超声波提取野菊花总黄酮及含量测定.doc

毕 业 设 计（论文）2011 届 题 目 超声波提取野菊花 总黄酮及含量测定 专 业 制药工程 学生姓名 李明艳 学 号 07092206 指导教师 肖 莉 论文字数 完成日期 20 年 月 日 湖 州 师 范 学 院 教 务 处 印 湖州师范学院学士学位论文超声波提取野菊花总黄酮及含量测定07092206 李明艳（湖州师范学院生命科学学院，湖州 313000）摘要：本实验主要利用超声波提取技术提取野菊花中的总黄酮，用有机溶剂乙醇提取野菊花总黄酮的工艺路线，对所提取的总黄酮进行验证，并用分光光度计法测定其含量。在单因素提取的基础上，采取正交优化试验，探讨乙醇体积分数、液料比、提取时间对野菊花总黄酮提取工艺的影响，结果表明，影响野菊花总黄酮超声提取的主要因素为提取时间，其次为液料比、乙醇体积分数。最佳提取工艺条件为乙醇体积分数60，液料比25:1，提取时间80min，测得野菊花总黄酮为5.62%。在优选的工艺条件下进行提取，并利用紫外可见分光光度法对野菊花总黄酮的含量进行测定。该提取工艺简单，易操作。关键词：野菊花，总黄酮，超声波，提取Extraction of total flavonoids from chrysanthemum by ultrasonic and content determination 07092206 Li MingYan（School of Life Science，Huzhou Teachers College，Huzhou 313000 ）Abstract：This experiment using ultrasonic technology to extract the flavonoid in wild chrysanthemum. This process route is using organic solvent of ethanol to extract the flavonoids in wild chrysanthemum, to verify the extracting flavonoids, and its content determined by spectrophtometry. On the basis of single factor extraction orthogonal test be taken. The optimum extraction parameters of total flavonoids from Chrysanthemum indicum by ultrasonic were investigated including, the ratio of liquid and material, extraction timeIt was found that the orders of parameters affecting extraction efficiency were extraction time，the ratio of material and liquid and alcohol content. The optimal extraction conditions were obtained as followed：alcohol content 60, the ratio of liquid and material 25:1 and time 80 minUnder these conditions, the content of flavonoids reached 5.62. Extraction in the optimal process conditions, and used the Ultraviolet spectrophotometry for determination the content of the flavonoid in wild chrysanthemum. The extraction process is simple and easy to operate .Key words：chrysanthemum indicum；total flavonoids；ultrasonic；extraction目 录1 引言11.1 野菊花简介11.1.1 野菊花物化性质1.1.2 野菊花药理作用1.1.3 野菊花的临床应用1.1.4 野菊花的不良反应1.2 黄酮类化合物11.2.1 黄酮类化合物简介1.2.2 黄酮类化合物的理化性质1.2.3 