（遗传学专业论文）褶皱臂尾轮虫减数分裂相关基因bpdmc1的克隆与初步分析.pdf

摺皱臂尾轮虫减数分裂基因b p d m c i 的克隆及其初步分析 摘要 褶皱臂尾轮虫 ( b r a c h i n o r u s p l i c a t i l i s ) 属 轮虫门 单巢 纲， 其生活史中 存在孤 雌生殖和有性生殖两种繁殖方式， 即世代交替现象。 轮虫混交雌体 ( 有性生殖雌 体) 和非混交雌体 ( 孤雌生殖雌体) 外部形态没有明显差别， 但内部生理机制明 显不同。 生物学工作者分别从不同角度对诱导轮虫有性生殖的原因进行研究， 种 群密度、 环境温度、 p h值、 盐度、 d o , 渗透压、 光照、 食物的 种类、 大小和丰 度等都成为轮虫学家关注的问题， 但不同的学者对于同一条件的诱导效果的解释 亦不相同有的甚至争议很大。 我们认为减数分裂是轮虫由孤雌生殖向有性生殖转 变的关键事件， 对其进行分子生物学研究将有助于从根本上认识轮虫有性生殖及 其发生的原因。 本论文是根据其它生物己知减数分裂相关基因d m c 1 / r a d 5 1 / r e c a的 保守 序列设计简并引物， 用p c r及r t - p c r的方法从褶皱臂尾轮虫中扩增出 减数分 裂相关基因类似物片段 b p d m c 1 ，并对其碱基序列及其编码的氨基酸序列进行 了分析。所取得的主要结果如下: 1 . 建立了提取褶皱臂尾轮虫基因组d n a和总r n a的体系。经凝胶电泳检 测， 其质量基本达到分子生物学实验技术要求， 能够用于p c r和r t -p c r分析。 2 .根据其它生物已知减数分裂相关基因保守结构域设计了两对引物。采用 p c r和r t -p c r方法， 从褶皱臂尾轮虫基因组d n a及其总r n a中分别扩增到 大小为5 0 4 b p 和 4 1 7 b p 的片段。 3 .分别对基因组d n a的p c r产物及r t -p c r产物克隆成功的重组子进 行测序。 将得到的7 个片段采用美国国 立生物技术信息中心b l a s t 程序， d n s s i s t 2 .0 软件和d n a s t a r 软件进行分析发现: 其中i 个d n a片段和2 个c d n a片段在 碱基序列上均有一定程度的同源性，在氨基酸序列上则有较高的同源性 ( 6 4 . 5 y o -8 6 .2 %) 。这是轮虫门中第一个被克隆的减数分裂相关基因的同源类似物。 将褶皱臂尾轮虫的此氨基酸序列与其它七种生物的 相应序列比 对并构建进化树， 发现其与d i c ty o s t e l i u m d is c o i d e u m 阿米巴 虫) 遗传距离最近， 与c a e n o r h a h d i t is e l e g a n s( 线虫) 最远。 对b p d m c i 基因5 端和3 端 的 序列有待 进一 步 研究。 关键词: 褶皱臂尾轮虫;减数分裂; d mc 1 / r a d 5 1 / r e c a基因;同源性; 遗传距 离 褶皱臂尾轮虫减数分裂基因b p d m c i 的克隆及其初步分析 abs t r a c t t h e b r a c h i n o r u s p l i c a t i l is i s a m e m b e r o f c l a s s m o n o g o n o n t a , 灿y l u m r o t i f e r a . i t c a n p r o d u c e o ff s p r i n g b y p a rt h e n o g e n e s i s o r s e x u a l r e p r o d u c t i o n i n i t s l i f e h i s t o r y . t h e r e i s n o o b v i o u s l y d i ff e r e n t a p p e a r a n c e b e t w e e n a m i c t ic f e m a l e ( p a r th e n o g e n e t i c f e m a l e ) a n d m i c t i c f e m a l e ( s e x u a l r e p r o d u c t i o n f e m a l e ) . i n p h y s i o l o g i c a l m e c h a n i s m , h o w e v e r , t h e r e m u s t b e s o m e d i f f e r e n c e . r o t i f e r s b i o l o g i s t s h a v e s t u d i e d m a n y e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s , s u c h a s p o p u l a t i o n d e n s i t y , e n v i r o n m e n t a l t e m p e r a t u r e , p h , s a l i n i t y , d o , o s m o s i s p r e s s u r e , i l l u m i n a t io n , t h e t y p e , s i z e a n d d e n s i t y o f f o o d , w h i c h p e r h a p s m a y i n d u c e s e x u a l r e p r o d u c t i o n o f t h e r o t i f e r . b u t d i ff e r e n t r e s e a r c h e r g o t d i f f e r e n t r e s u lt s e v e n a b o u t t h e s a m e f a c t o r . we t h i n k t h a t t h e me i o s i s i s t h e k e y p o i n t i n t h e c h a n g e s f r o m p a rt h e n o g e n e s i s t o s e x u a l r e p r o d u c t i o n . s o t h e s t u d y o f m e i o s i s r e l a t e d g e n e s c a n h e l p u s t o f i n d t h e e s s e n t i a l r e a s o n s f o r c h a n g e i n r e p r o d u c t i o n me t h o d s o f t h e r o t i f e r . i n t h i s s t u d y , t h e d e g e n e r a t e p r i m e r s w e r e d e s i g n e d a c c o r d i n g t o t h e c o n s e r v a t i v e d o m a i n o f m e i o s i s r e l a t e d g e n e s d mc 1 / r a d 5 1 / r e c a o f o t h e r o r g a n i s m s . t h e m e i o s i s r e l a t e d g e n e a n a l o g y f r a g m e n t s w e r e a m p l i f i e d f r o m g e n o m i c d n a a n d c d n a o f b r a e h i n o r u s p l i c a t i l is b y p c r . t h e s e f r a g m e n t s w e r e c l o n e d a n d s e q u e n c e d t h e ma i n r e s u l t s a r e a s f o l l o ws : 1 . w e e s t a b l i s h e d a p r o t o c o l t o e x t r a c t a n d p u r i f y g e n o m i c d n a a n d t o t a l r n a f r o m b r a c h i n o r u s p l i c a t i l is . d n a a n d r n a w e r e d e t e c t e d b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . i t s q u a l it y w a s f i n e f o r s u b s e q u e n t m o l e c u la r b i o l o g y e x p e r i m e n t s 2 . t h e d o m a i n o f a m i n o a c i d i d e n t i t y i n d m c 1 / r a d 5 1 / r e c a g e n e s w e r e u s e d t o d e s i g n f o u r d e g e n e r a t e p r i m e r s . t h e fr a g m e n t s o f 5 0 4 b p a n d 4 1 7 b p w e r e r e s p e c t i v e l y a m p l i f i e d 勿p c r a n d r t p c r fr o m b r a c h i n o r u s p l i c a t i l i s . 