（动物学专业论文）绒山羊联会复合体蛋白3基因的克隆、转录表达及多克隆抗体的制备.pdf

内蒙古大学硕士学位论文 绒山羊联会复合体蛋白3 基因的克隆、转录表达及多克隆抗体的制备 摘要 联会复合体( s y n a p t o n e m a lc o m p l e x ，s c ) 是一种呈框架状结构的蛋白质复合 体，在进化上十分保守，见于绝大多数物种的减数分裂中。联会复合体蛋白质 ( s y n a p t o n e m a lc o m p l e xp r o t e i n ，s c p ) 的表达具有严格的时问和空间特异性：它 出现于减数分裂i 前期的细线期( 1 e p t o t e n e ) ，消失于双线期( d i p l o t e n e ) ；s c 与染 色体的凝缩，同源染色体的配对、重组以及双链断裂( d o u b l e s t r a n db r e a k ，d s b ) 的形成有关。联会复合体蛋白3 ( s c p 3 ) 是联会复合体蛋白的重要组成部分， 是减数分裂特异表达的蛋白。 本研究对绒山羊s c p 3 的基因序列进行了克隆和测序，并对其在早期个体中 的转录水平进行了研究，最后制备了该基因产物的抗原表位多肽，并制备了多 克隆抗体。首先，分别比较了人、大鼠、小鼠、牛的s c p 3 的序列，根据序列同 源性设计相应引物，并利用绒山羊睾丸组织的e d n a 作为模板，通过r t - p c r 扩增得到s c p 3 基因8 9 0 b p 的序列片段，将扩增的产物连接到p m d 1 9 t 载体中 进行测序，将所得的序列利用b l a s t 软件进行分析，结果表明，克隆的绒山羊 s c p 3 的序列与牛的同源性可达9 5 以上，并且与人、小鼠、大鼠的序列相比也 具有较高的同源性，通过比对确定克隆到的序列已包含了从起始密码子到终止 密码子的编码区的所有序列。 在克隆得到编码区序列的基础上，利用r t - p c r 技术对早期绒山羊个体s c p 3 的m r n a 转录水平进行了检测。分别取4 5 d 、5 6 d 、6 6 d 、6 9 d 、7 3 d 、8 6 d 、9 5 d 、 1 0 2 d 、1 1 0 d 、1 2 2 d 的绒山羊睾丸组织，以g a p d h 作为内部参照，对其转录水平 侯越绒山羊联会复合体蛋白3 基因的克隆、转录表达及多克隆抗体的制备 进行检测。结果显示：5 6 d 的绒山羊睾丸组织样品检n n s c p 3 基因的转录表达， 4 5 d 、6 6 d 和6 9 d 三个样品中没有检测s c p 3 基因的转录表达，从7 3 d 后的所有样品 都检测到却3 基因的转录表达。 在制备s c p 3 抗原的实验中，对已得到的s c p 3 序列进行抗原表位和蛋白结构 的综合分析，确定高表位的片段，进行p c r 扩增。将扩增片段与原核表达载体 p e t - 4 4 a ( + ) 连接，通过p c r 、酶切的鉴定、以及对阳性克隆质粒的测序，证明 p e t - 4 4 a ( + ) s c p 3 载体构建成功。将载体质粒转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 感受态菌，在 l m m o l l 的i p t g ，诱导6 d x 时得至i j s c p 3 的蛋白，并通过亲和层析纯化，同时通过 s d s p a g e 、w e s t e r nb l o t 对表达蛋白进行检测，得到一条大小为1 5 k d a 蛋白与预 计蛋白分子量大小一致，证明目的蛋白诱导成功。将s c p 3 抗原蛋白免疫昆明白 小鼠，通过s 1 8 0 细胞刺激，产生腹水，得至u s c p 3 的多克隆抗体。 关键词：绒山羊，联会复合体蛋白3 ( s c p 3 ) ，克隆，转录表达，抗原蛋白 内蒙古大学硕士学位论文 c l o n i n go fc a s h m e r eg o a ts y n a p t o n e m a l c o m p l e xp r o t e i n3 、t r a n s c r i p t i o ne x p r e ss i o n a n dp r e p a r i n gt h ep o l y c l o n a la n t i b o d y a bs t r a c t s y n a p t o n e m a lc o m p l e x ( s c ) i sa ne n d o n u c l e a rp r o t e i nc o m p l e xt h a ti sf o r m e d d u r i n gt h eh o m o l o g o u sc h r o m o s o m em a t c h i n g i nt h ef i r s tm e i o s i sp r o p h a s ei n e u k a r y o t i cg e r mc e l l s s cp r o t e i n s ( s c p s ) a r et e m p o r a r i l ye x p r e s s e dd u r i n gl e p t