（无机化学专业论文）共轭十八碳多烯酸的制备和性质研究.pdf

摘要 共轭亚麻酸( c o n j u g a t e dl i n o l e n i ca c i d , c l n ) 和共轭十八碳四烯酸( p a r i n a r i ca c i d ) 均属于共轭十八碳多烯酸，c l n 具有抗癌、降血压、降血脂、减肥等很多非常重要的生 物活性。共轭十八碳四烯酸可用做荧光膜探针，在脂类过氧化反应中可用来评价抗氧化 剂的强弱。因而无论是作为药品或者保健食品还用应用方面，c l n 和共轭十八碳四烯酸 的研究对人类的健康和生活都具有重要的意义。 本论文首先对共轭多不饱和脂肪酸做了概述，讲述了c l n 的存在以及生理活性。 在制备方法中，我们概述了c l n 和共轭十八碳四烯酸的几种主要的化学合成方法以及 在生物体中合成共轭多烯不饱和脂肪酸的三种主要的酶促反应。接着概述了包括g c 、 h p l c 、n m r 和紫外光谱等在内的几种主要的对c l n 和共轭十八碳四烯酸表征手段， 并且介绍了目前对c l n 和共轭十八碳四烯酸的研究现状以及存在的问题，叙述了我们 的研究目的和内容。 在第二至四章中，我们分别研究了c l n 的提纯、稳定性及其与c t d n a 的作用研 究。第二章中，我们采用冷藏结晶和分步结晶的方法提纯桐油和石榴籽油，冷藏结晶法 可以使桐油和石榴籽油中的c l n 含量提高到8 5 以上。分步结晶可使石榴籽油中c l n 含量经过重结晶提高到1 0 0 ，但产率和回收率都较低。在第三章中，我们将含有c l n 的混合油在空气当中5 0 氧化，发现c l n 在空气中不稳定。氧化1 9 小时之后，有9 0 的c l n 已经氧化。并且研究了c l n 中各个异构体的稳定性，研究发现c l n 中异构 体稳定性顺序为t ，t ，t - 1 8 ：3 t , t , t - 9 ，1 l ，1 3 - 1 8 ：3 i nt h ef o u t hc h a p t e r , t h e i n t e r a c t i o nb e “啪nc l na n dc a l ft h y m u sd n aw e r es t u d i e db yf l u o r e s c e n c em e t h o da n dt h er e s u l t s r e v e a l e dt h es t r o n gi n t e r a c t i o ne x i s t e db e b v c l na n dc a l ft h y m u sd n a t h em e c h a n i s mo ft h e i n t e r a c t i o nm i g h tb ei n t e r c a l a t i o n i nt h ef i f t hc h a p t e r , p a r i n a r i ca c i dw a ss y t h a s i s e du s i n ga - l nb y b r e m i n a t i o n 、m e t h y l a t i o n 、d e h y d r o b r o m i n a t i o n 、i s o m e r i z a t i o na n dc h a r a c t e r i z e db yu v 、g ca n d h p l c k e y w o r d s ：c o n j u g a t e dl i n o l e n i ca c i d ( c u 峨p a l i l l a l - i ca c i d , t u n go i l , p o m e g r a n a t es e e do i l , s y n t h e s i s ， p u r i f i c a t i o n , o x i d a t i v es t a b i l i t y , c t d n a ，e b ， m 独创声明和论文使用授权说明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：盈丛函日期：2 岛：! 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 5 6 日期：冱翠4 第一章绪论 1 1 引言 1 1 1 共轭十八碳多烯酸简介 第一章绪论 近年来随着人们对多烯不饱和脂肪酸研究的深入，共轭多烯不饱和脂肪酸，即具有 两个、三个或多个共轭双键的不饱和脂肪酸，大多具有有益的生物活性，因此引起了人 们极大的研究兴趣。如共轭亚麻酸具有抗癌、降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、增加 免疫力和减肥等 t - 3 l 。本文主要研究的共轭十八碳多烯酸是共轭十八碳三烯酸即共轭亚 麻酸( c o n j u g a t e dl i n o l e n i ca c i d 。