（食品科学专业论文）柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究.pdf

柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 摘要 植物单宁是一类重要的天然活性物质，在植物界分布十分广泛，对植物的生 长及利用有着多方面的影响，其在化工、纺织、食品、医药、农林等方面已得到 广泛的应用。本文以柿子为原料，建立了适于测定柿单宁的硫酸香草醛比色方 法，比较了柿子各部位提取物的抗氧化活性；采用大孔树脂对柿单宁进行分级， 获得了不同的级分并对各级分活性进行了研究分析；建立了以醋酸为介质水解柿 子高分子单宁的最佳工艺条件，并对其水解产物的活性进行了分析；同时探索了 间苯三酚体系下降解柿子高分子单宁的最佳工艺条件。研究结果如下： 1 研究了测定柿单宁的硫酸香草醛法。 对酸化香草醛法作了改进，建立了适合于柿单宁的比色测定方法，即以h 2 s 0 4 作为反应的酸性介质，比色条件为：o 5m l 样品甲醇溶液+ 2 5m l1 香草醛甲 醇溶液+ 2 5m l 5m o v m l h 2 s 0 4 甲醇溶液，于3 0 避光反应2 0 r a i n 后测定a s o o n l i l 。方法评价结果表明，本方法重现性好、回收率高( 1 0 2 1 0 7 ) 。 2 分析比较了柿子各部位提取物的抗氧化活性。 结果表明柿子各部位提取物对o h 、d p p h 和a b t s + 均具有较高的清除能 力，且呈明显的剂量效应关系，其清除效果在各个体系中存在一致性：柿肉提 取物 柿皮提取物 柿核提取物 柿蒂提取物，且柿子提取物对o h 、d p p h 的 清除能力明显高于同浓度的葡萄籽原花青素；而对a b t s + 的清除效果较同浓度 的葡萄籽弱。 3 研究了采用树脂方法将柿单宁进行分级，并比较了各级分间的抗氧化活性。 结果表明采用a b 8 大孔树脂通过逐步提高乙醇浓度可以将柿单宁按聚合度 由低到高的顺序依次洗脱下来。通过比较其在不同抗氧化体系中的抗氧化活性， 显示各级分都具有较好的清除自由基效果，且呈明显的剂量效应关系。在a b t s 体系中，各级分的抗氧化效果与分子量没有明显的相关性，在水杨酸水溶液体系 中，分子量小的级分的抗氧化效果优于分子量大的级分的抗氧化效果。 4 研究了柿单宁的水解工艺。 结果表明柿单宁醋酸水解的最佳工艺条件为水解温度7 0 、水解时间3 0 m i l l 、样品浓度2m g m l ，样品与醋酸的体积比为1 ：2 。柿单宁水解前后的抗氧 化活性无明显变化，在d p p h 体系中略有提高，在水杨酸体系中略有降低，可以 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 认为醋酸水解不影响柿单宁的抗氧化活性。 5 研究了柿单宁在间苯三酚体系中的最佳降解条件。 结果表明其最佳工艺条件为，在2m g m l 的柿单宁甲醇溶液中含有0 2m o l l 的h c l 、6 0m g m l 的间苯三酚和5m g m l 的抗坏血酸。将此溶液于7 5 c 下反应 9 0m i n 。 关键词：柿单宁；硫酸香草醛法；抗氧化活性；分级；水解；间苯三酚体系 i i 柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 a b s 仃a c t v e g e t a b l et a n n i ni sak i n do fa b u n d a n ta n di m p o r t a n tn a t u r a la c t i v em a t e r i a l ， w h i c hh a sv a r i o u si n f l u e n c eo nt h eu s ea n dg r o w t ho fp l a n t i ti sw i d e l yu s e di nf i e l d s o fc h e m i c a l e n g i n e e r i n g ，w e a v i n g , f o o d ，m e d i c i n e a n d a g r i c u l t u r e t h e h 2 s 0 4 v a n i l l i na s s a yf o rq u a n t i t a t i o no fp e r s i m m o nt a n n i n , a n dt h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t i e so fe x t r a c t sf r o md i f f e r e n tp a r t so fp e r s i m m o na n df r a c t i o n so fp e r s i m m o n d a n n i no b t a i n e db ym a c r o p o r o u sr e s i n , a sw e l la st h eo p t i m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o no f p e r s i m m o nt a n n i na n dt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so