黄酮类化合物的药理活性1.3 超声波简介31.3.1 超声波提取技术1.3.2 超声波提取的原理1.3.3 超声波提取的优点1.4 野菊花总黄酮提取方法研究概况41.4.1 热水提取法1.4.2 有机溶剂提取法1.4.3 碱液提取法1.4.4 微波辅助提取法1.4.5 超声波辅助提取法1.4.6 大孔树脂吸附法2 材料与方法52.1 实验材料52.1.1 试剂与仪器2.2 实验方法的确定52.2.1 对照品及对比实验溶液的制备2.2.2 标准曲线的制作2.2.3 供试液含量的测定2.2.4 对比实验结果分析2.3 实验方法与评价指标72.3.1 实验具体操作方法2.3.2 实验评价指标3 实验结果与讨论73.1 提取中主要影响因素的确定73.1.1 乙醇体积分数对总黄酮含量的影响3.1.2 乙醇体积对总黄酮含量的影响3.1.3 超声波提取时间对总黄酮含量的影响3.2 正交实验设计103.2.1 考察因素及水平3.2.2 试验与结果3.2.3 小结3.3 稳定性考察（验证实验）114 总结与展望124.1 总结124.1.1 溶剂的选择4.1.2 实验方法的选择4.1.3 实验流程4.1.4 各实验条件确定4.1.5 实验条件优势4.2 展望12参考文献13致 谢15湖州师范学院学士学位论文1 引言1.1 野菊花简介1.1.1 野菊花物化性质野菊花为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L）、北野菊（Chrysanthemum boreale Mak）或岩香菊（Chrysan themum lavandulaefolium FischMak）的头状花序1，别名为野黄菊花、苦薏、山菊花、甘菊花。野菊花头状花序类球形，直径1.52.5cm，棕黄色。总苞片45层，外层苞片卵形或卵状三角形，长2.53mm，外表面中部灰绿色或淡棕色，常被有白毛，边缘膜质；中层苞片卵形；内层苞片长椭圆形。总苞基部有的残留总花梗。舌状花l轮，黄色，皱缩卷曲，展平后，舌片长l1.3cm，先端全缘或23齿；筒状花多数，深黄色，气芳香，性味微寒，味苦、辛。现代药理研究证明：野菊花富含萜类和挥发油2、黄酮类化合物以及绿原酸等。野菊花尚含有山萮酸甘油酯、棕榈酸、多糖3、-胡萝卜素、蛋白质、氨基酸、嘌呤、胆碱、水苏碱、鞣质、维生素、叶绿素等成分。另外，不同品种和产地的野菊花都含有人体必需的多种微量元素，而且B、Ca、Mg、Fe的含量比菊花中的高。1.1.2 野菊花药理作用 抗病原微生物作用4,5 野菊花水提物和挥发油都具有抗菌的活性。 对心血管系统的作用6 野菊花黄酮具有明显的心脏保护作用。 具有降压作用7 有一定的降压效果而且降压作用缓慢、持久，是较理想的降血压药物。 对血小板聚集的影响 对血小板聚集功能有较强的抑制作用和解聚作用。 抗炎和免疫作用8,9 野菊花提取物和挥发油都有显著的抗炎、免疫抑制作用。 具有良好的解热作用 研究表明野菊花注射液具有良好的解热效果。1.1.3 野菊花的临床应用目前野菊花具有散风清热、消炎解毒、平肝明目、祛痰止咳、理气止痛、凉血止血、抗菌、抗病毒等功效10，临床多用于治疗各种急慢性感染性疾病（包括急慢性呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、急性乳腺炎、急性淋巴管炎以及急性感染性肝炎等疾病），亦用于治疗肿瘤、高血压病和高脂血症，以及对感冒、流行性脑膜炎的预防。此外，野菊花煎液口服或外用治疗皮肤痈毒疖肿疗效显著11。1.1.4 野菊花的不良反应野菊花对心脏、肝肾功能无明显影响，除偶有呕吐现象、胃部不适、食欲减退，肠鸣泄泻等症状，注射剂偶可引起腹泻，阴道后穹窿注射时，有一定刺激作用。临床不良反应少见。慢性给药亦无蓄积中毒现象。1.2 黄酮类化合物1.2.1 黄酮类化合物简介黄酮类化合物广泛分布于植物界，而且生物活性多种多样，引起了国内外的广泛重视，菊花中含有的黄酮类化合物主要包括黄酮及其苷、黄酮醇及其苷，是菊花药用的重要活性部位。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮（如图1-1）。黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。 多数科学家认为黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。经同位素标记实验证明了A环来自于三个丙二酰辅酶A，而B环则来自于桂皮酰辅酶A。