人群的因 果关系、剂量一效应关系，进一步验证实验室的研究结果。同时根据事故发生的性质，按照 卫生学方法列出现场调查提纲，进行现场调查，采样测定，综合分析，找出事故原因和造 成损害的环境因素，制订防护措施【8 】。此外，也应注意积累职业性接触或发生意外事故等 极为宝贵的人体观察资料，对于判断和确证实验室的基础性研究结论具有重要意义。 生态毒理学研究对于了解毒物在环境中的迁移、转化和归宿，确定和预报生态毒性， 建立生态毒理学阈限和标准，推动化学物质安全评价等法规的实施，都具有重要作用【9 】。它 面临的主要问题是如何把毒物在生物个体上测定的生态学参数，外推应用到生物种群和生 态群落，以及如何把在实验室条件下的研究结果外推应用到自然环境条件下。因此，生态毒 理学的进一步发展，有赖于方法学研究的进展，也有赖于对毒物的作用机理和在生物群体中 的剂量一效应关系的认识，更有赖于对生态系统正常的结构、功能和毒物在环境中运动规律 的深入了解。 1 2发光菌急性毒性测试方法 化学分析方法可对水环境中污染物进行定性和定量两方面鉴定，但不能直接反映各种 有毒物质对环境和生物的综合影响，特别是对低剂量污染物毒性的评价略显不足。环境水 体中能够被检测出的污染物仅占实际存在污染物的很少部分，而未被检出污染物的潜在毒 害效应不能得到真实反映。同时，由于污染物闯的相互作用，仅凭单一污染物浓度分析数 据来预测其对有机体的真正危害也是不合理的。换言之，化学分析的数据并不能从整体上 反映水质的优劣，或反映污染物对生物和生态系统的影响。随着环境中污染物以不同途径 和作用方式与生态系统发生相互作用关系越来越引起人们的关注，研究低剂量污染物单一 暴露和混合暴露的普遍规律就更具现实意义。 生物毒性检测方法可以弥补化学分析方法对污染物毒性评价的不足。生物评价标准 桂林工学院硕士学位论文 ( b i o c r i t e r i a ) 常被用来评价污染物的毒性，所谓生物评价标准就是利用敏感生物来测试污染 物的毒性影响。进行生物毒性评价时，常被作为急性毒性指标的受试生物有鼠类、鱼类、 水蚤、藻类、浮游生物等，但这些方法最大的缺点是实验周期长，实验比较繁琐，不宜用 作常规检验。针对传统生物毒性检测方法的不足，发光细菌法1 1 0 以快速、简便、灵敏、稳 定、经济特别是其独特的生理特性与现代光电检测手段完美结合而备受关注，该法可靠性 与传统的鱼类毒性实验有良好的相关性。 1 2 1 发光菌简介 生物发光是某些生物的一种生理现象，海洋生物中更为多见。会发光的生物包括有： 细菌、真菌、鱼类，乌贼，甚至是昆虫与海藻。其中有许多是藉由发光菌的存在而发出可 见荧光。自1 6 7 2 年r b o y l e 观察到发光的菌体所发出的光容易被化学物质抑制后，许多科 学家相继对细菌的发光效应进行了大量的研究。2 0 世纪7 0 年代至8 0 年代初，国外科学家首 次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体生物毒性， 现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。虽然发光菌的栖息地主要是在海洋中，多 与海洋生物行共生( s y m b i o t i c ) 、腐生( s a p r o p h y t i c ) 或寄生( p a r a s i t i c ) 关系，但在陆地及淡水区 域仍有发现其踪迹。其控制发光机理之酵素系统乃由l u m i n e s c e n ts y s t e m 所控制，其中包括 了负责发光酵素( 1 u c i f r a s e ) 产生的l u xg e n e s 。发光细菌均为革兰氏阴性菌，大部份均有极鞭 毛的生理构造，目前海洋中发光菌主要有v i b d o 和p h o t o b a c t e r i a 两属，陆地上则有 x e n o r l m b d u s 属。在这一些属之中，尤以v i b r i oh a r v e y i ，v i b r i of i s c h e r i ，p h o t o b a c t e f i u m p h o s p h o r e u ，p h o t o b a c t e r i u ml e i o g n a t h i 及x c n o r h a b d u sl u m i n e s c c n s 所发之光最亮。2 0 世纪8 0 年代初我国引进了这项技术，并先后分离出海水型和淡水型的发光细菌，用以检测环境污 染物的急性生物毒性。近年来还分离出明亮发光杆菌暗变种检测环境污染物致突变性，扩 大了检测范围f l1 】。 国际上经常使用海洋发光微生物作为验毒介质，但海洋微生物一般只适合在海洋环境 中存活，对于淡水极难适应，所以在检验时常出现误差。我国学者于1 9 8 5 年首次从青海湖 的裸鲤体表分离得到的一种发光细菌青海弧菌( v i b r i oq i n g h a i e n s i ss p n o v ) 【1 2 】，该菌 能在淡水体系中进行正常发光。将青海弧菌制成干粉，便于基层单位使用。这种细菌是当 今唯一使用中的淡水发光微生物，在检测水质时只要将少量冷冻干粉放入复苏剂中，青海 弧菌就可以使用，而结果可以在1 0 分钟内出现，不会因为被测水是淡水而影响结果，该菌 发出的绿色荧光也很易辨认，利于分析。