o t e n e o ft h em e i o s i s p r o p h a s e ，a n dt h e y a r ed e g r a d e dd u r i n gd i p l o t e n e s c p sa r e e v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e di nm o s tm a m m a l i a ns p e c i e sa n ds ch a sb e e nr e p o r t e dt ob e i n v o l v e di nc h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o n ，r e c o m b i n a t i o na n dd o u b l e s t r a n db r e a k s ( d s b ) ，h o m o l o g o u s c h r o m o s o m em a t c h i n ga n dan u m b e ro fo t h e ri m p o r t a n t b i o p r o c e s s e s 。s y n a p t o n e m a lc o m p l e x ( s c ) p r o t e i n s ，e s p e c i a l l ys c p 3 ，p l a ya c r u c i a l r o l ei ns cf o r m a t i o nd u r i n gm a l eg e r mc e l lm e i o s i s i th a sb e e nn o tg o tt h es e q u e n c eo ft h ec a s h m e r eg o a ts c p 3g e n eu pt on o w i n t h i ss t u d y ，w ec l o n e dt h es c p 3 g e n eo fc a s h m e r eg o a t ，a n de x a m i n e ds c p 3 t r a n s c r i p t i o ni np r e p u b e r t a lc a s h m e r eg o a tt e s t e s f i n a l l yw ep r e p a r e dt h ep o l y c l o n a l a n t i g e ng e n ep r o t e i n a n di t i sg o o db a s i sf o rt h en e x tp r e p a r a t i o no ft h ep o l y c l o n a l a n t i b o d y f i r s t l y ，b a s e do nt h ea n a l y s i so fh o m o l o g y o ft h es c p 3s e q u e n c ea m o n gt h e c a t t l e ，h u m a n ，m o u s ea n dr a t ，d i f f e r e n ts e t so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yt h e c o r r e s p o n d i n gu n k n o w nr e g i o no fc a s h m e r eg o a t w es u c c e s s f u l l yc l o n e dt h ec o d i n g 6 侯越绒山羊联会复合体蛋白3 基因的克隆、转录表达及多克隆抗体的制备 s e q u e n c eo fc a s h m e r eg o a ts c p 3g e n e o u rr e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h ep c rp r o d u c t sa r e a r o u n d8 5 0b p ，c l o n e ds c p 3m a t c h e dt h ep r e d i c t e ds i z eo fs c p 3g e n e t h ep c r p r o d u c t sw e r el i g a s e di n t op m d 一1 9 tv e t o ra n ds e q u e n c e d w h e nt h es c p 3g e n e s e q u e n c ed e r i v e df r o mc a s h m e r eg o a tw a sc o m p a r e dw i t ht h o s ef r o mr a t ，m o u s e ， h u m a na n dc o w ，d a t as u g g e s t e dt h a tt h e yw e r eh i g h l yh o m o l o g o u s ( 8 3 ) ，e s p e c i a l l y