（作物栽培学与耕作学专业论文）甘蔗内生固氮菌的分离与鉴定.pdf

心、 v甘蔗内生固氮菌的分离与鉴定 摘要 甘蔗糖韭是广西的重要经济支柱之一，甘蔗生物固氮及其应用的研究对于在 甘蔗生产中节约氮肥成本、减少环境污染具有非常重要的意义。甘蔗的生物固氮 在巴西开展了较为系统深入的研究，一百多种与甘蔗联合固氮的细菌已经被分离 得到，然而没有系统地归类；不同地区不同品种的甘蔗固氦能力存在较大差异， 所得到的内生固氯菌也不同。 本实验以l 嘶个甘蔗品种为材料，从其中的1 2 个中筛选分离得到二十二个 具有较高的将乙炔还原成乙烯能力的菌株。对这些菌株进行了形态学的观察、碳 源利用的测定、生理生化测定、生长因子测定以及部分菌株1 6 s rr n a 基因序列 的鉴定，结果表明： 1 所有菌株都能在液体和固体培养基中生长，菌落形态多为圆形或椭圆型， 菌落致密，表面光滑有光泽，呈粘稠状，浅黄色或无色，半透明，无气生菌丝， 菌落的直径大小不同，从1 2 m m 至4 6 m m 不等。 2 2 4 个菌株中有1 8 个为格兰氏染色阴性，4 个为阳性。大部分细菌能利用 单糖类和醇类作为碳源，厌氧或兼- 生厌氧；淀粉酶、尿酶、氧化酶、明胶水解、 硝酸还原、柠檬酸盐的利用、产生h 2 s 、产生吲哚等生理生化指标则各有不同。 3 所分离到的菌株都能在较大范围的盐浓度、糖浓度、温度和p h 值下生长， 在含盐量肛1 2 ，含糖量0 3 5 之间，温度1 5 4 0 以及p h 4 1 0 之间均能 正常生长。 4 利用1 6 sr r n a 基因克隆将其中的6 个具有代表性的菌株进行鉴定，相 互之间可非常明显地鉴别开来。将其中的4 个菌株测序表明，c p 7 4 - 2 0 0 5 、广1 2 大属于肠杆菌科，克雷伯氏菌属，肺炎克雷伯氏菌种；b 5 与假单胞菌科，假单 胞菌属，门多萨假单胞菌种非常相似：8 3 2 7 l 则有可能属于一个新的固氮细菌。 关键词：甘蔗生物固氦：内生固氮菌：分离；鉴定 、 1幢-：， _ ， i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fe n d o p h y t i c n i t r o g e n - f i x i n gb a c t e r i af r o ms u g a r c a n e a b s t r a c t s u g a r c a n ea n ds u g a rp r o d l i c ti so n eo ft h ee c o n o m i cm a i n s t a y si n g u a n 鲥r e s e a r c ho nb i o l o g i c a ln i 仃o g e nf i x a t i o n ( b n f ) ms u g a r c a i l e h a si i l c r e a s e ds i g n i f i c a l l t l yb e c a u s eo fi 乜p o t e n t i a li m p o 砌n c et 0t i l e e c o n o m ya 1 1 dt i l ee n v i r o n m e n t b n fi ns u g a r c a n eh a sb e e ns n l d i e d s y s t e m a t i c a l l yi nb r a z i lt od a t e ，m o r et l l a i l ah u n d r e do fe n d o p h y t i c n i 仃o g e n 一矗x i n gb a c 储i ah a sb e e ni s o l a t e d ， b u tn o tb e e nc l a s s i f i e dy e t d i 髓r e n tv 碰e t i e s 舶md i 髓r e ma r e 私h a v cd i 疏r e mc 叩a c i t yo f n i t r o g e n 矗x a t i o n ，s om es 锄eo fe n d o p h y t i cn i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i a i nm i se x p e r i m e n t ，l0 6s u g a r c a n ev a r i e t i e s 行o mg u a n g x is u g a r c a n e r e s e a r c h1 1 1 s t i t u t ew e r es e l e c t e da sn l em a t e r i a l s ，a i l d2 2s t r a i n so f e n d o p h y t i cb a c t 耐aw e r ei s o l a t e d 舶m1 2o ft h e m ，w h i c hs h o w e d h i 曲 c 印a c i t ) ，o fr e d u c i n gc 2 h 2t oc 2 h 4 m o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r s ，u t i l i z a t i o no fs o l ec a r b o ns o u r c e ，g r o w t hf a c t o r sa n dp a r t so f t