c l n ) 和共轭十八碳四烯酸( p a r i n a r i ca c i d ) 。 共轭亚麻酸( c o n j u g a t e dl i n o l e n i ca c i d ，c l n ) 是共轭十八碳三烯酸的一组位置和几 何异构体的混合物，主要以甘油酯的形式存在于植物种子油中。c l n 中的双键可沿着十 八碳链处于多种不同位置，例如7 、9 、1 1 ；8 、1 0 、1 2 和9 、1 1 、1 3 等，每组位置异构 体又存在多种几何异构体。例如c 、c 、c 1 8 ：3 ；c 、c 、t - 1 8 ：3 等8 种异构体。天然存在 的几种c l n 异构体主要是舡桐酸( 9 c 、l i t 、1 3 t - 十八碳三烯酸) ，b - 桐酸( g t 、l l t 、1 3 t - 十八碳三烯酸) ，石榴酸( 9 c 、l i t 、1 3 c 十八碳三烯酸) ，蓝花楹酸( 8 c 、1 0 t 、1 2 c 十 八碳三烯酸) ，梓树酸( g t 、l l t 、1 3 c - 十八碳三烯酸) ，a - 0 r 盏花酸( 8 t 、l o t 、1 2 c 十八 碳三烯酸) 和b 金盏花酸( s t 、1 0 t 、1 2 t - 十八碳三烯酸) 等。其分子式如图1 1 所示。 共轭十八碳四烯酸是含有四个共轭双键的一组位置和几何异构体的混合物。共轭 9 ，11 ，1 3 ，1 5 1 8 ：4 在1 9 3 3 年首先被分离出来1 4 1 ，在自然界主要以a - p a r i n a r i ca c i d 形式存在， 可以通过终端双键的顺反异构化经由两种不知名的化合物转化成熔点较高的j ；- p a r i n a r i c a c i d 的形式睁】。几种p a r i n 撕ca c i d 的分子式如图1 2 所示。 1 1 2 共轭十八碳多烯酸存在和生物活性 1 9 7 5 年，s l d a r , h u d s o na n ds i m o n i 报道共轭十八碳四烯酸( p a r i n a r i ca c i d ) 可以用做 荧光膜探针1 6 】，并且说明了p a r i n a r i c a c i d s 可以检测双分子膜中的相转移和油脂与蛋白质 之间的相互作用7 d 0 】。从此以后在油脂和蛋白质的相互作用【l l 】，油脂聚集n 2 1 ，油脂转移 过程包括脂蛋白的结构特征1 3 1 ，脂肪酸绑定蛋白质【1 4 】和磷脂转移蛋白质15 1 ，p a r i n a r i c a c i d s 被广泛用做检测膜结构的探针。在脂类过氧化领域中，p a r i n a r i ca c i d s 被用来评价 第一章绪论 抗氧化剂的好坏【1 6 1 ，测定脂蛋白中的过氧化作用【1 7 l 和评价过氧化与细胞毒性之间的关 系瑚。几中相当复杂的合成p a r j i n x i ta c i d 的方法已经被报道【1 9 - 2 1 】 1 p u n i c i c8 c i d 腰9 、反1 1 、牍1 3 2j a c a rj ca c i d 颤8 反1 0 ，牍1 2 3 焉a 9 - e l e 反o s - l l t e a r 、k 主喘 4 c a t a l p i ca c i d 反9 ，反1 t ，晨1 3 5a - c a l e n d i ca c i d 反8 ，反1 0 、牍- 1 2 譬e l e o s t e a 冀。i dh o o c 办办办 反9 、反ii ，反1 3 ，一一一、一一、v 一一、一一、q 声、d 聋 、乎p 、v 78 c a l e n d i ca c i d 反一8 、反1 0 、反i2 图卜1几种共轭亚麻酸异构体的分子式 一八八 r 一r 2 j 2 b 图卜2 几种p a r j n a t i ca o i d 的分子式 在动物体内没有发现共轭亚麻酸，但是它在一些植物种子油，例如桐油、石榴籽、 苦瓜籽、樱桃籽中的含量十分丰富( 见表1 1 ) 。自然界中的c l n 主要是以甘油酯的形 式存在于植物种子油中的。其中a 桐酸和b 桐酸主要来自于桐油，洳桐酸的熔点为4 8 ，呈淡黄色结晶，有滑腻感。b 桐酸的熔点为7 1 。石榴酸主要来自石榴籽油中，熔 点为4 4 , c 1 2 5 绷。 2 第一章绪论 桐油取自油桐树( 大戟科e u p b o o r - b i a c e a c 油桐属a l e a r i t e s 木本油料植物) 的果仁网。 我国是油桐树栽培历史最悠久的国家，也是世界最大的桐油生产和出口国。全国年产桐油 2 0 万吨以上，占全世界总产量的7 5 8 0 。我国黄河以南的1 7 个省区都产桐油，河 南、四川、贵州、湖南、湖北、陕西、福建、浙江、安徽等省区的产量较大例。 由于桐油中所含的桐酸对氧气很敏感，极易发生氧化聚合反应，形成多聚物的薄膜， 因而桐油是种良好的干性油，具有可贵的干燥、光泽、附着、绝缘、聚合、耐酸碱、防腐、 防锈等性能，因而在油漆、油墨、渔业等民用、农用行业中广泛应用。