b e t w e e ng o a ta n dc o ws c p 3g e n e s ( h o m o l o g y 9 8 ) i na d d i t i o n ，w ei n v e s t i g a t e dt h ed e v e l o p m e n to fp r e p u b e r t a lc a s h m e r eg o a tt e s t s b yu s i n gm o l e c u l a rb i o l o g i c a la p p r o a c h a f t e rt h es c p 3c o d i n gs e q u e n c eo fc a s h m e r e g o a tw a si d e n t i f i e d ，w ea n a l y z e dt h es c p 3m r n a e x p r e s s i o ni nt e s t i c u l a rt i s s u e so f c a s h m e r eg o a t sa td i f f e r e n tt i m ep o i n t s ，a n dd i s c o v e r e dt h et i m ef o rf i r s tr o u n d m e i o s i s t h eg o a tt e s t i c u l a rt i s s u e sf r o mp o s t n a t a ld a y s4 5 ，5 6 ，6 6 ，6 9 ，7 3 ，8 6 ，9 5 ，10 2 ， 110 ，a n d12 2w e r ea n a l y z e df o rs c p 3t r a n s c r i p t i o n a le x p r e s s i o n t h et i s s u e sf r o m p o s t n a t a ld a y s5 6a n d7 3t o 12 2w e r ed e t e c t e df o rs c p 3t r a n s c r i p t i o n ，w h e r e a st h e t i s s u e sf r o mp o s t n a t a ld a y s4 5 ，6 6a n d6 9w e r en o td e t e c t a b l e t h e s er e s u l t si l l u s t r a t e t h a tt h ef i r s tr o u n dm e i o s i si nt h ec a s h m e r eg o a tt e s t e so c c u r sm o s t l yb e h i n d p o s t n a t a ld a y7 3 t h e r e f o r e ，w ec o u l dn o td e f i n eas p e c i f i ct i m ep o i n tf o rt h ef i r s t r o u n dm e i o s i si ng o a tt e s t i s ，t h o u g ht h ef i r s tr o u n do fm e i o s i si na n a l y z e dc a s h m e r e g o a tt e s t e so c c u r r e dm o s t l yb e h i n d7 3d a y sa f t e rb i r t h b a s e do nt h ec o d i n gr e g i o ns e q u e n c e ，w ep r e p a r e dp o l y c l o n a la n t i g e no fs c p 3 f i r s t l y ，w ea n a l y z e de p i t o p es e q u e n c ea n dp r o t e i n s t r u c t u r eo ft h es c p 3 ，a n dt o i d e n t i f yh i g h e p i t o p ef r a g m e n tf o rp c ra m p l i f i c a t i o n t h ea m p l i f i e df r a g m e n ta n d p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 4 4 a ( + ) w e r el i g a s e d t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n 7 内蒙古大学 硕士学位论文 p e t - 4 4 a s c p 3w a si n d u c e di n 1m m o l lo fi p t g ，6h o u r s w h e ne x p r e s s e dt h e p r o t e i n ，w ep u r i f i e dt h e mv i