（微生物学专业论文）石斛内生真菌的形态和分子鉴定及其细胞毒活性研究.pdf

青州土学嬲届厦士学位论文 摘要 本文首先对内生真菌的国内外研究概况及其研究意义进行了综述。从内生真菌 的分布、生物多样性、代谢物质的多样性到内生真菌的生物学作用做了介绍，并且对 石斛植物的生物生态特性及应用价值做了简单概述 在试验研究方面。主要是进行石斛内生真菌的分离，形态学和分子生物学鉴定。 本文就常规内生真菌植物组织分离法中常存在的疑问，即是否能保证从植物组织分 离到的菌是内生真菌而不是附生菌，首次采用自命名的组织印迹培养法，确定如何区 分组织内生真菌与表面附生菌。介绍了如何尽可能全面地从植物中分离到内生真菌 的方法。 本文比较系统地调查了石斛内生真菌的生物多样性，对分离纯化的1 1 0 株内生 真菌，通过形态学与分子生物学两种鉴定方法相结合，鉴定出2 3 属真菌，分属于三亚 门，6 纲，9 目，1 4 科，2 3 属，显示出石斛内生真菌的生物多样性比较广确定石 斛内生真菌优势菌群是小丛壳属( g l o m e r e l l a ) ，刺盘孢属( c o l l e t o t r i c h u m ) ，拟茎点 霉属( p h o m o p s t s ) ，链格孢属口l t e r n a r i a ) ，炭角菌属( x y l a r i a ) 分析比较了石斛内生 真菌中的大型真菌和病原菌，并对宿主植物致病机理提出自已的看法。 本文报道了在人工培养基上培养出三株内生真菌产大型有性繁殖结构( 除已报 道分离培养出担子茵石斛小姑外，内生真菌中的子囊菌产大型有性繁殖结构属首次 报道) 并介绍了培养方法。经形态鉴定菌株d r o o l 是炭角菌属( x y l a r i a ) ，种鉴定为尖 顶炭角菌( x y l a r i aa p i c u l a t a ) ，并经分子鉴定方法确定而它的无性型可能是镰孢菌属 ( f u s a r i u m ) 本文报道了通过形态学和分子生物学方法确定内生于石斛的炭角菌属( x y l a r i a ) 分别属于三个类群 本研究通过建立卤虫卵初筛有抗癌活性菌株的模型，对分离的十属特殊菌株初 步进行了具细胞毒活性的筛选，为进一步筛选抗癌活性物做准备。 本研究首次鉴定出内生于石斛的又一类微生物一小球藻报道了分离小球藻的 特殊方法。并推测内生于石斛的小球藻的生物学作用可能有助于增强宿主石斛的光 合作用 关键词内生真菌石斛组织分离形态和分子鉴定多样性无性型和有性型 贵州土学嬲届曩士学位静毫 a b s t r a c t s t u d i e so ne n d o p h y t i cf u n g if r o mh o m ea n db r o a da n dt h ei m p o r t a n t c eo fi tw a s s u m m a r i z e da tf i r s ti nt h i sp a p e r t h ec o n t e n to f t h es u l m n a - r yi n c l u d ed i s t r i b u t e , d i v e r s i t y a n df u n c t i o no fe n d o p h y t i cf u n g ii nd e n d r o b i u ma n db i o e c o l o g yc h a r a c t e r i s t i ca n d w o r t h n e s si na p p l i c a t i o no f d e n d r o b i u m i nt h i ss t u d y , p r i l j a r yr e s e a r c hi si s o l a t i o na n dm o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o no fe n d o p h y t i cf u n g ii nd e n d r o b i u m aq u e s t i o na b o u th o wt od i s 州s h b e 伽e e ne n d o p h y t i cf u n g ia n de x t e r i o rf u n g ii l lp l a n tb yw a y so fn o r m a lt i s s u es u r f a c e d i s i n f e c t i o ni s o l a t e di so f e nd o u b t t os e t t l ei t , aw a yn a m e dt u s s u ep r i n tc u l t u r ew a su s e d a n daw a yh o wt oi s o l a t ee n d o p h y t i cf u n g if r o mp l a n ta