人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书.doc

人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒英文名称：Shuwen Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR【包装规格】 7测试 /盒【预期用途】EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路， PLC- 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。【检测原理】本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。【主要组成成分】本试剂盒具体包含组分如表1表1 编号组分份数体积(L)119-Del（1）检测反应液1150219-Del（2）检测反应液11503S768I检测反应液1150420-Ins检测反应液11505T790M检测反应液11506L858R检测反应液11507L861Q检测反应液11508G719X检测反应液1150外控检测反应液1150r-Taq酶130阳性对照DNA1100无菌超纯水1500【储存条件及有效期】避光，-20以下保存，避免反复冻融(不要超过5次)，有效期6个月。【适用仪器】ABI 7300，ABI 7500，ABI 7900，ABI StepOne，ABI StepOne Plus，Rotor-Gene Q【样本要求】本试剂盒可以检测从新鲜组织及FFPE组织中提取的DNA，DNA质量及浓度影响检测的特异性和灵敏度。DNA的质量与样本保存时间、样本组成、DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求：1、 新鲜标本的制备过程中，术后标本取下后应立即放入-20以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程中，术后标本应在1 个小时内放入10中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的4-20 倍，固定时间应在6-48 小时之间；2、 新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于1%，尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业化 试剂盒提取DNA(AXYGEN，QIAGEN等公司产品)。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20保存。3、 FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20保存。FFPE组织样本保存年限尚未超过3年。4、 样本切片规格要求为：横切面面积至少6mm6mm，厚度10m，3片，如果切片面积小请适当增加切片数。最终提取的DNA用100L-200L水溶解，分光光度计检测浓度后，稀释或浓缩成5-10ng/L。【检验方法】 本试剂盒可以进行5人份的检测反应，并为每个样本额外提供一个参照基因扩增反应，用于估测样本实际DNA的浓度。建议每批次实验都检测一个阳性对照(positive control)和一个无模板阴性对照(NTC)。建议根据实验条件进行分区操作，如样品处理区，反应液配制区等。具体操作步骤如下：1. 将试剂盒中所有组分冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。注意：试剂盒中的所有试管在开盖前均应短暂离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。2. 每批实验根据待检测样本数、一个阳性对照、一个阴性对照，同时计算并分别配制1-8号反应液。每个反应液所需反应数 =待测样本数 + 2（一个阳性对照、一个阴性对照），而每个反应所需反应液19.7L，需r-Taq酶0.3L，即从1-8号反应液中分别取（19.7反应数）L于对应编号的1.5EP管，再分别加入（0.3反应数）L的r-Taq酶。注意：由于取样误差，请根据情况适当多配置0.3个反应即可。3. 将配制好的混合液轻轻充分混匀，并按照每管20L分装到每个PCR反应管中。4. 然后向每个反应管中加入5L待检测DNA、或阳性参照、或水(试剂盒提供)。待检测样本最佳浓度范围为5ng/L-10ng/L，即每个反应管中有效DNA总量为25-50ng。5. 短暂离心消除反应管中的气泡，将PCR反应管放入PCR仪。样本在PCR反应板中的布局可参见表2表2 建议布局突变19-del（1）19-del（2）S768I20-InsT790ML858RL861QG719X外控1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品12样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品23样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品34样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品45样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品56STDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTD7NTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTC6. 打开操作软件，设置PCR扩增程序为Stage1：95 5minStage2：95 20s，57 32s ，5个循环Stage3：95 20s，60 32s ，40个循环 收集FAM信号注：如果使用ABI定量PCR仪，将“Passive Reference”设置为“None”, “reporter”设置为“FAM”，“quencher”设置为“TAMRA”【参考值】检测结果判定：1. 当样品CT值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。2. 当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。表3 结果判定19-del(1)19-del(2)S768I20-InsT790ML858RL861QG719X阳性CT28CT28CT30CT28CT28CT28CT29CTS192240-2257 del 18 12370E746_T751I192235-2252AAT del 18 13551E746_T751A192237-2251 del 15 12678E746_S752D192238-2255 del 18 6220L747_A750P192238-2248GC del 1112422L747_T751Q192238-2252GCA del 15 12419L747_E749del192239-2247 del 9 6218L747_T751del192239-2253 del 15 6254L747_S752del192239-2256 del 18 6255L747_A750P192239-2248C del 10 12382L747_P753Q192239-2258CA del 2012387L747_T751S192240-2251 del 12 6210L747_T751del192240-2254 del 15 12369L747_T751P192239-2251C del 1312383E746_T751del192236-2253 del 18 127282号反应体系19-Del（2）E746_S752A192237-2254 del 18 12367E746_S752V192237-2255T del 19 12384S768I202303GT 62413号反应体系S768IH773_V771insH202319-2320 ins CAC 123774号反应体系20-InsD770_N771insG202310-2311 i