aa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y a f t e ri d e n t i f i c a t i o no fp c r a n dr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n ，s e q u e n c i n go fp o s i t i v ec l o n e s ，t h es e q u e n c i n g r e s u l t sw i t hk n o w ns e q u e n c e sa r et h es a m e a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tp e t - 4 4 a s c p 3w e r es u c c e s s f u lc o n s t r u c t e d a tt h es a m et i m e ，s d s - p a g e ，w e s t e r nb l o t a s s a y o fp r o t e i ne x p r e s s i o n a r o u n da15 k d ap r o t e i nb a n dw i t ht h ee x p e c t e d m o l e c u l a rw e i g h t ，s i n c et h ee n do ft h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw i t h6h i st a gf u s i o n ，t o r e c o g n i z eh i sa n t i b o d y ，a n t i h i sa n t i b o d i e sa n dp u r i f i c a t i o nf o rt h ef u s i o np r o t e i n a f t e rw e s t e r nb l o th y b r i d i z a t i o n ，t h es a m ec o l o ra f t e rt h ee m e r g e n c eo fab a n do f 15 k d at h a tt h ep r o t e i ni sp u r i f i e dw i t hah i st a gf u s i o np r o t e i n a tl a s t ，a l lt h er e s u l t s s h o w e dt h a tw eh a v es u c c e s s f u l l yg o tt h er i g h ts c p 3a n t i g e n i cp r o t e i n k e y w o r d s ：c a s h m e r eg o a t ，s y n a p t o n e m a lc o m p l e xp r o t e i n3 ( s c p 3 ) ，c l o n i n g ， t r a n s c r i p t i o n ，a n t i g e np r o t e i n 8 侯越绒山羊联会复合体蛋白3 基因的克隆、转录表达及多克隆抗体的制备 缩略词 c d n a d s b e d t a 口t g m 砌呵a p b s p c r s c s c p s c p 3 s c p 3 s d s r t p c r x - g a l 英文全称 c o m p l e m e n t a r yd n a d o u b l e s t r a n db r e a k 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s 中文全称 互补d n a 双链断裂 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 i s o p r o p y lb e t a - d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基一b - d - 硫代半乳糖苷 m e s s e n g e rr n a信使r n a p h o s p h a t eb e l a n c e ds o l u t i o n 磷酸缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 s y n a p t o n e m a lc o m p l e x ,联会复合体 s y n a p t o n e m a lc o m p l e xp r o t e i n 联会复合体蛋白 s y n a p t o n c 夏n a lc o m p l e xp r o t e i n3联会复合体蛋白3 s y n a p t o n e i n a lc o m p l e xp r o t o n3g o n e联会复合体蛋白3 基因 s o d i u md o d e c y l s u l f a t e十二烷基硫酸钠 