sm u c ha sp o s s i b l yi si n t r o d u c e d t o o t h er e s e a r c hi n v e s t i g a t ec n d o p h y t i cf u n g id i v e r s i t yi nd e n d r o b i u ma n d1 1 0s t r a i n s o f e n d o p h y t i cf u n g iw e i s o l a t e df r o mt h es t e m , r o o t 1 e a f a n df l o w e ro f d e n d r o b i u m a n d , a n d2 3 s t m i n so f i nt h e mw e r em o r p h o l o g i c a l l ya n dm o l e c u l a r l yi d e n t i f i e dt ob e l o n gt o2 3 g e n e r a ，1 4f a m i l i e s ，9o r d e r s ，6c l a s sa n d3p h y l u m i th a ss h o w nt h a td i v e r s i t ye o d o p h y t i c f u n g i i nd e n d r o b i u mi s w i d e ，a n dd o m i n a n tg r o u pi sg l o m e r e l l a , c o l l e t o t r i c h u m , p h o m o p s i s , a l t e r n a r i 珥x y l a r i a t h ep a p e r sl i s tl a r g ef u n g ia n dp a t h o g e n i cf u n g ii n d e n d r o b i u ma n da n a l y z en o s o g e n e s i so f h o s tp l a n t ， i ti sr e p o r tt h a tt h r e es t r a i n sr e p r o d u c eb ys e x u a lm e a n si np d am a d i u n la n dl a r g e f i 证t sw e r eo b v e r s e d t h i si sf i r s tr e p o r ta b o u ta s c o m y c o t af r o mi s o l a t a t i o np l a n tt u s s u e g i v i n gf r u i te x c e p tm y c e n ad e n d r o b i if a n e tg u oo f b a s i d i o m y c o t a a n daw a ya b o u th o w t oc u l t u r et h e mw a sr e p o r t d r o o ls t r a i ni si d e n t i f i e db ym o r p h o l o g i c a li d e n t i f i c a t i o na n d i tb e l o n g st ox y l a r i a , a n di tm a yb ex y l a r i aa p i c u l a t a , t h a ti si d e n t i f i e db ym o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n a n di t sa n a m o r p hm a yb ef u s a r i u m b ym o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o ni ti sa l s u r et h a tx y l a r i ai nd e n d r o b i u mb e l o n gt ot h r e eg r o u p t e ns p e c i a ls t a i n so f i s o l a t e sw e r es e l e c t e dt od e t e c tf u n c t i o no f c y t o t o x i no f t h e mb y e s t a b l i s hm o d e lo f u s i n gb r i n e s h r i m pe g g sa si n d i c a t i o nt os e l e c ts t a i n st h a th a v ea c t i v i t y o f a n t i