图1-1 2-苯基色原酮化学结构式目前发现菊花中所含的黄酮类化合物有香叶木素、木犀草素、芹菜素、香叶木素7-O-D- 葡萄糖、木犀草素7-O-D- 葡萄糖苷、金合欢素7-O-D-葡萄糖苷、刺槐苷、金合欢素7-O-（6-O-乙酰）-D- 葡萄糖苷、金合欢素、山奈酚和异泽兰黄素。1.2.2 黄酮类化合物的理化性质黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定型粉末。黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH、-CH3）等的类型、数目及取代位置有关。一般来说，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查尔酮为黄色至橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类等因不存在共轭体系或共轭很少，故不显色。花色素及其苷元的颜色，因pH的不同而变，一般呈红（pH7）、紫（78.5）等颜色。 黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，易溶于稀碱液。黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性相应加大，而在有机溶剂中的溶解度相应减少。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有机溶剂。黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。1.2.3 黄酮类化合物的药理活性 心血管系统活性12-14不少治疗冠心病有效的中成药均含黄酮类化合物，研究发现芦丁、槲皮素、葛根素以及人工合成的立可定（recordil）等均有明显的扩冠作用；槲皮素、芦丁、金丝桃苷、葛根素、灯盏花素、葛根总黄酮、银杏叶总黄酮对缺血性脑损伤有保护作用；金丝桃苷、水飞蓟素、木犀草素、沙棘总黄酮对心肌缺血性损伤有保护作用；银杏叶总黄酮、葛根素、大豆苷元等对心肌缺氧性损伤有明显保护作用。此外，沙棘总黄酮、苦参总黄酮、甘草黄酮（主要为甘草素和异甘草素）具有抗心律失常作用。 抗菌及抗病毒活性木犀草素、黄岑苷、黄岑素等均有一定的抗菌作用；槲皮素、二氢槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；从菊花、獐牙菜中分离得到的黄酮单体对HIV病毒有较强抑制作用，大豆苷元、染料木素、鸡豆黄素A对HIV病毒也有一定抑制作用。 抗肿瘤活性黄酮类化合物的抗肿瘤机制多种多样15，如槲皮素的抗肿瘤活性与其抗氧化作用、抑制相关酶的活性、降低肿瘤细胞耐药性、诱导肿瘤细胞凋亡及雌激素样作用等有关；水飞蓟素的抗肿瘤活性与其抗氧化作用、抑制相关酶活性、诱导细胞周期阻滞等有关。 抗氧化自由基活性17,18大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化自由基作用，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂16，而黄酮类化合物的一些药理活性也往往与其抗氧化自由基相关12-14。 抗炎19、镇痛活性芦丁、羟基芦丁、二氢槲皮素等对角叉菜胶、5-HT及PGE诱发的大鼠足爪水肿、甲醛引起的关节炎及棉球肉芽肿等均有明显抑制作用；金荞麦中的双聚原矢车菊苷元有抗炎、解热、祛痰等作用；金丝桃苷、芦丁、槲皮素及银杏叶总黄酮等有良好的镇痛作用。 保肝活性水飞蓟素对中毒性肝损伤、急慢性肝炎、肝硬化等有良好的治疗作用；淫羊藿黄酮、黄岑素、黄岑苷能抑制肝组织脂质过氧化、提高肝脏SOD活性、减少肝组织脂褐素形成，对肝脏有保护作用；甘草黄酮可保护乙醇所致肝细胞超微结构的损伤等。 其他此外，大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等药理活性12-14。1.3 超声波简介1.3.1 超声波提取技术超声波是指频率为20千赫50兆赫左右的电磁波，它是一种机械波，需要能量载体介质来进行传播。超声波在传递过程中存在着的正负压强交变周期，在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来的密度；负相位时，介质分子稀疏、离散，介质密度减小。也就是说，超声波并不能使样品内的分子产生极化，而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。