3 . s e v e n r e c o m b i n a n t s o f p c r a n d r tp c r w e r e s e q u e n c e d . t h e s e fr a g m e n t s h a v e b e e n a n a l y z e d b y b l a s t o n i n t e m e t a n d a l i g n e d b y d n a s s i s t 2 .0 a n d d n a s t a r . o n e o f d n a a n d t w o o f c d n a g o t s o m e h o m o l o g y s c o r e a t n u c l e o t i d e l e v e l a n d h i g h h o m o l o g y s c o r e a t a m i n o a c i d l e v e l ( 6 4 .5 %一8 6 .2 %) w i t h t h e m e i o s i s r e l a t e d g e n e s d mc i / r a d 5 1 / r e c a . t h i s i s t h e f i r s t m e i o s i s r e l a t e d g e n e l i k e h o m o l o g u e c l o n e d f r o m o r g a n i s m s o f p h y l u m r o t i f e r a . t h e p h y l o g e n i c r e l a t i o n s h ip o f b p d m c i a n d o t h e r d mc 1 / r a d 5 1 / r e c a a m i n o a c i d fr a g m e n t s o f s e v e n o r g a n i s m s w as s t u d i e d . t h e g e n e t i c d i s t a n c e b e t w e e n b r a c h i n o r u s p l ic a t il i s a n d d ic ty o s t e l i u m d is c o i d e u m i s t h e n e a r e s t a n d t h a t b e t w e e n b r a c h in o r u s p l i c a t i l is a n d c a e n o r h a h d i f s e le g a n s i s f a rt h e s t . t o g e t t h e 5 a n d 3 s e q u e n c e s o f b p d mc 1 n e e d s f u r t h e r r e s e a r c h k e y w o r d s : b r a c h i n o r u s p l i c a t i l i s ; me i o s i s ; d mc i / r a d 5 1 / r e c a g e n e ; h o m o l o g y ; ge n e t i c d i s t a n c e 褶皱臂尾轮虫减数分裂 基因b p d m c 1 的克隆及其初步分析 1前言 1 . 1轮虫简介 1 . 1 . 1轮虫动物门 ( p h y l u m r o t i f e r a )的 概况 轮虫体微小，一般仅在 4 0- 2 0 0 u m之间，营浮游、底栖或周丛生活。因其 身体不分节，两侧对称，有假体腔，所以自z e l i n k a ( 1 8 8 9 )以来，一直将其置 于线形动物门 ( n e m a t h e l m i n t h e s ) 中作为一个纲， 与该门的线虫纲 ( n e m a t o d a ) , 线形纲 ( n e m a t o m o r p h a ) 、 腹毛纲 ( g a s t r o t r i c h a ) 、 动吻纲 ( k i n o r h y n c h a ) 、 棘吻 纲 ( a c a n t h o c e p h a la )和鳃曳纲 ( p r ia p u la )一起统称为假体腔动物 ( p s e u d o c o e l o m a t a ) ， 亦可称原体腔动物( a s c h e l m i n th e s ) 。 但近代不少动物系统 分类学家在仔细研究了轮虫的胚胎发育过程和超微结构后， 将这类动物提升为一 个独立的门。 1 8世纪初期， 荷兰人列文虎克( a n t h o n y v a n l e e u w e n h o e k ) 首次发现并描述了 一种属蛙态类的轮虫。近 3 个世纪以来，全世界共发现轮虫 2 5 0 0余种，约 1 2 0 个属。 绝大多数种类生活于各类内陆水体中; 但亦有少数种类可生活于盐淡水和 海水中，据调查有 5 0 种轮虫完全属海洋种类。到目 前为止，我国共记录和描述 了5 0 0 多种轮虫 ( 约占全世界己发现轮虫的 1 / 5 左右) 。 轮虫具独特的繁殖方式，广泛分布于湖泊、水库、河流、池塘、沼泽、稻田 等水域及潮湿土壤和苔辞中， 是后生动物中拥有最强散布能力和最高繁殖速率的 1 个类群。它们能以最快的增殖速度占领生态系统中的空生态位，有效地将环境 中不同的食物资源转化为被次级消费者可利用的高质量的生物体。 