ft h eh y d r o l y s i sp r o d u c tw e r es t u d i e d t h eo p t i m a ld e g r a t i o nc o n d i t i o n so fp e r s i m m o nt a n n i ni np h l o r o g l u c i n o ls y s t e mw e r e a l s os t u d i e d t h er e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 s t u d yo i lh 2 s 0 4 - v a n i l l i na s s a yf o rp e r s i m m o nt a n n i n a c i d - c a t a l y z e d v a n i l l i na s s a yw a si m p r o v e df o rq u a n t i t a t i o no ft a n n i ni n p e r s i m m o nb yt h eu s eo fh 2 s 0 4a sa c i dm e d i u m ，p r o p e rr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e o b t a i n e d 勰f o l l o w i n g ：a f t e r0 5m lm e t h a n o ls o l u t i o no fp e r s i m m o nt a n n i nw a s m i x e dw i t h2 5m l1 v a n i l l i ni nm e t h a n o l ，2 5r n l5m o l m lh 2 s 0 4i nm e t h a n o l w a sa d d e d ，t h er e a c t i o nw a sc a r r i e do u ta t3 0 。cf o r15m i n u t e sw i t h o u tl i g h ta n dt h e a b s o r b a n c ea t5 0 0n n lw a st h e nm e a s u r e d e v a l u a t i o no ft h em e t h o dw a sp r o v e dt h a ti t h a dg o o dr e p e a t a b i l i t ya n dh i g hr e c o v e r y 2 s t u d yo nt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fd i f f e r e n tp e r s i m m o np a r t s e x t r a c t s t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fp e r s i m m o ne x t r a c t sf r o md i f f e r e n t p a r t s o f p e r s i m m o n ( p e e l ，p u l p ，c a l y xa n ds e e d ) w e r ec o m p a r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e e x t r a c t sf r o md i f f e r e n tp a r t so fp e r s i m m o nh a ds t r o n gs c a v e n g i n ga c t i v i t i e so i lo h 。， d p p h ，a n da b t s + t h es c a v e n g i n ge f f e c t si na l lt e s t e ds y s t e m sw e r ei n t h e f o l l o w i n go r d e r ：p u l pe x t r a c t p e e le x t r a c t s e e de x t r a c t c a l y xe x t r a c t t h e s c a v e n g i n ge f f e c t so fp e r s i m m o n e x t r a c t so no h 。