c a n c e ri no r d e rt om a k eap r e p a r a t i v et h a tf u r t h e rs e l e c t i n ga n t i c a n c e rm a t t e r f i n a l l y , t h i ss t u d yr e p o r tt h a ta n o t h e rm i c r o o r g a n i s mi nd e n d r o b i u mw a s i n d e n t i f i e d 6 青州土荸蹦届曩士学覆话文 a n di ti sc l d o r e l l a , a n dr e p o r tt h es p e c i a lw a yh o wt oi s o l a t ei ta n dg u e s st h a tt h ef u n c t i o n o f c h l o r e l l ai nd e n d r o b i u mm a yb es t r e n g t h e np h o t o s y n t h e s i so f h o s tp l a n t k e y w o r d s ：e n d o p h y t i cf u n g i ；d e n d r o b i u m t i s s u ei s o l a t i o n ；m o r p h o l o g i c a la n d m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ；d i v e r s i t y ；a n a m o r p ha n dt e l e o m o r p h 7 量州土季鼻a 甜届曩士学位静文 第一章综述 第一节内生真菌的国内外研究概况 l 内生真菌研究历史和现状 ( 内生菌( e n d o p h y ) 一词由d eb a r y ( 1 8 6 6 ) 首先提出，是指生活在植物组织微 生物用以区分那些生活在植物表面的表生菌( e p i p h y t e ) 。按此定义植物的致病菌、 菌根菌也归属于内生菌的概念范畴。c a r r o l l ( 1 9 8 6 ) 将内生菌定义为生活在地上部分、 活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌，突出强调内生菌与植物的互惠共生关 系，因此，在这个内生菌概念的范畴内不包含植物致病菌和菌根菌。p e t r i n i ( 1 9 9 1 ) 把c a r r o l l 的概念范畴进一步扩展，将内生菌定义为那些在其生活史中的某一段时期 生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害的菌，这个定义包括那些在其生活 史中的某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌( l a t e n t p a t h o g e n s ) 和菌根菌目前关于内生菌的概念范畴还有争议，但在现在的内生菌研 究中，p e t r i n i 提出的内生菌概念被广泛地接受。一般研究中所涉及到的内生菌都是 指内生真菌对于内生真菌的研究已有一百多年的历史，但是直到二十世纪八十年代 初才被重视起来，且大多数研究工作集中在一些具有重要经济价值的植物。目前内生 真菌的研究范围开始从具有重要经济价值的高等植物扩展到一些低等的孢子植物如 苔藓、蕨类和地衣。( 郭良栋，2 0 0 1 ) 2 内生真菌的分布和生物多样性 从目前研究的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，内生真菌在植物体内 是普遍存在的，内生真菌主要是由子囊菌及其无性型组成，也包括少数担子菌和接合 菌。( s i n c l a i re t1 9 9 6 ，z h e n ge t1 9 9 5 ) 从不同植物体内分离到内生真菌种类的数 量也不相同，少则十几种，多则近百种。f i s h e r ( 1 9 9 3 ) 等从e u c a l y p t u sn i t e n s 上 分离到约6 0 种，h y d e 等( 1 9 9 7 ) 经过对澳大利亚热带地区棕榈树内生真菌的全面研究， 指出平均从每种棕榈树内分离到约1 0 0 种内生真菌通过对内生真菌与宿主专一性分 析，平均每种宿主有4 5 种专性内生真菌，按地球目前已知2 5 万种植物计算，内生真 菌总数可以超过1 0 0 万种( p e t r i n i 。1 9 9 1 ) 。 贵州土学嬲届硬士学位静文 3 内生真菌代谢物质的多样性 植物内生真菌的生物多样性决定了其代谢物质的多样性。现有研究表明， 从植物中分离出的内生真菌能代谢多种活性物质，其中一些是新物质，具有 特殊生物活性。( 李能章，彭远义，2 0 0 4 ) 。 