近年来，桐油在国 际上已开始转向应用于电子工业、军工产品、机械产品、高分子合成等行业中。 石榴( p u n i c a g r a n a t u m l ) 为石榴科( p u n i e a c c a e ) 石榴属( p u n i c a l ) 植物，我国南北 各地均有栽植，尤以陕西临潼和安徽怀远为著名产地。石榴果除可直接食用外，还可加工 成清凉饮料，石榴酒等。石榴皮富含鞣质( 平均2 2 ) 可用作鞣皮工业和棉毛染织业的 原料，但现在石榴籽却多以废料弃之。但是研究发现石榴种仁含油量高达5 0 9 ，尚具 开发利用价值。石榴籽油也为优良干性油，成膜性好，膜具光泽和弹性，具有一定的耐 酸碱性。另外石榴籽油还可降低苹果的呼吸强度，减少水分散失，保鲜作用明显，因而 具有广泛的应用前景【3 0 1 。 人们早在1 9 世纪中叶就已经认识了c l n ，但由于没有发现c l n 的有益的生物活性， 所以c l n 没有引起人们的重视。直到1 9 8 7 年n u g t e r e n d h 和c h r i s t - h a z e l h o f e 3 1 】研究 了从天然种子油中分离出的脂肪酸对花生四烯酸生物合成前列腺素e 2 的影响，结果发 现有两种活性非常高的抑制剂，并且确定这两种抑制剂就是从天然种子油中获得的c l n 的异构体：8 c 、1 0 t 、1 2 c 1 8 ：3 和8 t 、1 0 t 、1 2 t - 1 8 ：3 。1 9 9 9 年p 2 】以色列的研究人员发现发 酵石榴果汁以及压榨的石榴籽油均具有强烈的抗氧化活性，且这种能力与b h a 和绿茶 儿茶酚的接近，而比红酒的更为强大，这一结果引起了人们对c i n 研究的极大兴趣。 2 0 0 2 年n a m d k t a 3 1 等人发现石榴籽油可以辅助治疗人类乳腺癌，并推测这一抗癌能力 可能主要来自其所含的石榴酸。进一步的研究表明c l n 和c l a ( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ， 共轭亚油酸) 类似，具有非常有益的生理功能，主要包括抗癌、降血脂、提高免疫力、 减肥等，且比c l a 的活性更强。目前人们对c l n 的研究兴趣己成为继c l a 之后的又 一个研究热点。笔者的研究发现向日粮中添加c l n 可明显降低仓鼠肝脏胆固醇含量而 对肾脏和心脏胆固醇含量没有影响 3 4 1 。目前对c l n 的研究兴趣主要集中于c l n 的合成、 分离分析、生物活性及其对人类健康的有益影响。 第一章绪论 和非共轭的不饱和脂肪酸相比，共轭多不饱和脂肪酸对氧化敏感，并且很容易发生 聚合反应 2 2 - 2 3 。在生物体内他们可以被迅速的氧化为活性更强的产物，从而具有了胞质 毒性，特别是对恶性肿瘤细胞具有更为强烈的杀伤作用脚l 。 表卜1 一些含有0 1 - 1 q 的种子油的脂肪酸组成“” 且前对c l n 生理活性的机理研究仍然不深入，存在许多争论。有研究发现抗氧化 剂的加入可以阻止c l n 的毒性，因而推测c l n 强烈的胞质毒性的原因可能是在于c l n 是个助氧化剂【3 5 1 。2 0 0 1 年，r s u z u k i 等人发现当加入b h t 作为抗氧化剂后，c l n 的 抗癌活性完全消失。因而推测脂类过氧化对c l n 的胞质毒性可能起了重要的作用。但 是也有人认为c l n 是个抗氧化剂 3 6 1 。 1 2 c l n 和共轭十八碳四烯酸的化学合成 4 第一章绪论 1 2 1 ( x n 的化学合成 天然c l n 主要以甘油脂的形式存在于某些植物种子油中。桐油、石榴籽、苦瓜籽、 樱桃籽等都含有c l n ，有些种子油中的c l n 含量还相当丰富。制备c l n 的有效方法主 要包括化学法、生物法和天然产物提取法三大类。化学法可以大量合成c l n ，易于工业 化生产。生物法具有选择性合成的优点，可以得到较高纯度的c l n 异构体单体。 常见的化学法有化学合成法、脱水法、碱异构化法等，得到的大多是c l n 异构体 的混合物。 ( 1 ) 化学合成法 m e c h 2 3 c 兰c m g b r +c h ( o e t ) 3 山 m e c h 2 3 c = - c c h ( o e t h m e c h 2 3 c h = c h c h om e c h 2 3 c ；- c c h o j ，山 m e c h 2 3 c h = c h c h ( o h ) c h 2 c ；c hm e c h 2 3 c c c h ( o i - 1 ) c h 2 c = - c h 上上 m e c h 2 3 c h = c h c h = c h c = - c hm e c h 2 3 c = - c c h - - c h c - = c h j ，j ， m e c h 2 3 c h = c h c h = c h c = - c ( c h 2 ) t c