a n dd p p h w e r eh i g h e rt h a nt h a to f g r a p es e e de x t r a c t ，t h o u g hi tw a sal i a l el o w e rt h a nt h a to fg r a p es e e de x t r a c to n a b t s + 3 s t u d i e so np e r s i m m o nd a n n i nf r a c t i o n a t i o na n dt h ef r a c t i o n s a n t i o x i d a n t a c t i v i t i e s m 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 f r a c t i o n a t i o no fp e r s i m m o nt a n n i na c c o r d i n gt op o l y m e r i z a t i o nd e g r e ec a l lb e p e r f o r m e do na b 8r e s i n b yd u t i o nw i t hi n c r e a s i n ge t h a n o lc o n c e n t r a t i o n , t a n n i n w e r er e c o v e r e da c c o r d i n gt oi n c r e a s i n gp o l y m e r i z a t i o nd e g r e ei ns e q u e n c e t h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fa 1 1f r a c t i o n sw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l lt h e f r a c t i o n sh a ds t r o n ga n t i o x i d a n ta c t i v i t i e si nad o s e d e n p e n d e n tm a n n e r t h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so ft h ef r a c t i o n sh a dn or e l a t i o nw i t ht h ep o l y m e r i z a t i o nd e g r e e i na b t ss y s t e m ，t h o u g ht h ef r a c t i o nw i t hl o w e rp o l y m e r i z a t i o nd e g r e e ss h o w e d h i g h e ra n t i o x i d a n ta c t i v i t i e st h a nt h a tw i t hh i g h e rp o l y m e r i z a t i o nd e g r e e si ns a l i c y l i c a c i ds y s t e m 4 s t u d y0 1 1t h ep e r s i m m o nt a n n i nh y d r o l y s i s t h eo p t i m a l h y d r o l y s i sc o n d i t i o no fp e r s i m m o nt a n n i nw a sa sf o l l o w i n g ： p e r s i m m o nt a n n i nc o n c e n t r a t i o n ，2m g m l ，v o l u m er a t i oo fp e r s i m m o nt a r l r l i n a q u e o u ss o l u t i o nt oa c e t i ca c i ds o l u t i o n ，1 ：2 ( v v ) ，h y d r o l y s i sa t7 0 。cf o r3 0m i n t h e h y d r o l y s i sp r o d u c t so fp e r s i m m o nt a n n i nh a ds i m i l a ra n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw i t h p e r s i m m o nt a n n i n 5 t h ed e g r a t i o no fp e r s i m m o nt a n n i ni np h l o r o g l u c i n o ls y s t e mw a ss t u d i e d i t so p t i m a lc o n d i t i o nw a st h a tt h er e a c t i o ns y s t e mc o n t a i n e d2m g m lp e r s i m m o n t a n n i nm e t h a n o ls o l u t i o n ，0 2m o l lh c l ，6 0m g m lp h l o r o g l u c i n o la n d5m g m lv c ， a n dr e a c t e da t7 5 f o r9 0m i n k e yw o r d s ：p e r s i m m o nt a n n i n ；h 2 s 0 4 一v a n i l l i na s s a y ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ； f r a c t i o n a t i o n ；h y d r o l y s i s ；p h l o r o g l u c i n o