在工业应用方面，利用超声波进行清洗、干燥、杀菌、雾化及无损检测等，是一种非常成熟且有广泛应用的技术。超声波提取（也称为萃取）以其提取温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被应用于中药材和各种动、植物有效含量的提取20（包括提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等21-23），是替代传统工艺方法实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手段。1.3.2 超声波提取的原理超声波提取中药材的优越性，是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固液萃取分离。 加速介质质点运动。高于20 KHz声波频率的超声波的连续介质（例如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点（包括药材重要效成分的质点）的运动，使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。质点的加速度经计算一般可达重力加速度的二千倍以上。由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出药材基体而游离于水中。 空化作用。超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在中药材上，使其中药材成分物质被“轰击”逸出，并使得药材基体被不断剥蚀，其中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来。加速植物有效成份的浸出提取。 超声波的振动匀化（Sonication）使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品萃取更均匀。 中药材中的药效物质在超声波场作用下不但作为介质质点获得自身的巨大加速度和动能，而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击，所以能高效率并充分分离出来。 1.3.3 超声波提取的优点适用于中药材有效成份的萃取，是中药制药彻底改变传统的水煮醇沉萃取方法的新方法、新工艺。与水煮、醇沉工艺相比，超声波萃取具有如下突出优点： 提取效率高：超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使中药有效成分提取更充分，提取率比传统工艺显著提高达50 500%； 提取时间短：超声波强化中药提取通常在24 40分钟即可获得最佳提取率，提取时间较传统方法大大缩短2/3以上， 药材原材料处理量大； 提取温度低22：超声提取中药材的最佳温度在40 60，对遇热不稳定、易水解或氧化的药材中有效成分具有保护作用； 常压提取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便； 适应性广：超声提取中药材不受成分极性、分子量大小的限制，适用于绝大多数种类中药材和各类成分的提取； 超声波萃取对溶剂和目标萃取物的性质（如极性）关系不大。因此，可供选择的萃取溶剂种类多、目标萃取物范围广泛； 减少能耗。由于超声萃取无需加热或加热温度低，萃取时间短，因此大大降低能耗； 提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化； 提取工艺运行成本低，综合经济效益显著； 操作简单易行，设备维护、保养方便。 1.4 野菊花总黄酮提取方法研究概况目前提取总黄酮的方法有：热水提取法、有机溶剂提取法、碱液提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、大孔树脂吸附法等21。1.4.1 热水提取法由于该方法成本低廉，目前，国内厂家对野菊花总黄酮的提取多采用沸水提取法，其提取条件因素已各有不同22。1.4.2 有机溶剂提取法黄酮苷、黄酮苷元均易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，根据这一原理进行有机溶剂提取法。1.4.3 碱液提取法黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液。此法就是根据这一原理对野菊花黄酮类化合物进行提取的。