轮虫虽然身体 微小，生物量不高， 但由于发育时间短， 周转快， 内 察增长力高具有较高的生产 能力，因此在水生态系统结构、 功能和生物生产力的 研究中具有重要意义。 轮虫 还是大多数名贵水产品的开口饵料和优质食物，在水产养殖业有很大的应用价 值， 尤其在海水养殖业中已实现了规模颇大的工厂化生产。 轮虫也是一类很好的 指示生物，在环境监测和生态毒理的研究中经常被采用。 1 . 1 .2形态特征与生长发育 轮虫体积虽小， 但形态结构已相当复杂。轮虫最主要的特征有3 点:( 1 )身 体前端或靠近前端存在一个有纤毛的特殊区域， 叫做头冠或轮盘， 其上的纤毛经 常摆动， 形如毡轮， 故名轮虫。 轮虫个体的运动和摄食就是通过轮盘的不断旋转 褶皱臂尾轮虫减数分裂基因b p d m c i 的克隆及其初步分析 而达到的， 轮盘的旋转可以使其附近的水不断地把食物小颗粒 ( 主要是藻类细胞 和一些食物碎屑)摄入轮虫体内。 ( 2 ) 在口腔或口管下面的咽喉部分，有一个膨 大的咀嚼囊。 囊内有很发达的肌肉， 并有一套由砧板和糙板组成的咀嚼器。 咀嚼 囊主要用来磨碎被摄入的食物小颖粒。 ( 3 ) 排泄系统是一对原肾管， 分列于假体 腔两侧，管之末端有焰茎球。 轮虫的各器官组织的结构均为合胞体，且各部分含有的细胞核数目是恒定 的。 如水轮虫 ( e p ip h a n e s s e n t a ) 的上皮层含有2 8 0 个细胞核， 食道含1 5 个， 胃 含 3 9个，肠含 1 4个，原肾管 ( 一条)含 1 4个，脑含 1 8 3 个，周围神经含 6 3 个， 细胞核总数为9 5 9 个。 这表明轮虫的发育有一个显著的固定形式。 轮虫自卵 孵出后，细胞核即不再分裂。身体部分受损，也不能再生。 一般轮虫为卵生，也有少数种类为卵胎生，一个轮虫一生中所产卵的数目， 按种类和环境不同而有很大的差异。在不同温度下，轮虫在 0 .6 5天能孵出幼 体。刚孵出的幼体只有成体的1 / 1 0 - - 1 / 3 大，但在数小时内，即可长大到3 倍或 3 倍以上，以后就生长减慢或停止生长。目 前研究结果显示， 一些蛙态轮虫种类 终身营无性生殖， 而单巢纲轮虫的生活史具有典型的世代交替过程。 休眠卵， 是 轮虫抵抗不良环境的有效生存方式。 休眠卵的产生对轮虫分布、 繁衍具有很大的 意义。 1 . 1 . 3研究轮虫的意义 轮虫是由缺少体腔的后生动物过渡到具体腔的后生动物之间的一类假体腔 动物， 它们在无脊椎动物的系统发展中具有重要意义。 深入研究这类动物的起源、 演化将有助于阐明无脊椎动物间相互关系。 各类淡水水域中轮虫种类繁多， 数量 丰富， 它们既可指示环境优劣; 又可作为各类水生动物的优质食物， 有很高的开 发、利用价值。 特别是轮虫个体大小适中，活动缓慢， 繁殖力高， 体内富含大量 名贵水产品所必需的营养成分， 因此， 是优质的活饵料， 在水产养殖业上倍受重 视。 1 . 2国内 外研究进展 1 .2 . 1褶皱臂尾轮虫的生活史及轮虫繁殖生物学研究综述 1 .2 . 1 . 1褶皱臂尾轮虫的生活史 褶皱臂尾轮虫 b r a c h i n o r u s p l ic a t i l i s ) 属轮虫门 单巢纲，其生活史存在孤雌 生殖和两性生殖两种繁殖方式， 即 世代交替现象。 通常情况下， 轮虫通过孤雌生 殖 ( p a rt h e n g e n e s i s ) 的方式繁衍种群。 在孤雌生殖期间， 母体产生的卵排出后粘 褶皱臂尾轮虫减数分裂基因b p d mc i 的克降及其初步分析 附在母体身体后端两侧、 下沉到水底或浮在水中， 不需受精而直接萌发形成子代 幼体，该母体为非混交雌体 ( a m i c t i c f e m a l e ) ， 其产生的卵叫非混交卵 ( a m i c t i c e g g ) 或夏卵 ( s u m m e r e g g ) ， 非混交卵个体较大、 卵 壳较薄而光滑， 无色透明且 可见到发育中的胚胎，染色体为 2 n 。当外界环境恶劣不适应轮虫生存时 ( 如: 温度骤然升降、 种群密度过高、 p h : d o剧变、 食物的种类改 变和数量补充受到 限制等) ， 种群开始出现混交雌体 ( mi c t i c f e m a l e ) , ( 混交雌体可分产生雄性卵和 产生需精雌性卵两种个体) ，混交雌体每次携带的 雄卵数量较多 ( 5 -7枚) 、 胚 胎发育时间短，不需受精直接发育成染色体数目 为n的雄性个体 ( ma l e ) ，雄性 个体只有母体的八分之一至三分之一间， 生殖系统和运动器官高度发达， 其它结 构尤其是消化系统极度退化， 运动速度极快，出生后不摄食任何食物， 通过混交 雌体的体壁把精子输送到体腔， 完成交配的雄轮虫几小时即刻死亡。 混交雌体所 产的 雌性卵为需精卵( m i c t i c e g g ) ， 经过受 精后形成 休眠卵( r e s t i n g e g g ) 。 休眠 卵个体较大， 外表常常颜色呈暗褐色被有突起或不同形态的刻纹、 长短不一的壳 束 ii 或其它装备。 从母体排出沉入水底或留在死亡后的母体内。 休眠卵能够抵御外 界高度的干燥低温和高温以及其它化学因子的剧烈变化，经过不同阶段的滞育， 待温度、 食物、 p h , d o等外界环境条件适合时休眠卵萌发形成子代新个体 非 混交雌体) 进入新一轮孤雌生殖阶段， 这样就形成一个完整的世代交替过程。 ( 图 7 - 2 7 . b i r k y ) 混交雌体和非混交雌体外部形态没有明显差别，但内部生理机制明显不同。 目前只有根据它们携带卵的类型来区分其所处的发育时期和繁殖方式。 (b 声 有丝分叙 . . . 峥翻 目 交生妞 ( 二 倍体孤雌生殖) = = 式洲 目 交( 两 性) 生 殖 夕肺肠幼襄 曲m 轮虫生活史 ( 自 b i r k y ) 人。认 洲、必班 己.曰个 1 .2 . 1 .2 轮虫繁殖生物学研究综述 对于轮虫繁殖生物学的研究，直至四十年代以后才引起轮虫学家的广泛关 褶皱臂尾轮虫减数分裂 基因b p d m c i 的克隆及其初步分析 注。 通过对轮虫生活史的观察和研究， 一致肯定了轮虫的世代交替模式并初步阐 述了环境因子对轮虫的世代交替过程的诱导和调 控作用。 但对诱导轮虫有性生殖 出现的原因争议颇多。因而生物学工作者分别从不同角度对其研究: 密度、 温度、 p h值、盐度、 d o , 渗透压、 光照、 食物的种类大小和丰度等都成为轮虫学家关 注的问题， 从此有关轮虫繁殖的研究文献日渐增多。 对于轮虫繁殖生物学的研究 国外起步较早，并且大部分研究都集中在单因子对轮虫有性生殖的诱导作用上。 不同的学者对于同一条件的诱导效果的解释亦不相同有的甚至争议很大。 研究材料的选择对于实验材料的选择早期主要以 水轮属 ( h y d a t i n a ) 为研究 对象， 后来则集中在个体较大、 分布广泛、 较易培养、 且具一定的应用价值的单 巢纲种类， 且绝大部分研究者都选择一些普生性的种类。 并且主要以臂尾轮虫属 ( b r a c h i n o r u s ) 、晶 囊轮虫属 ( a s p la n c h n a ) ， 椎轮虫属 ( n o t o m m a t a )的一些种 类为主。近年来椎轮属己用得很少，臂尾轮虫属主要偏重于曹花臂尾轮虫 ( b . c a ly c i 刀 o r u s ) ，红臂尾轮虫 ( b . r u b e n s ) ，壶状臂尾轮虫 ( b . u r c e u s ) ，角突臂 尾轮虫 ( b .a n g u l a r i s ) 。晶囊轮虫属中又以 西氏晶 囊轮虫 ( a . s i e b o l d i ) 、卜 氏晶 囊 轮虫 ( a . b r ig h t w e l l i ) 、中型晶囊轮虫 ( b . i n t e r m e d ia t e ) 为主兼以盖氏晶囊轮虫 ( a .g i r d o i ) 。随着海洋渔业的发展， 咸淡水种类褶皱臂尾轮虫 ( b .p l i c a t i l is )日 益引起人们的注目，也成为轮虫繁殖生物学研究的主要材料。 轮虫混交雌体的产生是轮虫由单性生殖向两性生殖转变及休眠卵产生的第 一步，它受众多的外源性因素及内源性因素的影响和制约。 1 .2 . 1 .2 . 1外源性因素 1 .2 . 1 .2 . 1 . 1温度 环境温度的改变， 特别是生物不可预测的骤然剧变，常常影响水生生物的行 为，其中包括生殖活动。温度刺激对轮虫混交雌体的形成具有重要作用。最先 r u t t n e r k o l i s k o ( 1 9 6 4 )曾 经做过这方面的实 验: 第一组， 把携带卵的红臂尾轮 虫从正常温度移入预先冷至到6 培养介质中， 在低温条件下经历2 小时，该组 作为急剧降温刺激组 ( s u d d e n c o l d s t i m u l u s , s s ) 、 第二组， 把轮虫培养介质在 1 小时内从常温降至6 c ， 并在该条件下维持1 小时， 记作 ( g r a d u al c o l d s t i m u l u s , g s ) 。第三组，控制在2 3 0c ( c o n t r o l , c ) 。前两组经历2 小时后均移到2 3 下 和第三组一起进行培养。 比 较它们后代个体 ( f 1 ) 的混交雌体占所有后代个体总 数的比例。结果发现: 第一组比例最高，第二组次之，第三组最低。统计结果表 明:s s 与g s和c之间存在明显差异，后两者之间没有差异。他认为该现象是 温度剧变所至。 但是在自 然环境下， 既使温度变化较缓的季节仍然会发生两性生 殖现象。由此可见， 温度的改变对混交雌体的形成具有明显的刺激效应， 但并非 是必要条件，有关温度因子的研究有待进一步开展。 摺皱臂尾轮虫减数分裂基因b p d m c i 的克隆 及其初步分析 1 . 2 . 1 . 2 . 1 . 2光照 光照对不同种类轮虫的混交雌体的形成具有不同程度的诱导作用。光谱成 分、光照强度、光照昼夜光长变化对不同的轮虫种具有不同的作用。l a d e r m a n 和g u t t m a n ( 1 9 6 3 ) 在研究中发现， 持续光照可以 诱导雄轮虫频频出 现。 在全黑 暗条件或至少保持4 2小时的全黑暗状态见不到雄轮虫。若把该轮虫放到有光的 条件下稍加刺激又出现雄性个体。 在此之后的阶段继续用光诱导时又没有发现雄 性个体。由 此他们认为光是必不可少的“ 触发刺激” ( t r i g g e r in g s t i m u l u s ) 。 