ls y s t e m 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 季 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导癖指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：砾美f 2 时间： 加年多月彦 日 学位论文作者签名：了乐美红导师签名：一 签名呲卢一年占月9 日 签名魄功年多月汐日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 第一章前言弟一早刖苗 世界柿科( e b e n a c e a e ) 植物有d i o s p y r o sl 、e u c l e a 和l i s s o c a r p ab e n t n 三 个属共5 0 0 多个种，柿属( d i o s p y r o ) 植物在全世界约有1 9 0 种，主要分布于热带和 亚热带( 王仁梓，1 9 8 2 ) 。据统计，2 0 0 4 年全世界柿的栽培面积约为3 5 7 1 0 4 h m 2 ， 总产量2 4 2 8 x 1 0 4 t ，亚洲、欧洲、北美洲和非洲均有分布。我国是柿属植物 ( d i o s p y r o ss p p ) 的原产中心之一和柿( d k a k ) 的原产地，柿属植物种质资源 丰富，柿树栽培历史悠久，栽培面积和产量世界第一。2 0 0 7 年，我国柿收获面积 占世界总面积的8 9 7 ，柿产量占世界总产量的7 0 o 。我国历代医学家对柿子 的作用均有著述，梁代陶弘景所著名医别录中说：“柿有清热、润肺、化痰 止咳。”据本草纲目记载：“柿乃脾肺血分之果也，其味甘而气平，性涩而能 收，故有健脾、涩肠、止血之功。”清代著名医学家王士雄所撰随息居饮食谱 中说：“鲜柿甘寒。养肺胃之阳，宜于火燥津枯之体。乾柿甘平。健脾补胃、润 肺涩肠、止血充饥、杀疳、疗痔、治反胃。”现代食品和医学研究表明柿果含有 丰富的营养成分，因而具有重要的保健价值。 柿果与其他水果相比，最大的区别在于它含有高出其他水果十多倍甚至几十 倍的单宁类物质，因而，柿果的品质和加工、贮藏特性不同于其他果实。本文综 述了国内外学者有关柿子的研究成果，阐述了柿单宁的组成、分子结构、提取、 检测方法及其功能应用等研究概况。 1 植物单宁及其分类 “单宁”的定义随着人们对其认识的不同而进化，1 7 9 6 年对其定义为“鞣皮成 革”的化学物质，可与明胶、金属盐发生沉淀反应。1 9 6 2 年b a t e s m i t h 提出了较为 确切的定义，即单宁是指分子量在5 0 0 3 0 0 0 之间，能沉淀生物碱、明胶及其他蛋 白质的酚类物质( 孙达旺，1 9 9 2 ) 。1 9 8 1 年以来h a s l a m 等人认为植物单宁属于多 酚类化合物，将植物单宁又改称为植物多酚( p l a n t p o l y p h o n i e s ) 。 植物单宁的分类方法较多，早期依用途不同而异。1 9 2 0 年f r e u d e n b e r g 按照单 宁的化学结构特征，首次提出了科学的分类方法，将单宁分为水解单宁 ( h y d r o l y s a b l et a n n i n s ) 和缩合单宁( c o n d a n c e dt a n n i n ) ，这个分类至今仍然得到公 认。水解单宁( 或称可水解单宁) 为桔酸或与桔酸有生源关系的酚羧酸与多元醇组 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 成的酯，分子内的酯键在酸、酶或碱的作用下易于水解，产生多元醇及酚羧酸。 由于产生酚羧酸不同，水解单宁又可分为桔单宁( g a l l o t a n n i n s ) 及鞣花单宁 ( e u a g i t a n n i n s ) 。缩合单宁是羟基黄烷类单体组成的缩合物，单体之间以c c 键相 互连接，在水溶液中不易分解，在强酸作用下，缩合单宁发生聚缩，产生暗红棕 色沉淀，为羟基黄烷3 醇( 衍生物称为儿茶素类) 和羟基黄烷3 ，4 二醇( 衍生物称 为无色花色素) 的聚合物。这种物质不能被水解，在酸、碱或酶的作用下氧化脱 水，缩合成高分子红棕色、不溶于水的“鞣红”沉淀。 因此根据此分类法可将柿单宁分为柿水解单宁和柿缩合单宁。研究报道柿单 宁中以柿缩合单宁为主，也是涩味的主要呈味者，新鲜的涩柿果实中缩合单宁占 鲜果重量的2 左右( 费学谦等，1 9 9 4 ) 。 根据柿单宁在醇溶液的溶解性不同，可分为两类：一类为可溶性单宁( s o l u b l e t a n n i n , s t ) ，用无水甲醇可以提取，纸层析时可迁移，为单宁的单体或低聚体； 另一类为不溶性单宁( i n s o l u b l et a n n i n , i s t ) ，不溶于无水甲醇，而溶于甲醇的水溶 液，为单宁的高聚物。纸色谱上r 值为零，不溶性单宁并非真正不溶，当环境条 件( 如温度、酸碱度) 改变时会成为可溶性单宁( 胡耀星和谢笔钧，1 9 9 1 ；何明， 1 9 9 1 ；t a i r a , 1 9 9 8 ) 。许多研究表明，可溶性单宁是产生涩味的主要物质。 2 柿单宁的组成及分子结构研究 关于柿单宁的化学组成及分子结构的研究是由日本学者开始的。