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转录聚合酶链式反应 5 - b r o m o 一4 c h l o r o 一3 一i n d o l y l- 溴一4 - 氯一3 一吲哚1 3d 半乳糖苷 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已 经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得内墓直盍堂及 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：堡墅指导教师签名：学位论文作者签名：l 叁整指导教师签名： 日期：丝翌：竺日期： 在学期间研究成果使用承诺书 厂 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，1 1 1 】内蒙古大学有权将学位论文的全 部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索， 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古 大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：盟 日期：塑盟兰尘 指导教师签名： 日期： 厂 侯越绒山羊联会复合体蛋白3 基凶的克隆、转录表达及多克隆抗体的制备 第一章绒山羊联会复合体蛋白3 基因( s c p 3 ) 的克隆以及在早期个 体中转录水平的检测 引言 联会复合体( s y n a p t o n e m a lc o m p l e x ，s c ) 是真核生物在性细胞发生过程中第一次减数分裂 前期同源染色体配对时形成的一种核内临时结构【l 】，是一种呈框架状结构的蛋白质复合体， 在进化上十分保守，见于绝大多数物种的减数分裂中。联会复合体蛋白质( s y n a p t o n e m a l c o m p l e xp r o t e i n ，s c p ) 出现于减数分裂i 前期的细线期( 1 e p t o t e n e ) ，消失于双线期( d i p l o t e n e ) ； s c 与染色体的凝缩、 同源染色体的配对、重组以及双链断裂( d o u b l e s t r a n db r e a k ，d s b ) 的形 成有关【2 “】。正是由于s c 在第一次减数分裂中所扮演的关键角色，它的结构和功能以及其编 码基因的异常必将影响生殖细胞的正常发生。国内外均对s c 进行了深入的研究【5 1 。 目前在哺乳动物中已经发现的联会复合体蛋白质有3 种，分别命名为s c p l 、s c p 2 和s c p 3 。 s c p 的表达缺失或s c p 的基因突变可引起s c 的异常或s c 功能丧失，导致减数分裂发生失败或 非整倍体配子的产生，引发哺乳动物癌症的发生、精子发生障碍和不育等其他疾病的发生【6 】。 对联会复合体蛋n 3 ( s c p 3 ) 的研究发现，s c p 3 是雄性生殖细胞中联会复合体形成必需的组 成部分，同时在精母细胞中染色体联会、减数分裂和精子的发生也起着重要的作用【j 7 1 。在人 类原发无精症患者中也进行了s c p 3 的突变筛选，结果显示s c p 3 基因的变异直接导致无精症 【8 】。这是至今为止证明除了在小鼠模型上定点突变能引起雄性不育外，在人类基因突变也可 导致男性不育的少数例子之一。同时也是这类基因中第一个位于常染色体上的基因 9 1 。 s c p 3 在进化上的高度保守性表明它在其它哺乳类动物的生殖细胞减数分裂发生过程中可 能起着关键的作用。至今为止，已经报道了人、大鼠、小鼠、牛的s c p 3 基因的序列，促进了 对s c p 3 基因的结构功能研究。然而，绒山羊的s c p 3 基因的序列的研究报道至今还没有。随 着山羊雄性生殖细胞发育研究的兴起，有必要对绒山羊s c p 3 基因进行克隆和d n a 序列测定。 本研究首次对绒山羊的s c p 3 基因进行了克隆，通过与其他物种比对鉴定了该基因的d n a 序 列。 从分子生物学角度对哺乳动物睾丸青春前期的生殖发育进行研究还很少见。到目前为止 对哺乳动物睾丸青春前期的发育研究大多是从形态学、激素调控、旁分泌的角度进行探讨【1 0 9 堕鍪点盔堂堡主堂垡堡壅 1 1 】。与雌性动物的减数分裂发生在卵子发生时期不刚12 1 ，雄性动物精子发生过程的减数分裂 是动物出生后青春前期阶段发生的。从细胞分化发育特征来看，青春前期睾丸发育可分为减 数分裂前和减数分裂后两个明显的阶段。s c p 3 是减数分裂特异的蛋白质 1 3 , 1 4 】。因此我们选择 s c p 3 基因的表达作为青春前期这两个阶段的分水岭。本研究应用s c p 3 基因的d n a 序列信息， 设计引物，以内蒙古自治区阿尔巴斯绒山羊为实验材料，首次对早期绒山羊个体s c p 3 基因的 表达和第一轮减数分裂的时间点进行了初步探讨，为研究绒山羊睾丸青春前期的发育打下基 础。 