3 1 产生抗癌类物质 从某些植物中分离出的某些内生真菌能代谢具有抗肿瘤活性的物质，美国的 s t r o b e l ( 1 9 9 3 ) 等首次从短叶紫杉( t a x u s b r e v i f o l i a ) 的树皮中分离出能产生紫杉 醇( t a x 0 1 ) 的内生真菌( t a x o m y c e s a n d r e a n a e ) ，其后，其他学者又从其它植物中分离 到内生真菌能产生不同作用机理的抗癌新物质。如，引起癌细胞凋亡类物质 ( f i l i p ，e t 。2 0 0 3 ) ，破坏癌细胞微丝物质( r a t n a y a k aa se ta l ，2 0 0 1 ) ，癌细胞分裂 抑素( a g e n a a r 删e t ，2 0 0 0 ) ，酶抑制剂( g u ob ，2 0 0 0 ) 及其它类抗癌物( s t i e r l e d b ，1 9 9 9 ，2 0 0 3 ) ，( b r a d ysf 。2 0 0 0 ) 3 2 产生抗菌类物质 作为产生抗茵类物质的微生物，植物内生菌是一大类群，能产生多种具有不同抗 菌活性的物质，对植物、人和动物病原菌有抑制活性。( 1 ijy ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 等先后从 植物中分离的内生菌中提取出多种对多种植物病原菌具有抑制作用的物质在人和 动物病原菌抑制物质的产生方面，植物内生真菌产生多种生物活性物质，有研究表明 植物内生真菌能产生对抗药菌株有抑制活性的物质，在从内生真菌a l t e r n a r i a 的培 养液中分离出一种新的细菌抗生素a l t e r s e t i n ( h e l l w i gv ，e ta l ，2 0 0 2 ) c a s t i l l o u f , 2 0 0 2 ) 从生长在澳大利亚北部的药用植物分离到的一株内生菌产生的缩氨酸物质 对葡萄球菌的青霉素抗药菌株有抑制作用，对能抗多种药物的分枝结核杆菌抗药菌 株也有抑制作用。 3 3 酶类代谢 植物内生真菌产生多种酶以维持其自身生长代谢的需要( t o r r e s m ，e ta 1 2 0 0 3 ) ， 在其产生的酶中，有很多酶具有特殊的功能和活性，如产生的几丁质酶、葡聚糖酶、 蛋白酶等水解酶类可以降解其病原真菌的细胞壁或其它致病因子而起到防病的作用 ( m o y m ，e ta 1 2 0 0 2 ) ，产生的限制性内切酶i i ( l u l 7 i a n c h u kv ve ta 1 2 0 0 2 ) 可以应 用在分子生物技术中。 3 4 产生抗疟原虫、结核类物质 在植物内生真菌中也分离到多种抗疟疾和结核类新物质，o s t e r h o g ec ( 2 0 0 0 ) 等 9 青州土学叠a 暂届厦士学位语文 从绿藻类石莼植物内生真菌a s c o c h y t 8 s a l i c o r n i a e 中分离出一种新的结构异常的 四聚体酸对疟原虫有抗性。从内生真菌g e o t r i c h u ms p 的发酵液中分离出三种新的 二氢异香豆素衍生物( k o n g s a e r e e p ，e ta 1 2 0 0 3 ) 和从内生真菌p h o m o p s i ss p 中分 离出的两种新的二聚体( i s a k am ，e ta 1 2 0 0 1 ) 都具有抗结核菌和抗疟疾作用。 3 5 产生杀虫物质 禾本科植物内生真菌产生的多种活性物对线虫和大多数食草昆虫具较强的毒性， 清华大学的ju ( 1 9 9 8 ) 等从内生菌感染的一种草熟禾( p o a a m p l a ) 中分离到数个对蚊 子幼虫有毒性的黄酮类化合物。f i n d l a y 等从云杉等针叶树的内生真菌的次生代谢 产物中，发现了一系列具抗虫活性的物质d a i s y 阴( 2 0 0 2 ) 等发现 m u s c o d o r v i t i g e n u s 内生真菌产生的萘类物质，具有杀虫能力。 3 6 其他类物质 植物内生菌除代谢以上各种抗癌、抗菌、抗虫类等物质，还产生多种生长调节类 物促进植物的生长( z h a n gj e ta 1 1 9 9 9 ) 、生物表面活性剂( c h os j e ta 1 2 0 0 2 ) 和产生调节动物身体机能物质等。 4 内生真菌的生物学作用 内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程 中二者形成了稳定的生态关系，一方面内生真菌可从宿主中吸收营养供自己生长需 要，另一方面内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用，可通过 自身的代谢产物或借助于信号转导作用对植物体产生影响( 文才艺，2 0 0 4 任安芝，高 玉葆，2 0 0 1 ) 。 