1 9 2 3 年， k o m a t s u 和m u t s u n a m i 最早从未成熟的涩柿汁中提取出一种酚类物质，并把这种 物质称作“柿子素”，基本分子式是c 1 4 h 2 0 0 9 ，认为柿单宁除“柿子素”外，可能还 存在桔酸( g a l l i ca c i d ) 和间苯三酚( p h l o r o g l u c i n ) 。后来研究表o 韭j k o m a t s u 的研究不 是完全正确的。19 5 4 年b a t e s m i t h 用色谱方法系统研究无色花色苷在植物中的分 布时发现，无色花色苷主要存在于木植性的植物及其果肉内，它的分布与当时被 植物界称为“单宁”的物质极为相似，认为植物单宁就是无色花色苷，第一次把单 宁与花色素( a n t h o c y a n i d i n ) 联系在一起，这对以后研究柿单宁分子结构具有重要 的指导意义。 1 9 6 2 年，i t o 和o s h i m a 用甲醇提取引起涩味的可溶性柿单宁，用强酸处理产 生了花翠素和葡萄糖两种物质，并通过进一步研究，表明花翠素的主要成分是无 2 柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 色翠雀啶( 1e u e o d e l p h i n d i n ) ，在其c 3 位上连有一个葡萄糖基。后来i t o 和j o s l y n 继 续研究认为，柿单宁不只是无色翠雀啶，可能还含有较复杂的其他成分。当用强 酸热降解柿单宁，不仅有大量的无色翠雀啶生成，而且有桔酸、桔儿茶素 ( g a l l o c a t e c h i n ) 和桔儿茶素桔酸( g a l l o c a t e c h i ng a l a t e ) 产生。他们认为柿单宁在柿果 中是由几种低分子量的化合物通过c c 键连结而成的一类高分子化合物，首次提 出了柿单宁是以翠雀啶( d e l p h i n i d i n ) 为主的缩合单宁学说( 1 9 7 8 ) 。 1 9 7 7 年，m a t s u o 和n o 总结前人研究成果，认为柿单宁具有以下特征：( 1 ) 高 浓度的柿单宁易相互缩合凝聚，由水溶性变成不溶性；( 2 ) 强酸降解柿单宁会产 生大量的翠雀啶和少量的花青啶( c y a n i d i n ) ：( 3 ) 柿单宁在正丁醇、异丙醇、丙酮、 乙酸乙酯等有机溶剂中很难溶解；( 4 ) 柿单宁分子中a 环上的酚羟基数目是儿茶素 a 环上羟基数目的2 倍。用瓜光谱和纤维素t l c 分离鉴定采用磷酸氢二钾沉淀未成 熟涩柿的所获得的柿单宁，结果表明柿单宁是含有多个羰基组的高聚化合物，进 一步证明了柿单宁就是花色素的学说( 1 9 7 8 ) 。若用2m o l l 的盐酸或硫酸降解 柿单宁产生翠雀啶和花青啶，其数量比为1 ：3 ，但生成的这两种物质极不稳定， 产生的同时又逐渐聚合生成无定形红褐色鞣质( p r a o b a p h e n ) 。在研究单宁分子结 构的过程中发现，苄硫醇对柿单宁分解具有很好的作用，能够打开单宁二聚物、 三聚物及寡聚物的c c 连结键，把单宁逐个分解成单体化合物。苄硫醇降解的柿 单宁用硅胶t l c 分离，得到了f 1 、f 2 、f 3 和f 4 四种不同产物，其数量比为1 ：1 ：2 ： 2 。当用单宁酶处理f 2 时，会产生f 1 和桔酸；处理f 4 时产生f 3 和桔酸，说明f 2 中 有f 1 成分，f 4 中有f 3 ，且f 3 和f 4 中都有桔酸。用h - n m r 鉴定，结果表明四种化 合物分别是儿茶素、儿茶素3 桔酸、桔儿茶素和桔儿茶素3 桔酸，这与i t o 和j o s l y n 研究结果相符。这四种单体化合物通过c - 4 、c 6 或c 8 位相互连结成键，聚合构 成一个重复单元，几个重复单元再构成一个多聚体，其f 1 、f 2 、f 3 和f 4 数量比 为1 ：l ：2 ：2 ( 张宝善，1 9 9 7 ：i n o u ea n dk a w a k i t a ，2 0 0 6 ) ( 图1 ) 。多聚体聚合程度 大小直接影响柿的涩味强度，聚合度在一定范围内，涩味强度随聚合度的增大而 提高。 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 o h 表儿茶素 o h h o 桔儿茶素 o h 儿茶素3 梧酸酯 o h 桔几茶素3 桔酸酯 图1 柿单宁的化学组成及化学结构 n h f i g 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so fk a k it a n n i na n dr e l a t e dc a t e c h i nc o m p o u n d s 4 柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 3 植物单宁的提取 植物单宁提取常用的方法有水提取法、有机溶剂水提取法和仪器辅助提取 法。植物中的单宁类物质通常以结合态与蛋白质、纤维素结合在一起，一般不易 提出，通常选用有机溶剂或水提取，具有断裂氢键的作用。同时由于有机溶剂的 渗透性较差，一般不单独使用，常需要水作为传质剂。 3 1 水提取法 水是单宁的良好溶剂，m a s q u e l i e r ( 1 9 8 5 ) 最早从松树皮中用沸水粗提、乙 酸乙酯纯化得到单宁物质。