1.4.4 微波辅助提取法微波是一种超高速电磁波，具有很强的穿透作用，使植物细胞中的水分或有机溶剂迅速升温升压，细胞壁穿孔，使成分从细胞中溶出，而且微波电磁场使分子运动短时间内加剧，从而缩短了提取时间，提高了提取率。所以微波提取法与常规方法相比具有高效性和强选择性，操作简便，产率高，副产物少，产物易于纯化等26-28。此法已广泛应用于多种天然产物的提取，但对野菊花中黄酮类化合物微波提取工艺鲜见报道。1.4.5 超声波辅助提取法近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂。从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响。但超声技术应用于提取野菊花中黄酮类物质的研究报道较为少见。1.4.6 大孔树脂吸附法29,30该方法是将菊花提取液经树脂上柱、洗脱、收安 洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的菊花总黄酮。该方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。用该方法纯化菊花提取物，其总黄酮转移率可达95%以上，纯化物总黄酮含量可达65%以上，且重现性好，树脂可重复使用。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 试剂与仪器 试剂所需试剂如下表2-1所列：表2-1 所需的试剂名称级别产地菊花乙醇亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠芦丁标准品蒸馏水95%分析纯分析纯分析纯浙江安徽安特生物化学有限公司上海振欣试剂厂上海振欣试剂厂杭州萧山化学试剂厂中国药品生物制品检定所实验室制备 仪器所需的仪器如小标2-2所列：表2-2 所需的仪器仪器名称及型号生产公司WK-200B高速药物粉碎机FA1104型电子天平UV-1800PC型紫外可见分光光度计智能恒温电热套KQ-100B型超声波清洗器RE-52A旋转蒸发仪循环水式多用真空泵各种玻璃仪器青州市精诚机械有限公司上海良平仪器有限公司上海美谱达仪器有限公司郑州长城科工贸易有限公司昆山市超声仪器有限公司上海亚荣生化仪器厂昆山市超声仪器有限公司宁波市化学有限公司2.2 实验方法的确定2.2.1 对照品及对比实验溶液的制备 对照品溶液配制由于芦丁和黄酮类化合物均是以2-苯基色原酮为母核的结构，具有相同的吸光度测试性质，均于510 nm处有最大吸收峰，所以采用芦丁为对照品测定野菊花中总黄酮的含量。精确称取经120干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置50mL容量瓶中，加乙醇适量，使充分溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取20mL，置50mL容量瓶中，用水稀释至刻度。摇匀，所得溶液每lmL含芦丁对照品0.2mg。 对比实验溶液的配制 野菊花预处理取适量野菊花60干燥5h，取出粉碎成细粉。放入干燥瓶中备用。 加热回流提取法溶液的配制准确称取1.000g菊花粉末于100 mL烧杯中，加入40乙醇30mL，浸泡24h，50加热回流1h，减压抽滤，弃滤渣，滤液加40%的乙醇定容于100 mL容量瓶中，精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。 超声波提取法溶液的配制准确称取1.000g菊花粉末于100 mL烧杯中，加入40%乙醇30mL，浸泡24h，在超声波温度为50的条件下，提取1h，减压抽滤，弃滤渣，滤液加40%的乙醇定容于100 mL容量瓶中，精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。2.2.2 标准曲线的制作精密量取芦丁对照品溶液3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加5亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂溶液为空白，于UV-1800PC型紫外可见分光光度计上进行全波长扫描，得最大吸收波长 max = 510 nm ，按分光光度法，在510 nm处测定吸光度。应用最小二乘法将芦丁标准液浓度与吸光度值做一元线性回归分析，由Microsoft Excel获得回归曲线。结果见图1。图2-1 芦丁吸光度与浓度标准曲线以对照品溶液浓度C和吸光度A进行线性回归，得回归方程A = 0.0127C+0.0098，其中R2 = 0.9996，可知线性关系良好。