材料与方法 1 实验材料 1 1 试剂及耗材 p m d l 9 - t 载体、限制性内切酶和t 4d n a 连接酶、m m l v 反转录酶、t a qd n a 聚合酶、 d n am a r k e r 等均购至t a k a r a 公司；r n a 提取试剂盒购至上海华舜生物工程有限公司和北京天 根公司；胶回收试剂盒购至q i a g e n 公司；其余质粒和菌株均为本实验室保存；化学试剂均 为国产的分析纯。 1 2 主要仪器设备 p c r 仪( b i o m e t r a ，t 1t h e r m o b y c l e r ) ，水平电泳仪( 北京六一仪器厂，d y c p 31a ) ，凝 胶成像仪( b i o p a d ，p 9 1 ) ，紫外分光光度仪( b i o r a d ，2 7 3 b r 0 1 0 6 3 ) ，气浴培养摇床( 江 苏省太仓市科教仪器厂) ，高速离心机( e p p e n d o r f ) ，超低温冰箱( s a n y o ，m d f u 3 2 v ) 振 荡器( 海宁仪器厂) ，磁力搅拌器( 国华8 5 2 ) ，p h 计( d e l t a 3 2 0 ) ，电子分析天平( p r e c i s a x t2 2 0 ) ，移液器( e p p e n d o r f ) ，紫外投射仪( u v p ) 。 1 。3 溶液配制 ( 1 ) 液体l b 培养基 酵母提取物5g ，胰化蛋白胨1 0g ，n a c l1 0g ，溶于8 0 0m l 去离子水中，调p h 至7 0 ，定 容至1 0 0 0m l ，高压灭菌，4 保存备用。 ( 2 ) 固体l b 培养基 酵母提取物5g ，胰化蛋白胨1 0g ，n a c l1 0g ，琼脂1 5g ，溶于8 0 0m l 去离子水中，调p h 至7 0 ，定容至1 0 0 0m l ，高压灭菌，4 保存备用。 ( 3 ) s o b 培养基 胰蛋白胨2 0g ，酵母提取物5g ，n a c l 0 5g ，加去离子水至8 0 0m l ，搅拌溶解，然后加入 1 0 侯越绒山羊联会复合体蛋白3 基因的克隆、转录表达及多克隆抗体的制各 2 5 0m m o l lk c l1 0m l ，调p h 至7 4 ，定容至总体积1l ，高压灭菌，使用前加入5m l ，经高压 灭菌的2m m g c l 2 。 ( 4 ) s d s 碱裂解法小量制各质粒所需溶液 a 溶液i 葡萄糖5 0 m m o l l ，t r i s c 1 ( p h8 0 ) 2 5m m o l l ，e d t a ( p h8 0 ) 1 0m m o l l 。 b 溶液i i n a o h0 2m o l l ，s d s1 。 c 溶液 5 m o l l 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸11 5 m l ，h 2 02 8 5 m l 。 ( 5 ) t e 缓冲液( p h8 0 ) t r i s - c 1 ( p h8 0 ) 1 0 m m o l l ，e d t a1 m m o l l 。 ( 6 ) 5 0 x t a e 缓冲液 2 4 2gt r i s - b a s e ，5 6 7m l 冰乙酸，1 0 0m l0 5me d t a ( p h8 o ) 。 1 4 绒山羊睾丸组织 从鄂尔多斯恩格贝绒山羊生物技术繁育中心现场取得内蒙古白绒山羊新鲜的睾丸组织 块，将睾丸组织块( 将组织块大小控制在3 0 5 0 1 x g ) 放入冷冻管后立即放入液氮罐保存，带 回实验室后置于8 04 c 冰箱保存备用。 1 5 引物序列 根据g e n b a n k 公布的人( n m _ 1 5 3 6 9 4 ) 、大鼠( n m _ 0 1 3 0 4 1 ) 、小鼠( n m - o l1 5 1 7 ) 、牛 ( b c l 0 2 4 3 3 ) 的印3 基因的核苷酸序列，通过c l cf r e ew o r k b e n c h3 软件进行比对，找到保守区， 然后根据牛的s c p 3 m r n a 序y l j ( b c l 0 2 4 3 3 ) 设计p c r 弓 物，上游引物5 端起始于起始密码子上游， 下游引物5 端起始于牛s c p 3 序列的终止密码子下游，设计出了一对扩增i _ l j 羊s c p 3 基因c d n a 编 码区的引物。引物序列见下表1 1 ： 表1 1r t - p c r 引物序列 t a b l e1 1s e q u e n c e so fr t - p c rp r i m e r s 2 实验方法 2 1 核酸的制备 内蒙。占大学硕士学位论文 2 1 1 睾丸组织的总r n a 的制备 从绒山羊睾丸组织块分离，总, r n a 。通过匀浆器将组织研磨碎，利用总r n a 提取试剂盒并 按照使用说明书的操作程序提取绒山羊睾丸组织总r n a ，利用紫外分光光度仪测定r n a 浓度 后，置于8 0 冰箱保存备用。 2 1 2e d n a 第一条链的合成 利用m m l v 反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，建立如下的1 0 “l 反转录体系，6 5 水浴中5 m i n ，冰浴1 0 m i n 。 