im e c h 2 3 c - = c c h = c h c - = c ( c h 2 ) t c i 上上 m e c h 2 3 c h = c h c h = c h c x - c ( c h 2 ) t c n m e c h 2 3 c - = c c h = c h c c ( c h 2 ) t c n 山j ， m e c h 2 1 3 c h = c h c h = c h c ：- c ( c h 2 ) t c o o hm e 【c h 2 】3 c 兰c a 扣c h c 目c ( c h 2 ) 7 c o o h “tc上ctc m e c h 2 1 3 c h = c h c h = c h c h = c h ( c h 2 ) 7 c o o hm e c h 2 3 c h = c h c h = c h c h = c h ( c h 2 ) t c o o h 图1 - 39 c 、1 1 t 、1 3 t 一1 8 ：3 和9 c 、1 1 t 、1 3 c - 1 8 ：3 的化学合成步骤。” 1 9 5 7 年c r o m b i e l w i 等以含有炔键的物质为起始原料，中间经过丙炔基雷佛马茨基 反应、脱水、卜氯- 7 - 碘一庚烷的加成、水解、l i n d l a r 催化剂加氢还原等多步反应合成出 c l n 的异构体，产物主要是9 c 、l l t 、1 3 t - 1 8 ：3 和9 c 、l l t 、1 3 c - 1 8 ：3 异构体，但是该方 法的缺点在于步骤较多，且产率较低。其合成步骤见图l - 3 。 ( 2 ) 脱水法 1 9 9 3 年y u r a w e c z m p 3 8 1 等人提出了一个以l a 作为起始物，通过氧化、脱水等多 个步骤，合成c l n 的方法。其具体的合成途径为：l a 的双键部分自动氧化生成氢过氧 5 第一章绪论 化物，氢过氧化物由金属还原生成氢氧化物，氢氧化物酸催化脱水得到9 t 、1 l t 、1 3 t - 1 8 ：3 。 其合成路线见图1 4 ： r 。且二、，、，；、。旦王，巍凸玉l 、，、，。；、， 坞o l y 山 r o ，j 己，、，、，、，每，、。，、一 c o a j u p t a d t 妇 图1 - 4 ：脱水法合成9 t 、1 1 1 ；、1 3 t ：一1 8 ：3 嗍 ( 3 ) 碱异构化法 表 - 2 碱异构化l n 合成c i , _ n ”1 州 碱异构化法是以亚麻酸为起始物，使亚麻酸分子中的非共轭三键在碱的催化作用下 发生异构化反应，形成共轭三烯结构的方法，这是目前合成c l n 的较为有效的方法。 碱异构化法中常用的催化剂主要为氢氧化钾和叔丁醇钾等。2 0 0 0 年i g a r a s h m 3 9 1 等采用 不同浓度的氢氧化钾7 , - - 醇溶液作为催化剂催化异构亚麻酸，结果发现生成c l n ，但 其产率较低。用6 的氢氧化钾乙二醇做催化剂时，有1 7 o c l n 生成。2 0 0 1 年 s u z u k i r 【帅】等采用叔丁醇钾d m f 溶液做催化剂，在3 0 c 下催化异构化亚麻酸乙酯l 小 时，同样也发现生成了c l n 。表1 2 列出了s u z u k i r 和i g a r a s h i m 所采用的异构化条件 以及结果。 碱异构反应时间、碱浓度对生成的c l n 异构体的含量有较大影响，研究结果表明随 着碱催化剂浓度的提高和反应时间的延长，c l n 的含量也随着增加。目前采用的化学法 的产率均不太高，且产品的分离和纯化比较困难，这些正是亟待解决的化学合成问题， 6 第一章绪论 需要进一步研究。 1 2 2 共轭十八碳四烯酸的化学合成 2 0 0 4 年，d m i t r yv k u l d e v ，w i l l i a ml s m i t h l 4 1 1 等人以亚麻酸为起始物，经过加溴， 脱溴化氢等步骤合成共轭十八碳四烯酸。其具体步骤为以纯度为8 2 的亚麻酸为起始 物，通过有位置选择性的加溴，d b u 脱溴化氢得到a - p a r i n a r i ca c i d 。其合成步骤如图l 一5 所示。 y “ l ， 6 o 弋，- - + 八八- 0 i 。一 6 ，r + 。、w 8 图1 - 5 共轭十八碳四烯酸的化学合成步骤 1 3 共轭十八碳三烯酸的生物合成 尽管共轭多烯不饱和脂肪酸可以通过化学合成的方法得到，但是其缺点在于得到的 多是共轭多不饱和脂肪酸异构体的混合物，分离和纯化很困难。而生物合成法则是采用 特定的酶或微生物催化相应的底物以得到共轭多烯不饱和脂肪酸。 近年来随着生物技术突飞猛进的发展，尤其是转基因技术的应用，使得人们可以培 养出含有共轭多烯不饱和脂肪酸合成酶或其一系列变体的转基因植物。利用这些植物， 可以生产出较高纯度的共轭多烯不饱和脂肪酸。这是近年来出现的非常具有吸引力的大 规模生产共轭多不饱和脂肪酸的有效方法。