线性范围为8.46567.384 g / ml。2.2.3 供试液含量的测定精密吸取各供试品液2mL于25mL容量瓶中，按照标准曲线方法进行操作，显色，在510nm波长处测定吸光度A，由标准曲线方程计算样品中总黄酮的含量。2.2.4 对比实验结果分析经测量及计算分别得加热回流提取法、超声波提取法吸光度值及总黄酮含量。相关数据如下表2-3所示：表2-3 乙醇、超声波提取法实验结果提取方法吸光度值待测液总黄酮含量（mg/ml）总黄酮提取率（%）加热回流提取法超声波提取法0.230 Abs0.259Abs0.220.2510.8412.50根据表2-1所示，经比较，可知超声波提取法总黄酮提取率大于加热回流提取法。为取得最佳收率，故本实验采取超声波提取法进行野菊花总黄酮提取。2.3 实验方法与评价指标2.3.1 实验具体操作方法采用乙醇为提取溶剂，先进行单因素试验，得出乙醇体积分数、乙醇体积、超声时间等因素在不同水平上的总黄酮的出膏率以及含量，在此基础上，各选出3个水平用L 9（3 4）正交表进行正交试验，进行优化组合找出最优化工艺参数条件。具体操作如下：准确称取5.000g菊花粉末于100 mL烧杯中，加入一定体积分数以及一定量的乙醇溶液，浸泡24h，在超声波温度为50的条件下，提取一定时间，减压抽滤。弃滤渣，滤液减压蒸馏得浸膏液至恒重，干燥浸膏液，得浸膏。浸膏加一定体积分数的乙醇溶解，用一定体积分数的乙醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。2.3.2 实验评价指标 出膏率出膏率的计算公式为：出膏率 = 干膏重 / 药材量 （2-1） 总黄酮提取率总黄酮含量计算公式：由标准曲线方程计算样品中总黄酮的含量。总黄酮提取率计算公式：总黄酮提取率 = 总黄酮重 / 药材量 （2-2）本实验中测定出膏率、总黄酮含量以及总黄酮提取率的方法分别是： 出膏率测定：用FA1104型电子天平准确称量经干燥至恒重的浸膏，通过公式（2-1）进行计算，得出膏率。 总黄酮含量测定：浸膏加一定体积分数的乙醇溶解，用一定体积分数的乙醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。按照标准曲线方法进行操作测定黄酮含量，得总黄酮含量。 总黄酮提取率：由公式（2-2）计算得总黄酮提取率3 实验结果与讨论3.1 提取中主要影响因素的确定用水浸提提取物杂质多，后处理比较麻烦。甲醇、丙酮等作为提取剂，虽然效果不错，但二者有毒。乙醇浸提的选择性好，渗透性强，出膏率较高。本试验选择一定体积分数的乙醇溶液作为提取剂。为了提高有效成分的浸出。同时克服加热提取时产生水解产物的缺点，本试验利用超声波辅助提取。3.1.1 乙醇体积分数对总黄酮含量的影响准确称取5.000g菊花粉5份，分别加入100mL30 、45 、60 、75、90的乙醇溶液。浸泡24h，在超声波温度为50的条件下，提取时间为40min，减压抽滤。弃滤渣，滤液减压蒸馏得浸膏液，干燥浸膏液，得浸膏，称量，计算出膏率。得出膏率与乙醇体积分数的关系（图3-1）。浸膏加一定体积分数的乙醇溶解，用一定体积分数的乙醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。测其吸光度A值，得待测液总黄酮含量与乙醇体积分数的关系（图3-1）。乙醇体积分数对总黄酮含量的影响实验结果如表3-1所示。表3-1 乙醇体积分数对总黄酮含量的影响实验结果记录乙醇体积分数（%）浸膏质量（g）出膏率（%）吸光度值待测液总黄酮含量（mg/ml）总黄酮提取率（%）30456075901.39381.62851.89721.71941.020327.8832.5737.9434.3920.410.3090.4030.5150.4800.1480.29450.38700.49720.46280.13602.953.874.974.631.36图3-1 乙醇体积分数与出膏率、总黄酮提取率关系从图2-2可以看出，随着乙醇体积分数的增加。出膏率、总黄酮提取率均增加，当乙醇体积分数达到60左右时，黄酮类化合物溶解度最大，出膏率、总黄酮提取率均最高；乙醇浓度再增加，黄酮类化合物溶解度降低。这是由于存在一些醇溶性的杂质，叶绿素的溶出量增加，这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇水分子的结合，从而导致黄酮类化合物的减少。3.1.2 乙醇体积对总黄酮含量的影响准确称取5.000g菊花粗粉5份。