陈栓虎等( 1 9 9 6 ) 采用含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠的水 溶液提取石榴皮中的单宁。在水中添加亚硫酸盐可提高单宁的提取得率，但不利 于后续的除杂。水作为提取剂时，浸提耗时长，温度高，容易造成单宁的损失。 同时水的极性较大，溶出杂质也较多。 3 2 有机溶剂水提取法 有机溶剂和水的复合体系使用更为普遍，可选的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙 醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等。甲醇、丙酮和乙醇是提取单宁常用的有机溶剂， 它们对单宁有很好的溶解性，它们的极性大小顺序为甲醇 乙醇 丙酮。乙醇是常 用的提取溶剂，价格低廉，来源丰富。甲醇和丙酮水溶液( 5 0 7 5 ) 对单宁都有 较好的提取性能，同时也多用做单宁含量测定时的提取溶剂。丙酮水体系对单 宁溶解能力最强，能够打开单宁蛋白质的连接键，减压蒸发易除去丙酮，是目 前使用最普遍的溶解体系之一。熊何健等( 2 0 0 4 ) 比较了甲醇、乙醇、丙酮水溶 液对多酚的提取效果，结果表明7 0 丙酮水溶液为最好溶剂。赵晓虹等( 2 0 0 1 ) 比较了多种试剂对竹子单宁提取效果的影响，结果表明丙酮的提取效果较佳。丙 酮水溶液提取效果好的原因：原花青素分子含有多个苯环和醚键，油溶性较强， 同时又有大量的羟基连接在分子骨架上，在水中具有很好的溶解性，拥有油水双 溶性的丙酮与之相互匹配，原花青素的溶解度自然增加，其提取率相应得到提高。 5 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 3 3 仪器辅助提取法 超临界c 0 2 萃取、超声波辅助提取越来越多的用于单宁的提取。超临界c 0 2 萃取率高，而且使单宁不受到空气和光的影响，姜萍等( 2 0 0 5 ) 采用超临界c 0 2 法萃取五倍子中的单宁酸，得率为5 7 8 3 ，萃取得到的单宁酸含量大于9 6 。 但超临界c 0 2 萃取法所需设备昂贵，操作要求高，推广使用比较困难。超声波法 应用比较广泛，超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌等 特殊作用，可以破坏植物的细胞壁，使溶剂渗透到细胞中令其中的化学成分溶于 溶剂中，从而提高提取效率，在提取原花青素之类的热敏性物质显示出优越的性 能。陆晶晶等( 2 0 0 8 ) 比较了水浴回流提取、超声波提取、微波提取等方法从石 榴皮中提取单宁，微波提取单宁得率为3 7 4 ，超声提取单宁得率为2 7 9 ，水 浴回流的单宁得率仅为2 5 o 。微波加热可以使有液泡类的细胞因温度迅速升高 而瞬间膨胀破碎，使胞内物质释放出来，因此特别适于植物细胞胞内物质的提取。 4 植物单宁的含量测定 4 1 植物单宁含量测定的经典方法 单宁的经典含量测定方法有很多种，重量法、容量法、比色法、分光光度法 等经典方法均可作为单宁的含量测定方法。它们的特点是简单、容易操作，不需 要贵重的仪器，因此特别在工业中被广泛应用，如：用于饮料和工业废水中鞣质 的测定等，其中，最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合滴定法、比 色法和分光光度法。 4 1 1 皮粉法 皮粉法是国际公认的单宁含量测定方法。皮粉中的主成份是蛋白质，单宁可 通过分子中的酚羟基与蛋白质中的酰胺基形成氢键而结合成不溶于水的沉淀，因 此通过重量分析可测定单宁含量。皮粉法适用的范围非常广，我国药典1 9 9 5 年版 中单宁含量的测定采用的就是皮粉法。它的缺点是耗用样品多，测定时间长，而 且没有选择性，其测定结果往往偏高，故一般只适用于测定单宁含量高的生药， 样品较少或含量低的则不适于测定。重量法一般使用皮粉，也可用其它沉淀剂， 6 柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 刘宁( 1 9 9 5 ) 对矮杨梅中的鞣质进行了分析，结果略偏高。陈红英等( 2 0 0 6 ) 使 用络皮粉紫外分光光度法对塔拉粉乙酸乙酯提取物单宁的含量分布进行了测 定。苏小宝等( 2 0 0 7 ) 采用皮粉法与胶体滴定法相结合建立了木麻黄枝叶中单宁 含量的快速测定方法。 4 1 2 干酪素法 干酪素法的特点在于干酪素能选择性地结合有生理活性的单宁，因此测出的 是有生理活性的单宁而无生理活性的单宁如鞣酐则不被测定，选择性比皮粉法要 高，一般适于测定含量较低的单宁。程立方等( 1 9 9 5 ) 用干酪素法测定y 9 n , u 柏叶 中有生物活性的低含量单宁。 4 1 3 高锰酸钾法 利用单宁有较多酚羟基易被氧化的性质，用高锰酸钾滴定样品液中单宁。高 锰酸钾法选择性较小，易受样品中还原性物质干扰，误差较大，最大的优点是操 作简单。除了高锰酸钾外，常用的氧化滴定剂还有硫酸铈等。 4 1 4 络合滴定法 单宁分子内的多个邻位酚羟基可作为多基配体与一个中心离子，如：铜、锡、 铋、锌、汞、铁等络合，形成环状的螯合物，在不同的p h 值下产生沉淀。络合 滴定法就是利用单宁这一性质，通过用e d t a 返滴定过量金属离子来确定单宁的 含量。杨伟( 1 9 9 2 ) 对络合滴定法和高锰酸钾法测定啤酒花中单宁含量进行了对 比，结果表明络合滴定法的准确度和精密度要高，终点更清晰明显。