目前所知道的能够合成共轭多烯不饱和脂肪 7 第一章绪论 酸的酶共有三类，分别是共轭酶、氧化酶和异构化酶，它们的机理都较为明确。 1 3 1 共轭酶 生物酶促合成法是生物法中常用的一种合成方法，它是利用特定的酶或微生物催化 相应的底物以得到c l n 的方法。之前的研究表明，在某些植物、细菌和海洋红藻中存 在可以酶促合成c l n 的酶。例如1 9 8 5 年c r o m b i e l 1 4 2 1 等人研究发现，金盏花在生长过 程中可以合成出8 t 、1 0 t 、1 2 t - 1 8 ：3 。1 9 9 7 年l i u l 1 4 3 1 等发现苦瓜籽在生长过程中可以合 成出a 桐酸。1 9 9 9 年c a h o o n e b 1 4 4 1 等应用分子生物技术将苦瓜籽中得到的c d n a s 表达 在大豆中，从而使c t 桐酸在转基因大豆胚胎中获得了积累，该酶促反应的前提是以卵磷 脂形式存在的亚油酸。这些异构酶在结构上都与油酰a 1 2 脱氢酶类似。从生化角度看， 由a 1 2 脱氢酶或其变体催化的氢吸收或氧插入都要有单分子氧和还原辅酶( n a d h n a d p h ) 的参与，其酶促反应机理主要在于共轭酶促作用，图1 - 6 表明了这一过程。 亚油酸( p = 磷脂)甜桐酸 图1 - 6 共轭酶促合成o _ n 的机理 生物酶促合成具有选择性合成的优点，可以得到c l n 异构体单体。从生物体内提 取这些酶，在体外催化相应的底物，即可得到c l n 异构体。因而生物酶促合成法是大 规模合成c l n 异构体单体的有效方法。但是生物酶促合成的产率较低，今后的研究方 向在于提高其产率并研究其酶促作用机理。 1 3 2 异构化酶 红藻p i l o t af i l i c i n a 提取物可以将十亚麻酸催化为顺- 6 、反8 、反1 0 1 8 ：3 。在这些转 化过程中，既不需要双氧也不需要辅酶。将在该反应中起作用的酶，即多烯脂肪酸异构 酶纯化之后，发现该种酶是一种低聚物。k e p l e r 等使用具有立体化学选择性的氘化底物 来研究十亚麻酸的酶催化异构化，结果发现前s 基团的氢发生了从c - 1 1 到c - 1 3 的分子 内转移( 即a 1 2 双键异构化到a l l 位上) ，随后c 8 上的前r 基团氢还发生消去反应( 即 a 9 ，1 1 位上的双键协同异构化到8 ，l o 位上) 【4 5 】。从一种厌氧细菌b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v i n s 中分离出来的酶和这种海藻多烯脂肪酸异构酶类似，也可以催化亚油酸的a 1 2 双键，发 生立体选择性异构化反应，得到顺9 、反1 1 1 8 ：2 。这种c l a 异构体是某些动物体内所 8 第一章绪论 发生的油酸生物氧化反应的中间体m 。其酶促反应如图1 7 所示。 1 3 3 氧化酶 图卜7 异构化酶促机理 馘刁艄1 0 ( e ) - n o m a d e o a b l e a o l o - e l d 用从红藻l c o r a i l i o i d e s 中提取的酶来催化底物p 亚麻酸，以此来研究红藻中四共轭 多不饱和脂肪酸的生物合成机理。结果表明p 亚麻酸可以被酶促合成为四共轭的顺6 、 反8 、反1 0 、顺1 2 一十八碳四烯酸，其该反应是基于分子氧的浓度，同时并不要求有还 原辅酶的参与。有趣的是在四共轭多不饱和脂肪酸形成的同时还伴随有成化学计量比的 h 2 0 2 的出现。这表明该酶促反应是属于氧化酶机理【4 ”。与此相一致的是，去饱和过程 能在厌氧条件下平稳进行，这表明存在着诸如对苯醌这样的电子接受体。考察去饱和反 应的立体化学，可以发现c 8 上的前s 基团氢和c 1 1 上的前- r 基团氢可以发生立体选 择性消去。红藻l c o r a l l i o i d e s 中的氧化，脱氢酶也可以作用于弘亚麻酸，将之催化转化 为a - p a r i n a r i c 【4 9 】。氧化酶促反应如图1 - 8 所示。 1 4 天然产物提取法 0 ， h ， ：z ! ，厂、，、 c o o h 、：、少7 、： 图卜8 氧化酶促机理嗍 一些天然种子油中含有c l n ，有的含量还相当丰富。例如桐油、石榴籽油等都含有 丰富的c l n 。表1 2 列出了一些含c l n 的种子油的组成例。可以看出，这些种子油所 含的虽然都是c l n 异构体的混合物，但是其中有一种异构体的含量较高。因此将这些 种子油萃取后经过分离提纯，即可得到纯度较高的c l n 异构体单体。这也是目前大规 模制备c l n 的又一个有效方法。具体提纯步骤主要包括萃取、皂化、酸化、分离提纯 等等。通常采用的分离提纯方法主要有：尿素包合法【5 0 】、超l | 缶界c 0 2 流体萃取法【5 1 】、 9 第一章绪论 低温结晶法【5 2 】等。 1 5 共轭十八碳三烯酸的表征 在c l n 的研究中，对c l n 进行表征以及分离、分析是极为重要的。目前采用多种 方法对c l n 及其衍生物进行表征，并对c l n 异构体的混合物进行分离分析。