r n a s a m p l e o l i g o ( d t ) 1 8 ( 1 0l a m ) h 2 0 0 5 鹏 1 肛l u p t o1 0 此 将上述1 0 此体系加入到下述的1 0 此体系中，混合，4 2 。cl h ，7 2 6 c1 0 r a i n ，存于一2 0 c 备用。 5 m m l vb u f f e r d n t p ( 1 0m m ) r i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ( 10 u i x l ) m - m l v ( 2 0 0 u i x l ) h 2 0 4 皿 2 止 1 皿 0 5 皿 2 5 止 2 2 序列的克隆 以上述得到的e d n a 第一链为模板，以表1 1 所列的序列为引物，建立1 0p l p c r 反应 体系：模板e d n a1p l ，s c p 3 一s e n s e ( 1 0 i t m ) 0 2p l ，s c p 3 - a n t i s e n ( 1 0 i _ t m ) 0 2p l ，t a k a r a t a q ( 5 u l a l ) 0 2 p l ，m g c l 2 ( 2 5 r a m ) 0 4t a l ，1 0 x p c rb u f f e r ( m 9 2 + f r e e ) 1 l ，d n t pm i x t u r e ( 1 0 m m ) 0 2p l ，d h 2 06 8l a l ；反应条件为：9 4 c 预变性4m i n ，然后9 4 。c4 0 s e e ，5 6 。c4 0s e c ， 7 2 。cl m i n ，共3 5 个循环，7 2 c 延伸1 0m i l l 。反应结束后取1 0 “lp c r 产物经1 琼脂糖凝 胶电泳检测。 2 3 琼脂糖凝胶电泳以及凝胶回收d n a 按照优化后的条件扩大p c r 反应，将p c r 反应的产物在1 琼脂糖凝胶中电泳，e b 染 色观察，然后在紫外投射仪下将目的片段切下，用凝胶回收试剂盒回收目的片段，测定浓度， 2 0 保存。 1 2 侯越绒山羊联会复合体蛋白3 基因的克隆、转录表达及多克隆抗体的制备 2 4 连接反应 建立如下的1 0 此连接体系，将回收片段与p m d l 9 - t 载体相连，于1 6 。c 下进行连接， 反应5 小时以上。 p m d l 9 - tv e c t o r s c p 3 胶回收片段 s o l u t i o ni h 2 0 1 此 1g l 5g l 3g l 2 5 感受态细胞的制备与转化 感受态细胞按分子克隆实验指南中的电转法制备，并以4 0 刖管分装与e p p e n d o r f 管中， 8 0 。c 保存备用。取1 止连接产物按常规方法对感受态菌进行转化。 2 6 重组菌的鉴定 将重组d n a 转化e c o l id h s c t 感受态细胞，在含有氮苄青霉素、i p t g 和x g a l 的l b 琼 脂平板上，进行蓝白斑筛选，获得c d n a 克隆重组质粒p m d l 9 - t - g s c p 3 。进一步用p c r 法和 e c o ri + s a li 双酶切鉴定重组质粒p m d l 9 t - g s c p 3 。将阳性菌株的菌液保存8 0 。c 。 2 7 测序 将保存阳性待测菌液送至北京华大基因研究中心测序。 2 8 测序结果分析 将所得的测序结果与n c b i 已公布的其他物种对应的序列进行比对，根据比对结果的相似 性以确定克隆序列的正确与否。 2 9s c p 3 基因在早期个体中的转录表达 2 9 1 不同时期睾丸组织的收集 分别取4 5 d 、5 6 d 、6 6 d 、6 9 d 、7 3 d 、8 6 d 、9 5 d 、1 0 2 d 、11 0 d 、1 2 2 d 的绒山羊睾丸组织。 2 9 2 核酸的制备 同2 1 。 2 9 3 引物的设计 根据已克隆得到山羊s c p 3 的编码区的序列设计引物，引物序列如下： 1 3 内蒙古大学硕士学位论文 2 9 4r l _ p c r 以表1 2 所列的序列为引物，建立1 0 9 lp c r 反应体系：模板c d n alg l ，s c p 3 p i ( 1 0g m ) 0 2l a l ，s c p 3 一p 2 ( 1 0 “m ) 0 2g l ，t a k a r at a q ( s u p l ) 0 2o l ，m g c l 2 ( 2 5 r a m ) 0 6i x l ，1 0 x p c r b u f f e r ( m 9 2 + f r e e ) 1g l ，d n t pm i x t u r e ( 1 0 r a m l0 2g l ，d i - 1 2 06 6p l ： 反应条件为：9 4 预变性4 m i n ，然后9 4 * ( 24 0 s e c ，5 8 c4 0 s e c ，7 2 5 0 s e c ，共3 5 个循环， 7 2 。c 延伸1 0 m i n 。反应结束后取1 0g lp c r 产物经1 琼脂糖凝胶电泳检测。 