与一般海洋发光细菌相比，青海弧菌有其自身特 点【1 3 】：( 1 ) 它不需要n a c i 存在也能良好发光( 即可在淡水体系中进行正常生长和发光) ，在 桂林工学院硕士学位论文 n a c i 浓度为i 时生长最好，在8 时为生长的上限，这一特性亦表明青海弧菌具有较高的 耐高渗透压的能力；( 2 ) 适应温度范围广，在1 0 3 5 ( 2 内均能发光；( 3 ) p h 值为6 5 1 l 较大范围 内均能生长和发光，尤其在p h = 9 时生长和发光最佳；( 4 ) 它的生物发光光谱峰值在4 8 4 n m 左右，发光蜂半高宽约9 0 r i m ，发光频谱范围为4 2 0 - 6 6 0 n m ；( 5 对金鱼的感染试验表明它为 非致病菌；( 6 ) 在各种毒性敏感细菌中，灵敏度较高。 1 2 2发光菌毒性测试的基本原理 发光细菌检测法是以一类非致病的革兰氏染色阴性厌氧菌作为指示生物，以发光强度 的变化为指标，测定环境中有害有毒物质的生物毒性的一种方法。利用发光细菌荧光酶进 行各项生物测定，均源于以下反应【1 3 - 1 4 】： f m q i 1 2 + l e - f m n h 2 l e + 0 2 l e r f m n h 2 0 2 + r c h o _ le f m l q h 2 0 2 r c h o - + l e + f m n + h 2 0 + r c o o h + 光 在一定条件下，发光细菌经培养可发出肉眼可见的绿光。细菌的发光是菌体内一种新 陈代谢的生理过程，也是光呼吸进程和呼吸链上的一个侧支，是由特异性的荧光酶 ( l u e i f e r a s e ) 、还原性的黄素单核苷酸( f m n h 2 ) 、氧分子( 0 2 ) 、长链脂肪醛( r c h o ) 所参 与的复杂反应，即在发光酶的催化下由氧将长链脂肪醛氧化成脂肪酸，还原型黄素单核苷 酸氧化成脱氢型黄素单核苷酸，同时将化学反应中的一部分能量以光的形式释放出来，光 辐射的强度与酶的含量及底物的浓度呈正比。这一发光过程极易受外界条件的影响，凡是 干扰或损害细菌呼吸或生理过程的任何因素都能引起发光强度的改变。 当外源物质进入发光菌体细胞后，外源化合物通过脂质蛋白的传递进入生物体液中， 并在一系列的相关酶作用下进行氧化、还原、水解和生物合成等代谢反应，从而引起发光 菌发光强度减弱或增强，反映出化合物对菌体的毒性作用。而且，在一定浓度范围内，毒 物的浓度与发光菌发光强度呈线性负相关变化，毒物浓度大小与发光细菌光强度变化成一 定比例关系，因而发光菌发光强度可用于监测环境中的有毒污染物并判断其毒性大d , 1 5 1 。 t h o m u l k 1 6 认为外源物质通过两种途径抑制细菌的发光：( 1 ) 直接抑制参与发光反应的酶类 活性：( 2 ) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢( 如细胞呼吸等) 。 桂林工学院硕士学位论文 1 2 3发光菌毒性测试法的应用 根据发光细菌法的原理和方法，凡能干扰或破坏发光细菌呼吸、生长，新陈代谢等生 理过程的环境因子，例如有毒有害的物质等都可以运用发光细菌法检测生物毒性。其主要 应用包括1 1 7 , ( 1 ) 发光细菌对水、土、气中化合物的急性毒性评价及快速评价水源水和地面水的质量， 渔业水体农田灌溉水体等的检测。 ( 2 ) 工业废水、废气和固体废弃物的急性毒性与评价，及污染源的毒性追踪与判断，河 流流经地域的排污分担率的估算，污水合格排放的稀释率的推算与评定。 ( 3 ) 土壤重金属急性毒性效应测定和评价，土壤金属毒性的协同或拮抗效应监测。 ( 4 ) 化学品的毒性评价与安全性评定，化学危险品的风险评定，以及环境污染物的致突 变性的评价。 ( 5 ) 环境保护处理设施效果的监控。随着环境学科的发展，发光细菌法的应用范围和前 景将愈来愈宽广。 近年来，以发光细菌法检测和评价单一和或混合物的毒性已有广泛研究。魏东斌1 1 8 】 等测定了1 7 个取代苯系列化合物对发光菌急性毒性，并筛选出具有明确理化意义的结构描 述符，构建了毒性模型，推测了可能的致毒机理，同时选择结构相似的化合物对所得模型 的预测能力进行验证。党亚爱等【1 9 】测定了1 7 种染料抑制发光细菌相对发光强度的e c 5 0 值。 结果表明，碱性染料的毒性最大，还原性染料的毒性次之，酸性染料的毒性较小，活性染料 和直接染料的毒性最小。袁星等【2 0 】采用发光细菌法测定了1 4 种硝基苯、苯酚衍生物对发 光菌的毒性，得到各化合物的半数效应浓度，并选用辛醇水分配系数( 1 0 圆、分子最低空轨 道能( e l u m o ) 和平均超离域性为参数，与l o g l e c 钟值进行定量构效关系研究结果表明，硝 基苯衍生物对发光菌的毒性与分子的电性参数相关；苯酚衍生物的毒性可分别由疏水性参 数( 1 0 9 p ) 和电性参数来描述。林春等【2 l 】测定了2 ，4 _ 二硝基甲苯与5 种硝基苯衍生物对发光菌 的单一毒性和在等剂量下二元混合物的联合毒性采用毒性单位、相加指数、相似性参数 和混合毒性指数进行联合毒性评价。结果表明，5 种二元混合物的联合作用均为协同作