常用的表 征和分离手段包括红外光谱法、紫外光谱法、核磁共振法( n m r ) 、气相色谱法( g c ) 、 高效液相色谱法( 口l c ) 、毛细管电泳法( c e ) 等。其中红外光谱法、紫外光谱法、 核磁共振法主要用于c l n 及其异构体的表征。o c 、h p l c 、c e 是目前c l n 异构体分 离分析主要方法，可对c l n 进行定性及定量分析。 1 5 1 红外( 1 r ) 和紫外光谱( u v ) 法 c l o e z 5 3 1 等人于1 8 7 5 年首次对舡桐酸进行了研究。由于分析条件的限制，开始主要 是应用红外和紫外吸收光谱来对c l n 进行表征。1 9 9 3 年y u r a w e c z m p s 4 l 等人测得的a - 桐酸乙酯和b 桐酸乙酯的红外光谱如图i - 9 所示，并对图谱上的各个峰进行了归属，洳 桐酸乙酯中9 9 5c m - 1 、9 6 8c m - 1 是其共轭三键结构中c h 键的变形振动峰，类似b 桐酸 乙酯共轭三键结构中的c - h 键的变形振动峰在9 9 8c m - 1 ，其c h 键的伸缩振动峰在3 0 2 0 c 】 n - 1 。 4 0 0 0 2 呻o i o o o4 0 0 02 啪l o o o 图1 - 9 洳桐酸乙酯和8 桐酸乙酯的红外光谱图”图1 - 1 0 桐油脂肪酸的紫外光谱图” 由于c l n 具有三共轭双键的特殊结构，因而它在紫外光范围内有强烈的吸收。事 实上，碳链上共轭双键的数目不同，紫外吸收的最大值不同。例如，二共轭双键在2 3 5 n m l o 第一章绪论 处有最大吸收，而三共轭双键在2 6 8 n m 处有最大吸收，四共轭双键在3 1 5 n m 处有最大 吸收，五共轭双键在3 4 5 n m 处有最大吸收，六共轭双键在3 7 5 n m 处有最大吸收【5 5 】1 5 6 】。 桐油脂肪酸的紫外光谱如图1 1 0 所示 3 9 1 ，不同的c l n 异构体的最大紫外吸收略有不同， 例如：舡桐酸在2 7 2 n m 处有最大吸收，b 桐酸在2 6 8 n m 处有最大吸收，而石榴酸在2 7 5 n m 处有最大吸收1 4 9 。通过红外和紫外光谱法可以对c l n 进行初步表征。 1 5 2 核磁共振法( n m r ) n m r 是对有机化合物的最有力的分析方法。1 9 7 9 年t u l l o c h a p 【5 7 】采用1 3 c 傅立叶 变换核磁共振技术对含有c l n 的f e v i l l e at r i l o b a t a 种子油作了n m r 分析，并且对图中 各个峰进行了归属。图1 1 1 和表1 3 分别是f e v i l l e aa i l o b a t a 种子油甲基酯的”cn m r 图及图上各个峰的化学位移值。 图卜1 1f e v i l l e a t r i l o b a t a 油甲基酯的1 3 c n m r 图谱” 第一章绪论 第一章绪论 表1 - 4 各种脂肪酸的”c 的化学位移的比较 c 位置硬脂酸油酸亚油酸9 c ，1 i l l 3 c 一1 8 ：3 9 t , 1 l t , 1 3 t - 1 8 ：3 9 c ，l l t , 1 3 t - 1 8 ：3 23 4 1 33 4 1 43 4 1 63 4 1 43 4 0 8 3 4 0 8 ，3 4 2 5 32 5 o l2 5 0 02 5 o l2 4 9 92 4 7 22 4 9 2 4 2 9 2 12 9 1 9 2 9 1 8 2 9 1 52 9 1 32 9 1 8 52 9 3 l2 9 1 9 & 0 1 22 9 1 8 & 0 1 32 9 1 5 5 - o 1 62 9 1 3 5 o 12 9 1 2 舯1 9 62 9 5 0 2 9 1 4 y - 0 3 62 9 1 8 y - 0 3 22 9 1 0 3 , - 0 4 02 9 0 5 y - 0 4 52 9 1 2 7 - 0 3 8 72 9 “ 2 9 7 3 p + o 0 92 9 6 4 舯0 02 9 6 5 b + o 0 1 2 9 3 6 p + 0 0 l2 9 7 l p + o 0 7 8 2 9 6 92 7 2 0 a - 2 a 92 7 2 6 a - 2 4 32 7 8 8 a - 1 8 13 2 7 9 a + 3 1 02 7 8 7 a - i 8 0 92 9 7 21 2 9 7 71 3 0 0 81 2 8 9 21 3 0 6 0 1 2 8 8 4 l o2 9 7 31 3 0 0 01 2 8 1 0 1 3 2 4 5 1 3 0 8 2 1 3 2 9 2 l l”7 72 7 2 6 a - 2 5 1 2 5 7 1 0 a - 4 0 61 2 7 8 71 3 4 4 91 2 6 0 0 1 22 9 7 72 9 8 2 b + o 0 51 2 7 9 71 2 7 9 