杨连利等 ( 2 0 0 4 ) 用络合法测定单宁含量，建立了从元宝枫种壳中提取单宁的最佳工艺条 件。 4 1 5 比色法 利用某些试剂与单宁发生颜色反应，通过吸光度测定样品中的单宁含量， 该方法在目前的应用最为广泛。其中，f o l i c i o c a l t e u s 方法可以测定总酚含量， 正丁醇盐酸和香草醛法盐酸专门用于样品中黄烷醇类多酚的定量测定，具有灵 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 敏性、专一性和简单迅速的特点，在其他多酚共存的情况下能选择地测定黄烷醇 类多酚，并可用于微量测定。 4 1 5 1 直接紫外分光光度法( 傅武胜和赵道辉，2 0 0 2 ) 原理：利用单宁在紫外区2 8 0n n l 处具有最大紫外吸收，通过测定吸光值直 接测定单宁含量的方法。研究中发现此波长处许多物质有明显的吸收，特异性不 明显，干扰物多，一般只用于精提物的测定，适用范围狭窄。 4 1 5 2 正丁醇盐酸法( b a t e s m i t h 法1 ( 1 9 7 5 ) 原理：正丁醇盐酸法测定单宁是基于其花色素反应，即原花青素在热酸作 用下能产生红色物质，从而可用分光光度法进行测定。对于单体原花青素黄烷3 ， 4 二醇来说，c 4 位具有极强的亲电性，其醇羟基与c 5 ，c 7 上的酚羟基组成一 个苄醇系统，使得4 位碳易于生成正碳离子。在强酸作用下，正碳离子失去质子， 氧化生成花色素。对于聚合原花青素，其单元间连接键易在酸作用下被打开，下 部单元生成黄烷3 醇，上部单元生成花色素，如图2 所示。正丁醇盐酸法 图2b a t e - s m i t h 反应 f i g 2b a t e s m i t hr e a c t i o n 正丁醇盐酸法测得的原花青素含量偏低，究其原因可能是由于正丁醇盐酸 法对原花青素化学结构的依赖性大，选择性高，对于儿茶素等单体原花青素不反 应，而对于原花青素的聚合体，其花色素反应也不可能很完全。 4 1 5 3 铁盐催化比色法( p o r t e r 法) ( p o r t e re ta 1 ，1 9 8 6 ) 原理：同b a t e - s m i t h 法，依据原花青素在稀酸的作用下，形成中间产物， 柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 然后再形成花青素，这个自动氧化过程必须要有氧的参加。一定量的过渡金属离 子，如c u 2 + 、m n 2 + 、f e ”、f e s + 等离子或酮类，如对苯醌、0 【萘醌等氧化剂的存 在，均能促进反应的进行，但过量的醌类及c u 2 + 、m n 2 + 会引起干扰，采用铁盐 较为适合，尤其是三价铁盐，如硫酸高铁铵。由于b a t e - s m i t h 法测定的结果重现 性很差，并且原花青素在此条件下反应不是很彻底。因此p o r t e r 等人对b a t e s m i t h 法进行了改进。改进之处主要是在试剂中添加了f e 3 + ，以提高反应的程度和颜色 的稳定性。实验证明p o r t e r 法重现性较好，花色素反应较彻底。 4 1 5 4 香草醛一盐酸硫酸法( v a n i l l i n a s s a y 香兰素检测法) ( p r i e ee ta 1 ，1 9 7 8 ) 原理：香草醛法基于酚醛缩合反应，如图3 ，在酸催化作用下，原花青素 分子中的间苯三酚与香草醛( v a n i l l i n ) 发生缩合而形成有色的正碳离子，即醛以a 环上的6 、8 位为亲核活性中心，通过亚甲基( c h 2 一) 桥键与多酚分子交联，形成 大分子，使a 环产生红色的发光基团( k = 5 0 0n m ) 。由于香草醛和多酚类物质的 对一的特异结合，根据此正碳离子吸光度可测定出原花色素含量。采用分光光 度法测定其吸光度，根据标准曲线即可得到样品中原花色素含量，盐酸或硫酸均 可作为反应过程的催化剂。 4 - o h o h 图3 酚醛缩合反应 f i g 3p h e n o l - f o r m a l d e h y d ec o n d e n s a t i o n 该法准确、可靠，由于该法所依赖的反应基团为原花青素a 环的间苯二酚 或间苯三酚，( + ) 儿茶素或( ) 表儿茶素及其低聚体等都能参加反应，可同时 测定单体和聚合体的总含量。 4 1 5 5f o l i n c i o c a l t e a u 法( s i n g l e t o na n dr o s s i ，19 6 5 ) 原理：在碱性溶液中，酚类化合物可以将钨铝酸还原，生成蓝色的化合物， 颜色的深浅与多酚含量呈正相关，蓝色化合物在7 6 0n n l 处有最大吸收。 9 l 卜 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 此法适合于测定总酚含量，对原花青素缺乏专一性。美国葡萄籽方法评定委 员会同意采用此种方法来测定葡萄籽提取物中的总多酚，但同时建议此方法还需 进一步完善，以确认单体和原花青素同f o l i n c i o c a l t e a u 试剂反应的差异。 4 2 单宁含量测定的新方法 近年在单宁含量测定方面也出现了一些较新的方法。