2 9 5 内参的设定 内参引物序列如下： 表1 3g a p d h 引物序列 t a b l e1 3s e q u e n c e so fg a p d hp r i m e r s 以表1 3 所列的序列为引物，建立l og lp c r 反应体系：模板e d n a1p l ，g a p d hs ( 1 0 州) 0 2p l ，g a p d h a ( 1 0 州) o 2g l ，t a k a r a t a q ( s u g l ) 0 2h l ，m g c l 2 ( 2 5 r a m ) 0 3p l ， 1 0 x p c rb u f f e r ( m 9 2 + f r e e ) 1 p l ，d n t p ( 1 0 r a m ) 0 2 1 a l ，d h 2 0 6 9 p l 。反应条件为；9 4 c 预 变性4 m i n ，然后9 4 4 0 s e c ，5 9 c4 0 s e c ，7 2 5 0 s e c ，共2 5 个循环，7 2 延伸1 0 m i n 。反应 结束后取l op lp c r 产物经1 琼脂糖凝胶电泳检测。 结果 1 绒山羊$ c p 3 基因的e d n a 序列的克隆 以绒山羊睾丸组织的总r n a 的反转录产物( e d n a ) 为模板进行r t - p c r 扩增，得到8 9 0 b p 的扩增产物，与预期片段大小相同，结果见图1 1 ，测序所得序列见附图l ，2 1 4 倥越绒【i 羊联会复舟件崔自3 基目的克隆、转* 丧达厦多克隆抗体的制 图1 1 西基因的e d n a 序列的 r t - p c r 产物电泳图 m ：d l - 2 0 0 0 d n a m a r k c r l ：s c p 3 r t - p c r 产物片段 f i 9 11r t p c r o u t c o m eo f s c p 3g e n e m ：d l 一2 0 0 0 d n a m a r k e r 1 ：p c rp r o d u c t sf r o ms o p 3c d n a 2 克隆的结果的鉴定 粗提质粒然后进行p c r 鉴定以及e c o r i + s a l i 双酶切，结果如图l2 、l3 。p c r 和酶 围12p c r 鉴定重组克隆栽体 1 、d l - 2 0 0 0 d n a m a r k e r ，2 、s c p 3 腔回收产物 p c r 鉴定不同重组d n a ，7 、阴性对照 f i g l2 l d e n t i 母o f p m d l 9 - t - s c p 3 b yp c r l ：d l - 2 0 0 0d n a m a r k e r 2 ：& p 3a f t e r 酬p u r i f i c a t i o n 图13p m d l 9 一t - g g c p 3 酶切鉴定囤 3 - 6 ，1 、d l - 2 0 0 0 d n a m 础甘， 2 ，e c o r1 酶切p m d l 9 - t - g s c p 3 3 - 南d i f f e r e n t l e e o m b i n a n t d n a i d e n t i f i e d b yp c r 7 ：n e g a t i v ec o n t r o l 3 、e c o r i + s a l i 酶t r l p m d l 9 - t - g s c p 3 f i g1 3r e s h s c t i o n a ea n a l y s i s p m d l 9 - t - g s c p 3 1 ；7 l d n a h i , d l + e c o r i m k 盯 2 ：p m d l 9 - t - s e p 3 e c o r l 32 p m d l 9 - t - s c p 3 e c o r i + s a li 3 绒山羊s c p 3 基因的克隆序列与其他已知物种的序列比对结果 将克隆序列的测序结果提交n c b i 网站，经b l a s t 软件分析，克隆序列与其他物种的序 列比对结果见表1 2 。比对结果表明已公布人、太鼠、小鼠s c p 3 序列具有较高的同源性，与 牛的序列比对同源性更高达9 5 以b ( 如表1 4 所示) 。以上结果表明，8 9 0 b p 左右的扩增产 物为绒山羊的s c p 3 基因，通过与已公布的人、大鼠、小鼠、牛的编码区比对，确定得到的序 列包括了编码区从起始密码子到终止密码子共有7 0 5 个碱基。( 由于本序列申请专利正在复审 中，故具体序列不能在论文中公布) 表1 4 绒山羊与其他已公布物种s c p 3 编码区序列的同源性比较 t a b l e1 4 c o m p a r a b i l i t yo u f ：o m co f g o a t 蛆do t h e rs p e c i e s 物种同源性 ( n m1 5 3 6 9 4 ) 大鼠( n m0 1 1 5 1 7 ) 小鼠( n m0 1 3 0 4 1 ) 牛( b c l 0 2 4 3 3 ) 8 9 8 4 8 3 9 8 4 却，基因在早期不同时期个体睾丸组织中的表达情况 不同时期的睾丸组织取相同