4 1 促进宿主植物的生长发育 内生真菌对宿主植物的促进作用表现在种子发芽、幼苗存活、分蘖生长、生物 量等多个方面( 任安芝，高玉葆2 0 0 1 ) 内生真菌可促进宿主的生长，在低水平氮源的 土壤中，内生真菌可增加宿主对氮元素的吸收( l y o n sp c ，1 9 9 0 ) 。据报道某些兰科 药用植物内生真菌能产生对植物体有利的生长激素，对宿主植物的生长发育有较好 的促进作用( 张集慧，1 9 9 9 ) 此外，内生真菌还可以通过增强植物吸收n 、p 等营养 元素，或与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进植 物生长( 文才艺, 2 0 0 4 ) 4 2 增强宿主植物的抗逆性 1 0 青i f 土蕾嬲届嘎士学位静文 内生真菌对植物抗逆性的作用可以分为对非生物胁迫的抗性和对生物胁迫的抗 性两个方面，前者主要包括干旱和高温耐性，后者主要包括阻抑昆虫和食草动物的 采食、抵抗病虫害等( 梁字，高玉葆2 0 0 0 ) 第二节内生真菌的研究意义 植物内生真菌生活在植物体这一特殊的生境内，与植物长期共处，共同进化，这 就使二者在进化过程中必然相互影响，形成一些新的真菌种类。因此，对植物内生真 菌的研究能发现一些新的真菌类群如从短叶红豆杉中发现的安德氏紫杉菌 ( s t r o b e g ，e td f1 9 9 3 ) ，从雷公藤植物中发c r y p t o s p o r f o p s i sc f q u e r c $ 2 n a ( s t r o b e lg ，e t a l l 9 9 缈。另外，对植物内生真菌的研究还可促进对植物微生 态系统的认识，内生真菌对植物微生态系统的影响的研究将为植物微生态系统功能 的研究提供更多的资料( 周成，邵华。张玲琪2 0 0 1 ) 在真菌学研究中。传统的菌物分类以形态特征和生理生化指标为分类基础，但 大部分菌物的种类多、分布广、形态特征复杂，而且少数形态特征和生理生化指标 随着环境的变化而不稳定，因此，传统的茵物分类常引起分类系统的不稳定或意见 分歧。近年来随着分子生物学的发展，同时也是真菌学自身发展的客观需求，分子 生物学技术在真菌学研究中得到了广泛而深入地应用。一些分类地位不明确、亲缘 关系不清楚的物种通过该技术得到了验证。一些重要的病原真菌遗传信息得到阐明， 并在群体遗传变异，地理生态、抗病育种等方面得到应用 内生真菌不仅具有广泛的医药价值，如产抗癌活性药物。还因其可增强宿主植 物的抗逆性，可被用于生物防治，作为优良的生物农药使用而利用其有促进植物生 长的生物学作用，可制成生物化肥内生真菌还有望作为外源基因导入宿主的载体。 第三节石斛及其内生真菌的研究 1 石斛生物学及生态学特性 石斛属( d e n d r o b i u m s w ) 是兰科( & c h i d a c e a e ) 植物中的第二大属，全世界 约有1 5 0 0 1 6 0 0 种，我国有7 6 种。石斛属d e n d r o b i u m s w 。是兰科o r c h i d a c e a e 植 物中的一个大属，全世界约产1 0 0 0 种，广泛分布于亚洲热带和亚热带地区至大洋洲。 t 州土学j b 日f 届曩士，隹静文 中国有7 5 种2 变种，主产秦岭以南诸省区，尤以云南南部最多。贵州省经过多年的调 查研究计产石斛属植物2 2 种1 变种，石斛属是多年生附生草本，为常绿植物，野生 石斛多附生于高山岩石或森林树干上，附生处多苔藓植物，环境阴凉湿润。其生长 利用岩逢渗水的潮气和夜晚露水，以背阴避光、通风的环境为宜，自然繁殖力极低。 2 石斛开发利用价值 石斛药材是石斛属多种植物的新鲜或干燥茎的统称，为传统名贵中药，早在 ， 1 0 ) 艇久与主溥渡等律获泡黎酪；氯傍：舅茂酵( 2 辍2 4 ：1 ) 潺合浚疆罐i - - - 3 次， i i ) 用等体积氯待；异戊酵( 2 4 ；i ) 撞提i 3 次， 1 2 ) 离心( 1 0 0 0 0 r p 嫩5 r a i n ) ，离心沉淀d n a ， 1 3 ) 士清渡加入i 1 0 体积4 mn a c l 7 o ) 到u n l 0 - 1 0 柱中，室温或3 7 放置2 m i n ，提高洗脱温度至5 5 _ 8 0 有利于提高d n a 洗脱效率； 7 ) 1 0 0 0 0 r p m 室温离心l m i n ，离心管中的液体郾为回收的d n a 片段，可立即使用或于- 2 0 备用 1 6 5 纯化产物检测 1 的琼脂糖凝胶，l t a e 为电泳缓冲液，5 v e r a 电压，上样2 m 电泳检测纯化 样品纯度( 通常以上样2 山在紫外灯下可见整齐单一条带，即达到测序要求) 。 1 6 6 纯化产物序列测定 经纯化的p c r 产物直接送上海联众基因有限公司，用美国p e 公司生产的3 7 7 型d n a 测序仪进行序列测定正向引物i t s 5 ，( 5 一3 ) 进行测定，对正向无法 测通的片段用反向引物i t s 4 ，( 3