分别加入70的乙醇溶液50mL、100mL、150mL、200mL、250mL，浸泡24h，在超声波温度为50 的条件下。提取时间为40min，减压抽滤。弃滤渣，滤液减压蒸馏得浸膏液，干燥浸膏液，得浸膏，称量，计算出膏率。得出膏率与乙醇体积的关系（图3-2）。浸膏加70的乙醇溶解，用70的乙醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。测其吸光度A值，得待测液总黄酮含量与乙醇体积的关系（图3-2）。乙醇体积对总黄酮含量的影响实验结果如表3-2所示。表3-2 乙醇体积对总黄酮含量的影响实验结果记录乙醇体积（ml）浸膏质量（g）出膏率（%）吸光度值待测液总黄酮含量（mg/ml）总黄酮提取率（%）50751001251501.20591.44911.79031.82741.783524.1228.9835.8136.5535.670.2250.3560.5120.5090.4860.21180.34070.49420.49130.46872.123.414.944.914.69图3-2 乙醇体积与出膏率、总黄酮提取率关系由图3-2可知，随着料液比的增加，溶质与溶剂间的浓度差不断增大，溶剂中能够溶解的溶质也不断增大，野菊花总黄酮提取率随之增大。但当乙醇体积到100ml后，再增大溶剂的用量，总黄酮得率增加不明显，且料液比过大会给后续的浓缩工作带来很大压力。从节能和提高工作效率角度考虑，溶剂用量不宜过大，故溶剂用量选择100ml较为合适。3.1.3 超声波提取时间对总黄酮含量的影响准确称取5.000g菊花粗粉5份，分别加入70的乙醇溶液100mL。浸泡24h，在超声波温度为50 的条件下，分别提取30min、50min、70min、90min、110min，减压抽滤。弃滤渣，滤液减压蒸馏得浸膏液，干燥浸膏液，得浸膏，称量，计算出膏率。得出膏率与提取时间的关系（图3-3）。浸膏加70的乙醇溶解，用70的乙醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。测其吸光度A值，得待测液总黄酮含量与提取时间的关系（图3-3）。超声时间对总黄酮含量的影响实验结果如表3-3所示。表3-3 超声时间对总黄酮含量的影响实验结果记录超声时间（min）浸膏质量（g）出膏率（%）吸光度值待测液总黄酮含量（mg/ml）总黄酮提取率（%）305070901101.10491.37251.78231.85201.830122.1027.4535.6537.0436.600.1570.3180.4610.5130.4920.14490.30330.44410.49530.47461.453.034.444.954.75图3-3 超声时间与出膏率、总黄酮提取率关系由图3可知，提取时间为30min 70min范围时，总黄酮的提取率随时间延长逐渐升高，但在70min以后升高不明显，曲线趋于平稳，即提取率增加不明显。可能是因为所含黄酮类物质已基本溶出，所以增加提取时间不能使提取率升高。另外考虑到经济情况，故选择适宜的提取时间为70min。3.2 正交实验设计3.2.1 考察因素及水平选择乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取时间（C）等3个因素，每个因素选择3个水平，编制因素水平表（表3-4）。表3-4 因素水平表水平A乙醇体积分数（%）B液料比（mL：g）C超声时间（min）1235060701520254060803.2.2 试验与结果准确称取野菊花5.000g，按L9（34）正交表没计方案进行试验，实验所得结果如下表3-5所示。表3-5 正交实验测得结果试验号ABCD浸膏质量（g）吸光度值1234567891112223331231231231232313121233122311.63231.80951.97081.43081.80291.01071.49891.53411.96830.4680.4620.5440.4180.5760.5330.4810.3610.512对上表数据进行含量计算，以测得野菊花总黄酮出膏率，总黄酮提取率为指标进行分析。结果见表3-5。