若把 上述研究对象换成晶囊轮虫属时却很难发现上述效应。 臂尾轮虫属的种类对光的 反应存在种间差异。 红臂尾轮虫对光的诱导反应与椎轮虫相似， 而粤花臂尾轮虫 对光刺激没有反应。尽管如此，但绝大多数人确信: 光照时间的长短对粤花臂尾 轮虫有性生殖的出现虽然没有直接的诱导作用，但光照却无疑是有利的。其次， 光的波长范围和光强度对轮虫的非混交雌体的形成亦有不同影响。 波长为3 0 0 - 7 0 0 n m内，混交雌体百分率最大时的波长为4 2 5 - 4 7 5 n m。 波长继续增加，混 交雌体百分率又迅速下降。 从目 前研究来看， 对光的诱导效应机制意见不一，目 前对晶囊轮虫、臂尾轮虫的光诱导效应争议颇多，有待进一步研究。 1 .2 . 1 .2 . 1 . 3种群密度 密度的自我调节是种群保持稳定的一个重要特点， 生物为了其种群的自 身生 存与发展， 在坏境条件改变时， 各种不同形式的调节方式就开始起作用了。 对于 具有世代交替现象的轮虫来讲， 在适合的环境下， 以 快速、 便捷的孤雌生殖扩大 种群， 迅速占据空间对种群十分有益， 当种群密度接近环境最大负载力时， 种群 开始出现雄性个体与混交雌体交配进行有性生殖。 无疑， 这种方式使得种群轮虫 以 休眠卵形式离开种群使密度得到了 控制。6 0 年代的g i l l b e rt ( 1 9 6 3 ) 为了 验证 前人的观点， 他在相同相对密度下， 利用轮虫数目改 变， 而培养容器体积固定和 改变溶液体积轮虫数目固定， 结果发现曹花臂尾轮虫在密度4 .0 i n d / m l时混交雌 体数量比例最高，而 0 .6 6 i n d / m l时混交雌体数量几乎为零，且两种不同实验方 法在相同相对密度条件下单个培养与群体培养间混交雌体的比例没有任何变化。 根据这一实验结果， 他认为密度大小的改变确实可以诱导混交雌体的产生。 对于 密度因子的诱导机制存在较大争议，g i l l b e r t ( 1 9 6 3 )则认为，密度可以诱导混 交雌体的产生的主要原因是轮虫在在幼体期和种群快速生长期向环境分泌、排 泄、 释放某种不明成分的化学物质， 且这种物质仅幼年个体才能分泌。 有趣的是 他在实验中发现， 随着培养基中混交雌体比例的升高， 若不添加和更换新鲜培养 基， 混交雌体的比例却又下降， 几周后种群全部由非混交雌体组成， 种群再经急 剧增长后又重新出现混交雌体。c l e m e n t 和 p o u r r i o t ( 1 9 8 0 )认为密度的诱导作 用是通过“ 拮抗调节” 来实现的， 他们认为椎轮虫同时分泌增长因子与下降因子， 褶皱竹尾轮虫减数分裂 基因b p d mc 1 的克隆及其初步分析 前者在密度低时起作用， 促使混交雌体的形成且与其浓度无关， 只与轮虫与其作 用的时间呈正相关; 而后者只在种群密度达到一定程度时才开始发生作用， 后者 的主要作用是诱导雌体的卵黄管合成一种未名物质 ( x) ，该物质进入卵细胞质， 在胚胎发育过程中分布到轮虫不同的细胞中， 尤其是卵母细胞中， 当轮虫密度较 高时每个卵母细胞接受的合成物质就越多， 把轮虫转移到低密度时， 每一细胞从 母体接受部分该种物质。 前者总比后者先发挥效力， 但后者一旦出现， 其作用的 效果又远远大于前者且比其迅速， 使生长因子受到抑制。 也有人认为密度的诱导 效应实际上是食物丰度变化的结果。 因为， 随着密度的增加轮虫的饵料生物却在 大幅度减少。 自然环境中轮虫休眠卵和混交雌体的峰值与种群峰值具有同时出现 的趋势，与此相反，环境中食物的生物量随着种群峰值的增加而呈下降趋势 ( e d m o n d s o n , 1 9 6 5 ) 。另外，由于环境变化导致食物演替，d a b r a m o ( 1 9 8 0 ) 认为后续饵料的大小、质量并不一定适合该种轮虫的需要。 1 . 2 . 1 .2 . 1 .4食物 食物资源的组成、 丰度和食物的成分对轮虫混交雌体的形成具有明显的诱导 作用。首先， 不同食物的诱导作用差异很明显， 例如: 用绿色藻类投喂臂尾轮虫 时， 其后代混交雌体的比率高于投喂隐藻时的比率。 单独用酵母投喂臂尾轮虫时， 混交雌体数量不多但是休眠卵却很多，酵母 ( y e a s t ) 、小球藻 ( c h l o r e l l a ) 和裂 须藻( s c h i o t h r ix ) 混合使 用也能 得到 大量的 休眠卵 ( p o u r r i o t 和 s n e l l , 1 9 8 3 ) ，由 此看来， 不同的食物其诱导效应差异很明显。 其次， 食物对轮虫混交雌体的诱导 还表现在其可得性及其适口性上， 轮虫适口 饵料的大小为2 -1 8 t i r n 左右， 过大 过小对轮虫来讲都是不利的 ( d u m o n t , 1 9 7 7 ) . j o h a n s s o n ( 1 9 8 7 ) 在调查自 然境 环中庆毛轮虫 ( s y n c h a e t a )的生活史时 发现: 当 食物 为硅藻为主， 食物大小超过 3 0 11 m时， 种群中会出 现大量雄性个体。 轮虫食物丰 度的 变化对混交雌体的诱导 效应没有较大的分歧， 一般认为: 在轮虫食物浓度范围内， 随着食物浓度的增加 混交雌体的比 例减少， 当食物浓度高于上限或低于下限时， 种群出现有性生殖的 可能性都较大。 