91 3 4 2 71 3 5 1 5 1 32 9 7 7 2 9 3 c y r - 0 4 1 1 3 0 2 51 3 2 6 31 3 0 9 5 1 3 1 7 2 1 4 2 9 7 l2 9 5 7 6 - 0 1 42 7 2 6 a - 2 5 11 2 8 8 31 3 0 5 11 3 0 6 6 1 52 9 4 12 9 3 6 2 9 4 0 1 3 - 0 o l 2 7 6 3 a - 1 7 83 2 5 2 a + 3 1 13 2 5 5 a + 3 1 4 1 63 1 9 73 1 9 5 3 1 5 吼t - 0 3 83 1 9 2 j 3 - 0 0 53 1 6 0 1 3 - 0 3 73 1 5 6 1 3 - 0 4 1 1 72 2 7 32 2 7 22 2 6 2 跚1 1 2 2 3 7 3 - 0 3 62 2 2 8 y - 0 4 52 2 2 9 v - 0 4 6 1 8 1 4 1 0 1 4 1 01 4 0 91 3 9 7 6 - 0 1 31 3 9 6 & 0 1 41 3 9 7 8 - 0 1 3 另外，t u t l o c h a p 5 7 还对硬脂酸( 1 8 ：o ) 、油酸( 1 8 ：1 ) 、亚油酸( 9 ，1 2 1 8 ：2 ) 、石榴酸 ( 9 c ，l l t ，1 3 e - 1 8 ：3 ) 、p 一桐酸( 9 t , 1 l t , 1 3 t - 1 8 ：3 ) 、a - 桐酸( 9 c ，l l t , 1 3 t - 1 8 ：3 ) 的各个c 的化学位移 进行了比较，归属了这几种脂肪酸的c 化学位移值，表1 - 4 列出了各种脂肪酸的c 的化 学位移。由表l 一3 和表1 - 4 的对比可以看出，石榴酸的双键化学位移值与f e v i l l e a t r i l o b a t a 种子油甲基酯的1 3 c n m r 图上6 个主要双键峰2 l ，2 2 ，2 4 ，2 5 ，3 l ，3 2 的化学位移吻 合较好，由此可以确定f e v i l l e a t r i l o b a t a 种子油所含的主要c l n 异构体是9 e ，1 1 t ，1 3 c 1 8 ：3 ， 并且双键对c 8 和c 1 5 的a 影响可以进一步确定9 ，1 0 和1 3 ，1 4 是顺式双键。这6 个 双键峰可以分成3 对，i o c 、1 3 c 由于收到最小的压缩，其化学位移值在最低场；l i e 、 1 2 c 在最高场；另外两个峰是9 ( 2 、1 4 c 。 采用n m r 法，可以确定c l n 的空间构型，这为今后c l n 异构体的鉴定提供了有 力的依据。但是由于c l n 存在多种位置和几何异构体，并且一个双键对另一个双键的 化学位移的影响还不十分确定，这为给n m r 信号的归属带来了很大的困难。 1 5 3 气相色谱( g c ) 和高效液相色谱( h p l c ) 法 第一章绪论 g c 法可将c l n 的各种几何异构体分离开来。1 9 8 1 年t a k a g i t 【4 9 】等人用气液色谱 法测定了富含c l n 的植物种子油的成分。此方法可以有效的分离出c 、t 、t - 9 ，1 1 ，1 3 1 8 ：3 ： c 、t 、e - 9 ，1 1 ，1 3 1 8 ：3 ：t 、t 、c - 9 ，1 1 ，1 3 1 8 ：3 ；t 、t 、t - 9 ，1 1 ，1 3 1 8 ：3 ；t 、t 、e - 8 ，1 0 ，1 2 - 1 8 ：3 和 t 、t 、t 8 ，l o ，1 2 1 8 ：3 等各种c l n 的异构体。所得的气液色谱图如图1 1 l 所示，所用的g l c 分析条件如表1 5 所示。两种富含c l n 的植物种子油：桐油和石榴籽油的g c 图谱如图 1 1 2 所示。将所得的g c 图谱与t o r u t a k a g i 等给出的图谱相对照，即可对桐油和石榴籽 油中的各个色谱峰进行定性 4 9 1 。定量分析结果表明，桐油和石榴籽油中的c l n 含量很 高，分别达到了7 6 5 和7 5 5 。 3 04 0 晌 图卜1 1 共轭十八碳三烯酸的g l c 和h p l o 图谱m 注：共轭十八碳三烯酸的g l c 图谱( 1 ) 1 6 ：0 ( 2 ) a e - 9 ，注；共轭十八碳三烯酸的h p l c 图谱( 1 ) 1 1 ，1 3 1 8 ：3 ( 3 ) c t t - 9 ，1 1 ，1 3 1 8 ：3 ( 4 ) t t c - 8 ，1 0 ，1 2 - 1 8 ：3 ( 5 ) t t cc t c - 9 ，1 1 ，1 3 1 8 ：3 ( 2 ) c t t - 9 ，1 l ，1 3 1 8 ：3 ( 3 ) - 9 ，1 l ，1 3 - 1 8 ：3 ( 6 ) e r e - 9 ，1 1 ，1 3 - 1 8 ：3 ( 7 ) m - 8 ，l o ，1 2 - 1 8 ：3 ( 8 ) t i c - 8 ，i o ，1 2 - 1 8 ：3 ( 4 ) t t c - 9 ，1 1 ，1 3 - 1 8 ：3 ( 5 ) t t t - 2 0 ：1 ( a ) 桐油( b ) 栝楼籽( c ) 金盏花0 3 ) 梓树( e ) a b ，c ，d9 ，1 1 ，1 3 - 1 8 ：3 ( a ) 桐油) 栝楼籽( c ) 金盏 和a 的反式异构化的混合物 花) 梓树( e ) a j 3 ，c ，d 和a 的反式异构 的混合物 1 4 ：儿1皿，止旷监匠“肚 c d e 第一章绪论 表1 - 5g l c 和h p l c 的分析条件 c l n 1 52 0 2 5 3 0 1 52 02 53 0 b 图1 - 1 2 桐油和石榴籽油的气相色谱图 a 桐油b 石榴籽油 1 5 第一章绪论 h p l c 是对c l n 的异构体进行分离的有效方法。1 9 8 1 年t a k a g i t p 9 j 等给出的h p l c 洗脱图如图1 1 1 所示，所用的h p l c 分析条件如表1 5 所示。由图可以初步确定分离出 的c l n 异构体。采用c 1 8 或石英柱，h p l c 可以较为有效的分离c l n 的几何异构体， 图1 1 3 是桐油和石榴籽油的t t p l c 色谱图。与t o m t a k a g i 等给出的h p l c 洗脱图两相 对照后，我们可以初步确定分离出的c l n 异构体嗍。但h p l c 不能十分有效的将c l n 的位置异构体完全分离，例如9 c 、1 i t 、1 3 b 1 8 ：3 ，8 t 、l m 、1 2 c - 1 8 ：3 和9 t 、l i t 、1 3 e 一1 8 ：3 在h p l c 上出现了重叠，这是目前h p l c 表征c l n 所存在的问题之一。由于每种异构 体可能具有不同的生物活性，因此寻找一种能够完全分离c l n 各个异构体的有效方法， 并认识其生物活性是今后重要的研究内容之一。 c ，t ，t - 1 8 ：3 l，t - 1 8 ：3 c ，t , c - 1 8 ：3 l 一八 、jl 2 03 04 0 c , t c - 1 8 ：3 2 02 53 0 b 图卜1 3 桐油和石榴籽油的h p l c 色谱图 a 桐油b 石榴籽油 1 6 第一章绪论 1 5 4 毛细管电泳法( c e ) 毛细管电泳技术( c e ) 尤其适用于手性异构体、官能团位置异构体以及双键的顺反 异构体的分离因而近年来毛细管电泳技术引起了人们日益广泛的研究兴趣。它越来越成 为分离异构体的有效方法。2 0 0 3 年b o h l i n m e 【5 8 1 等采用双环糊精体系 ( 1 m m h s b c d ，1 0 m mp - c d ) ，利用毛细管电泳成功的直接分离了7 种c l n 的异构体， 而不需要先将其转化为甲基酯( 图1 - 1 4 ) 。g c 、h p l c 等传统的脂肪酸分离分析方法都 要求首先将脂肪酸进行甲基化以降低其沸点，提高其分离效果。但是由于甲基化过程可 能会对c l n 异构体的组成产生影响，从而有可能会导致分析结果与实际组成不符。c e 法不需要甲基化，因而是更为有效的c l n 分离分析方法。 u v a b s 681 01 21 41 6 图1 - 1 4 毛细管电泳法分离c l n 的异构体 注：1 石榴酸，2 蓝花楹酸，3 a - 桐酸，4 梓树油酸5 舡金盏花酸，6 桐酸，7 p 金盏花酸 毛细管电泳的具体分离条件是：熔融石英毛细管( 5 8 c m x s 0 肛m ，有效长度5 0 c m ) ， 3 0 k v ；2 1 i l a ，u v 检测器在2 6 8 n m 处检测，背景电解液为2 4 r a m 十二烷硫酸钠，2 0 ( v v ) 乙睛，4 0 m m 硼酸( p h 9 2 ) 和4 m 尿素【翊。采用此种条件可以将7 种c l n 的异构体完 全分离。 1 7 第二章c l n 的提纯 1 6 本论文的研究背景、目的和内容 1 6 1 研究背景和研究目的 ( 1 ) 目前国内外对共轭多烯不饱和脂肪酸的研究主要集中在c l a 上，对c l a 的合成、 表征、体内和体外的生理活性、代谢机理等都有了一定的研究，但是对于c l n 的研究 才刚刚开始。由于c l n 有生物活性的异构体和机理目前都不十分明确，因此制备出高 纯度的c l n 及单个异构体都是十分必要的。我们的实验目的在于研究制备c l n 的新方 法，优化反应条件、提高产率并降低成本，以便为研究生物活性提供更高纯度的c l n 。 ( 2 ) c l n 在空气中不稳定，有研究推测c l n 具有强烈的胞质毒性的原因可能是因为 其是个助氧化剂。本实验的目的在于研究c l n 在空气当中的氧化稳定性，探讨c l n 具 有强烈生理活性的可能机理，并对今后c l n 产品的生产、加工、储存等提供有效的实 验依据。 ( 3 ) c l n 具有许多有益的生理功能，例如在动物体内有抗癌、减肥、降