这些方法包括高效液相 色谱法、原子吸收分光光度法、薄层扫描法、热透镜光谱法、高灵敏示波电位动 力学分析法和电化学传感器法等。它们具有高灵敏度、高准确度和不易受干扰的 共同特点，将会成为鞣质分析的主要研究手段。 4 2 1 高效液相色谱法( h p l c 、) 高效液相色谱在单宁分析中的应用，为单宁定量分析开辟了非常有前景的道 路，已成为单宁含量测定非常准确、有效的方法。但由于对照品的限制以及分析 手段的制约，目前只能测定提取物中单体和某些低聚体的含量。刘延泽等( 1 9 9 1 ) 利用反相高效液相色谱成功地测定了茶叶7 0 丙酮提取物及其抗癌有效成份 e g c g 。己报道的还有槟榔花( 何和明，1 9 9 6 ) 、茶叶( 孤田功，1 9 9 3 ) 、余甘 子( 郭佳莉等，2 0 0 7 ) 、五倍子( 姜宁等，2 0 0 7 ) 中单宁含量的测定。 液相色谱法在定量测定时，首先要考虑到需要合适的标准品，其次要求单宁 按照一定方式分离形成独立的色谱峰。由于植物体内的单宁类物质往往是一种多 分散体系，聚合度从数个到数十个不等，各组分间性质相似，因此实际上人们很 难通过分离纯化获得单一结构的纯单宁，而往往只能得到一定分子量范围的单宁 组分。因此用液相色谱法定量测定单宁的含量有一定的困难，反相色谱一般测定 聚合度为三以下的原花青素，最大到六聚体；正相色谱能够测定聚合度到十的原 花青素，但由于高聚物单体还无法得到，只能借助质谱等检测器进行定性检测， 还不能定量测定其含量。 4 2 2 原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是利用单宁与金属离子发生沉淀反应后通过测定过量 金属离子间接测定单宁的含量的方法，沉淀剂一般为铜离子的乙酸铵溶液。该方 1 0 柿单宁抗氧化活性及水解工艺研究 法简单快速，不受颜色及共存物质的干扰。y e b r a 等( 1 9 9 5 ) 利用原子吸收分光 光度法测定了白酒和茶叶中单宁含量，并结合流动注射分析技术用于工业上的实 时质量监测。杜小燕等( 1 9 9 8 ) 用此法间接地测定了五种茶叶中单宁的含量，线 性响应范围较宽。张颖等( 2 0 0 7 ) 测定了土茯苓中单宁含量，此法的测定灵敏度 高。 4 2 3 其他测定方法 蔡毓琼( 1 9 9 8 ) 首次报道了薄层扫描法在鞣质测定中的应用，他利用岛津 c s 9 3 0 型薄层扫描仪对余甘子喉片中没食子酸的含量进行了测定，该方法测定 鞣质含量简单、快速、稳定，具有样品处理简单、不需任何显色剂的特点，大大 增强了结果的准确性和可靠性，适于推广。 丁亚军和吴庆生( 1 9 9 6 ) 利用高灵敏示波电位动力学分析法测定了茶叶中的 单宁含量，该方法利用k b r 0 3 和k b r 的氧化还原反应与茶单宁的溴化反应之间 的差异，将动力学分析法和示波电位法结合起来，能够测定彬l 级的茶单宁， 而且直观灵敏，测定范围宽，不受颜色及沉淀的影响。适于饮料及生物样品中痕 量单宁的测定。 5 柿单宁的生物活性 我国将柿果作为药用的历史悠久，现代食品和医学大量研究表明，柿果具有 多种药理和食用保健价值。 5 1 柿单宁的抗氧化性 单宁的抗氧化性体现在两个方面，一方面通过还原反应降低环境中的氧含 量，另一方面则是通过作为氢供体释放出氢与环境中的自由基结合，中止自由基 引发的链锁反应，从而阻止氧化过程的继续传递和进行。根据n o 和o s h i m a r 研究 表明柿单宁的分子结构中，具有一个邻苯二酚和一个邻苯三酚，而邻苯二酚和邻 苯三酚的邻位酚羟基很容易被氧化，从而消耗环境中的氧，并且能吸收活性氧等 自由基。顾海峰等( 2 0 0 7 ) 研究表明，柿子高分子单宁在脱氧d 核糖体系、甲基 紫体系、水杨酸体系、邻苯三酚自氧化体系和亚油酸脂质过氧化体系中均具有强 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 抗氧化能力，且呈明显的剂量效应关系，效果均强于相同浓度的葡萄籽原花青 素。 5 2 柿单宁的抗微生物性 单宁类物质的多元酚结构赋予他们众多的理化特性，比如能与蛋白质、多糖 和生物碱等发生反应，使其理化行为发生改变。所以在微生物抑制方面有其独特 的优势。例如在食品和化妆品用加柿果汁的收敛质，单宁和( 或) 多酚作为活性成 分用于杀菌。k a w a s e 等( 2 0 0 3 ) 对柿皮分馏提取物应用于细胞毒活性、多药耐 药性逆转作用、抗艾滋活性和抗幽门螺旋杆菌进行了研究， 而a k i y a n l a 等( 2 0 0 1 ) 对柿单宁对葡萄状球菌的抗菌作用进行了研究。张雅利等( 2 0 0 7 ) 研究表明柿皮、 柿蒂、柿肉提取物对枯草芽孢杆菌均具有一定的抑菌效果，认为其有效成分为黄 酮类、三萜类和水解单宁。 5 3 柿单宁的止血作用 近年研究表明( 1 9 9 8 ) ，柿单宁具有止血作用，可能由于柿单宁能直接作 用于血管，有短暂的收缩血管作用；有较弱的促血小板聚集作用；可以促进 血小板血栓的形成，此血栓类似动脉中的白色血栓，当血栓形成之后，能够机械 性堵塞伤口，从而达到止血的效果。这些作用的化学机理都离不开柿单宁的收敛 性，即柿单宁能与蛋白质发生反应，产生沉淀。 5 4 其他生理活性 李丙菊( 2 0 0 0 ) 研究认为含柿果缩合单宁的突变抑制剂用于防止u v 诱发的 皮肤癌和皮肤老化是有效的，柿果中的缩合单宁对鼠伤寒沙门氏菌具有抑制突变 的活性。日本医学界在研究单宁对多种毒素的抑制作用中发现，柿单宁具有能抑