表3-5 L9（34）试验方案及结果试验号ABCD出膏率（%）总黄酮提取率（%）1111132.654.512122236.194.453133339.425.264212328.624.025223136.065.576231220.215.157313229.984.648321330.623.469332139.374.94K1108.2691.2583.54108.08因素主次A-C-BK285.45102.93104.1886.38K3100.0399105.4698.72最优方案A1B2C3k136.0930.4227.8536.03k228.4834.3134.7328.79k333.343335.1532.91R（出膏率）7.613.897.37.24优水平A1B2C3K114.2213.1713.1215.02因素主次C-B-AK214.7413.4813.4114.24K313.0415.3515.4712.74最优方案A2B3C3k14.744.394.375.01k24.914.494.474.75k34.355.125.164.25R（总黄酮提取率）0.560.730.790.76优水平A2B3C33.2.3 小结由实验结果可以看出，影响野菊花总黄酮出膏率的因素顺序为乙醇体积分数超声时间液料比，最佳方案为A1B2C3 ；影响野菊花总黄酮提取率的因素顺序为超声时间液料比乙醇体积分数，最佳方案为A2B3C3 。虽然两种指标下的最佳方案不完全一致，但是由于对于本实验而言，总黄酮提取率较出膏率更为重要。因此，确定最佳方案为A2B3C3 ，即乙醇体积分数为60%，液料比为25:1，超声时间为80min。3.3 稳定性考察（验证实验）为了考察上述优选工艺条件的稳定性，按野菊花的最佳提取工艺条件A2B3C3重复实验3次，以野菊花总黄酮提取率为指标，结果见表3-6。3次实验结果均优于正交实验表中任何一组，而且各组的提取率都比较接近，与正交实验中的提取率也相吻合，平均提取率为5.62。所以认为上述正交实验得出的最优水平是可靠的，该工艺稳定可行。表3-6 验证实验实验次数A / %B / ml/gC / min吸光度值A提取率（%）平均值（%）16025800.5825.635.6226025800.5765.5736025800.5855.664 总结与展望4.1 总结 通过大量的实验，结合理论分析，得出以下结论：4.1.1 溶剂的选择用水浸提提取物杂质多，后处理比较麻烦。甲醇、丙酮等作为提取剂，虽然效果不错，但二者有毒。乙醇浸提的选择性好，渗透性强，出膏率较高。因此本试验选择一定体积分数的乙醇溶液作为提取剂。4.1.2 实验方法的选择通过对比实验比较加热回流提取法与超声波辅助提取法的总黄酮提取率，结果表明超声波提取法提取率大于加热回流提取法。故本实验采用超声波提取法。4.1.3 实验流程本实验主要的流程为：野菊花干燥粉碎浸泡超声提取减压抽滤减压蒸馏得浸膏干燥浸膏计算浸膏率浸膏溶解配制待测液分光光度法测吸光度值计算总黄酮含量及出膏率4.1.4 各实验条件确定本实验以出膏率以及总黄酮提取率为指标，先通过单因素实验确定乙醇体积分数、液料比、超声时间对总黄酮提取率的影响规律，再通过正交实验确定总黄酮的最佳提取条件。所得的最佳工艺条件为：乙醇体积分数为60%，液料比为25:1，超声时间为80min。4.1.5 实验条件优势本实验简单易操作，易于实现工业化生产，并且采用超声波提取法投资少、设备简单、适用范围广、重现性好、选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高、不产生污染。同时超声波对总黄酮抑菌活性无破坏作用，因而可为工业化利用丰富的野菊花资源、提取总黄酮提供参考。4.2 展望我国野菊花资源非常丰富，但绝大部分未开发利用，现有的野菊花产品有野菊花栓、野菊花注射液、菊藻丸等。野菊花色泽金黄，芳香甘醇，饮用具有生津止渴，清热解毒，益肝明目，降压减肥等功效，具有较高的药用保健价值，是四季皆宜的健康饮品；野菊花生物活性多样，且作用温和持久，具有较高的药用价值。因此，野菊花可开发成饮品、保健品、药品、香料、食物添加剂等一系列产品。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用13-15,31,32。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目，野菊花分布广泛，本实验结果表明，野菊花中含有较为丰富的黄酮。因此，野菊花具有广泛开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。参考文献1 江苏新医学院. 中药大辞典M. 上海: 科学技术出版社, 1985: 2144 2 石兰萍, 田琳琳, 袁劲松等. 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