食物中的某些成分对混交雌体具诱导作用。 绿色植物和藻类中所 含的维生素e 对晶囊轮虫属不同的种类具有间接的诱导作用， 并能与种群密度协 同 作 用 促使 混 交 雌 体百 分比 明 显 升高( b ir k y j r . 1 9 7 1 , b ir k y j r .和g i ll b e r t 1 9 7 2 , gi l l b e r t 1 9 6 7 , 1 9 6 8 a , 1 9 6 8 b , 1 9 7 1 ，1 9 7 2 , 1 9 7 5 , 1 9 7 6 , 1 9 7 7 a , 1 9 7 7 b , 1 9 7 7 c , 1 9 7 7 d , 1 9 8 1 , 1 9 8 3 a , 1 9 8 3 b , 1 9 8 3 c , 1 9 9 3 , 1 9 9 5 a , 1 9 9 5 b ) 。西氏晶囊轮虫休 眠卵萌发出的第一代轮虫均为个体较小的囊型非混交雌体， 用含维生素ve 成分 的草履虫和在富含ve的培养液中培养的薯花臂尾轮虫作为食物投喂晶 囊轮虫， 结果发现后代出现两种不同的形态， 十字型和倒钟型。 十字型个体比囊型个体大， 体壁的前、 后端和两侧向外突出， 形成瘤状突出物， 其突起程度随ph, d o和 摺皱臂尾轮虫减数分裂基因b p d m c i 的克隆及其初步分析 环境渗透压的改变而发生变化。 该型所产后代个体中混交雌体的比例较高， 且与 瘤状突出物的突起程度呈正相关。 同时， 这种形态的个体后代混交雌体百分率不 再受其它环境因子的影响。 含ve 或具同类性质的物质诱导囊型和十字型个体产 生倒钟型个体， 这种个体体型较大且头冠与身体不成比例， 该型雌体也是典型的 非混交雌体。 也有部分个体体型介于十字型和倒钟型之间。卜 氏晶囊轮虫对含v e食物的反应与西氏晶囊轮虫接近但瘤状突出物的突起程度不如西氏晶囊轮虫 发达，后代没有倒钟型个体。 1 . 2 . 1 . 2 . 1 . 5 p h值 除了上述几方面外， 水的物理化学状况 ( 如: p h值、溶解氧等) 都无疑是 会影响轮虫的混交雌体的形成。m i t c h e l l ( 1 9 9 2 )的 研究结果表明: p h值为7 .5 和8 . 5 时粤花臂尾轮虫的混交百分率为5 % 和1 0 %, 9 .5 和1 0 . 5 时 均为2 0 % ; p h 值为7 . 5 和 8 . 5 时的休眠卵百分比 均为 1 0 %, 9 . 5 时为0 , 1 0 .5 时最高，为2 0 %. 1 .2 . 1 .2 . 1 . 6培养液的盐度 盐度是影响咸水性种褶皱臂尾轮虫混交雌体形成的主要外源性因素之一。 l u b z e n s等研究发现，他们所研究的褶皱臂尾轮虫在 1 0 0 %的海水 ( 3 0 时盐度 为3 8 % 0 )中无混交雌体形成，即使种群密度大于4 0 i n d / m l时也一样。 但当将其 移入 5 0 %或 2 5 %的海水中时，9 0 % 1 0 0 %的个体产生混交雌体。有关盐度影响 褶皱臂尾轮虫混交雌体形成的机理，目 前尚不清楚。 p o u r r i o t ( 1 9 8 3 ) 等推测， 较高的盐度可能阻止混交雌体的出现， 而当培养液盐度一旦降低， 这种阻止作用 便会消失，混交雌体便在其他一些环境因子的诱导下形成。 1 .2 . 1 .2 .2内源性因素 1 .2 . 1 .2 .2 . 1遗传因素 混交雌体的形成因同种轮虫不同品系的遗传差异而存在较大的差异。h i n o ( 1 9 7 7 )等通过褶皱臂尾轮虫2 0 个品系的研究发现，有些品系在有性生殖进行 到第2 5 代后仍无混交雌体产生。而另一些品系则几乎每代都有混交雌体产生。 p o u r r i o t ( 1 9 7 7 ) 等通过对龙大锥轮虫3 个品 系在不同 的种群密度、 集群( g r o u p i n g ) 和母体 ( 祖母) 年龄情况下混交雌体形成的比较研究后发现， 每一个品系都可能 形成混交雌体， 但混交雌体形成的比例却在品系间存在明显的差异。 g i l b e rt的研 究结 果 也表明， 混交 雌 体的 产生 在 一 定 程 度上由 遗 传 控 制。 s n e ll ( 1 9 8 5 ) , h a g iw a r a ( 1 9 8 8 , 1 9 9 8 ) 和l u b z e n s 等也 在褶皱臂尾轮虫不同品 系间发现了 相似的 差异。 在大量研究的基础上，p o z u e l o ( 1 9 8 8 )认为，混交雌体的产生是由遗传决定的， 环境因子对其具有调节作用。 1 .2 . 1 .2 .2 .2 母体年龄 p o u r i o t ( 1 9 7 7 ) , r o u g i e r ( 1 9 7 7 ) 等研究发现， 曹花臂尾轮虫和红臂尾轮虫 褶皱臂尾轮虫减数分 裂基因b p d m c 1 的克隆及其初步分析 母体的年龄与其后代中混交雌体的比例呈显著的负相关。 非混交雌体在其一生中 的最初几天内， 所产卵的8 0 % 9 0 %发育成混交雌体;随着母体年龄的增大，该 百分率下降。 进一步的研究表明， 在特定的环境条件下， 母体年龄对混交雌体的 影响随着培养液更换频率增大到每天一次而消失。 c l e m e n t 等( 1 9 7 7 , 1 9 7 9 , 1 9 8 0 ) 发现， 龙大椎轮虫母体年龄对后代混交雌体的形成也具有相似的影响， 这种影响 甚至涉及到祖代雌体 ( 祖母)的年龄。 1 .2 . 1 .2 .2 . 3 轮虫孤雌生殖的累计世代数 h i n e ( 1 9 7 7 )等通过对褶皱臂尾轮虫的研究发现， 轮虫的有性生殖至少经两 个阶段完成。 第一个阶段是获得产生混交雌体的能力， 这种能力往往在轮虫孤雌 生殖进行一代后即可形成; 第二个阶段是外源性因子如高密度的作用， 这种作用 只有对经过了第一阶段的轮虫才有效。 1 . 2 . 2轮虫遗传学相关研究 历史上， 有关轮虫的研究涉及方方面面， 和其它生物一样， 现今分子生物学 技术的进步给轮虫遗传学带来了前所未有的机遇，并使之朝着几个方向深入发 展; 1 . 2 .2 . 1种群遗传学 1 9 世纪7 0 年代末，运用蛋白质电泳分析方法， 进行了许多种内及种间的等 位基因酶的变异研究， 也为轮虫与其它生物之间的系统发育关系的确定提供了证 据。 但是由于被调查的种群，克隆和酶的数量等因素限制，克隆和培养大量轮虫 来获得用于蛋白 质分析的充足样品导致了巨大的工作量。 进来， 随着p c r 技术在 生物学各个领域被广泛的应用， 利用微卫星来描述自 然种群特征成为轮虫种群遗 传学研究中的一个进展，其优于等位基因酶的一个特点是微卫星 d n a可以用 p c r来克隆，这样多位点可以从一个个体中被检测到，解决了大量培养轮虫带 来的麻烦。 但是现有关于等位基因酶标记的丰富数据， 仍可用于研究浮游动物种 群间的遗传差异。 多数实验结果表明， 轮虫种群隔离 距离和遗传距离之间存在很 高的正相关， 交配行为是克隆类群具有的和轮虫种群构建的重要隔离障碍， 交配 识别信息素 ( m r p )的糖蛋白结构的差异很可能在维持臂尾轮虫种边界方面扮 演主要角色。( g o m e z a , 1 9 9 5 ; k o t a n i t , 1 9 9 7 ; s e r r a m, 1 9 9 8 )己 证明海洋 轮虫种群的形态学和遗传学的研究存在显著差异， 褶皱臂尾轮虫( 周期性孤雌生 殖轮虫是研究生殖模式和种群结构的一个有价值的模式生物， 褶皱臂尾轮虫常被 作为 此类轮虫的 代表) 是由 多于一 个的生 物种组成的 类群( g o m e z a , 1 9 9 6 ; s e g e r s h , 1 9 9 5 ) ，传统的分类学己经低估了轮虫的生物多样性 ( o r e l l s r , 2 0 0 0 ) .微 卫星分析揭示了轮虫种群中惊人高水平的克隆多样性，这源于休眠轮库处于 褶皱臂尾轮虫减数分裂 基因b p d mc i 的克隆及其 初步分析 h a r d y - w e i n b e r g 和连锁平衡， 并包含高水平的基因 型多样性。 但休眠卵库与轮虫 种群在其等位基因组成 f _ 有差异， 认为休眠卵的孵化是 偏斜的。 ( g o m e z a , 2 0 0 0 ) 与以前发表的系统地理数据进行比较， 在邻近种群中 通过分歧的m t d n a单元型 检测到了核基因的深入， 这强调了这些生物体在地方范围内 殖民史的长期持续的 影响和基因流的调节影响。( g o m e z a 研究蜓态轮虫和非蛙态轮虫基因组内 的四 个基因一一 h s p 8 2 ( 8 2 - k d 热 休克蛋白 ) ， t b p ( t a t a - b o x结 合蛋白) ， r p o 1 3 i ( r n a聚合 酶 i i i 大亚 基) ， 和t p i ( 丙糖磷酸异构酶) 的序列趋异， 发现这些基因 不包含十分相似的一对单倍 型，而是包含高度趋异的等位基因核昔序列 ( w e lc h d m 报告了在轮虫三个基因内发现的内含子的存在和位置， 证明蜓态轮虫内存在内含 子， 一些在保守位置， 其它似乎是在蛙态轮虫进化过程中新产生的( w e l c h d m 在粗线期， 完全配 对的非姐妹染色单体之间发生同源重组， 形成交叉。 交叉在双线期特别明显。 减 数分裂 1 完成后， 同源染色体移向两极， 每极细胞的染色体数目 减半。 减数分裂 褶皱臂尾轮虫减数分裂基因b p d m c 1 的克隆及其初步分析 ”1 j 一般的有丝分裂相似的是姐妹染色体之间的分离。 性母细胞经过两次连续的 分裂，形成 4 个单倍体细胞。 受精后， 合子中的染色体数目恢复到二倍体，保持 了生物体遗传的稳定性。同时， 在减数分裂过程中，同源染色体的联会与重组产 生了一些新的可遗传的变异，这些可遗传的变异是生物进化和多样性的基础。 虽然减数分裂相当于由连续的有丝分裂组成， 并且减数分裂和有丝分裂的许 多调控分子在功能或结构上是保守性的， 但是可以肯定， 减数分裂的调控方式有 较大程度的修饰，以保证减数分裂染色体行为的特殊性: ( 1 ) 重组是发生在同源 染色体间，不是在姐妹染色体间; ( 2 ) 减数分裂 1 是同源染色体之间的分离，减 数分裂n是姐妹染色体的分离。 联会、 重组和分离是减数分裂的关键事件。 近几 年，人们对减数分裂的细胞学、生化和遗传机制进行了深入研究，利用酵母 ( s a c c h a r o m