h el6 sr r n ag e n e s e q u e n c e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e da s f o i l o w s 1 a l lt 1 1 ei s o i a t e sw e r ea b l et og r o wa tb o m l i q u i da n ds o l i dc u l t u r e m e d i a t h ec l o n es h a p ew a sc i r c u l a ro re 1 1 i p t i c a l ，也e i rd i 锄e t e rd i 觑r 、l ， f - r o m1 2 m mt o4 6 m m t h e i rs u r f a c ew a sg l a z e d ，b u tr 叩yi l l s i d e ，a n d m e y w e r eb u 置u n c o l o r e do rt r a i l s l u c e n tw i t hn om y c e l i u m 2 e i g h t e e no f t h ei s o l a t e sw e r eg r a m - n e g a t i v ea n dt 士1 eo t l l e r4w e r e ( 打锄p o s t i v e a uo ft l l e mc o u l dg r o wu n d e ra r i a e r o b i c o ra e r o b i c c o n c m i o n sa n dm o s to f 吐l ei s o l a t e sc o u l du s e9 1 u c i d e ss u c ha sg l u c o s e ， m a n n o s e ，h c t o s e ，m a l l l l i t 0 1 ， i i r l o s i t o la n da r a b i n o s ea ss o l ec a r b o n s o u r c e b ms o m eo ft i l ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r sl i k es t a r c hh y d r o l y s i s ， u r e a l s e ，o x i d a s e ，n 0 3 r e d u 纰e ，g e l a t mh y d r 0 1 y s i s ，h 2 sp r o d u c t i o n ， 瓶d o l ep r o d u c t i o na n du s eo f c h a t ew e r ed i 仃c r e n t 3 a l l l ei s o l a t e sc o u l db ec u l t u r e d0 v e raw i d er a l l g eo f p h ，s u c m s e a 1 1 ds a hc o n c e n 乜a t i o n s t h e yw e r ea b l et 0g r o wu i l d e rm ec o n d i t i o n so f p h 4 p h l 0 ，t e 唧e r a m r e l 5 4 0 ，s a l tc o n c e n t r a t i o i l sb e 附e e n 肛1 2 a 1 1 d s u c l o s ec o n c e n n 嘶o n sb e 帆e e n ( ) 3 5 4 s i xo ft h er e p r e s e n t “v ei s o l a t e sw e r ei d e m i f i e db yl6 s 矗n a g e n ec l o n e s ，i tw a se a s yt oc l a s s i 母o n e 丘0 me a c ho t l l e r s e q u e n c i n g4o f t | 1 e ms h o w e dt h a tm ei s o l a t e sc p 7 4 2 0 0 5a n d 舒崛馏j 2 如w e r es t r a i l l so f 刚9 6 s 括z 肠p 胛8 堋o ”肠p t h ei s 0 1 a t eb 5 w a sv e r ys i m i l a rt op l ，p 甜矗 聊d 麟 ，”e 珂如c 砌口b u tt h e r ew e r es o m ed i f 王爸r e n c e sb e t w e e nt 1 1 e m t h ei s o l a t e 8 3 2 7lm i g h tb ean e ws t r a i no fe n d o p h ”i cn i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i a k 置yw o r d s ： b i o l o g i c a ln i t r d g e n f i x a t i o n ； e n d o p h y t i c n i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i a ；i s o l a t i o n ； i d e n t i f i c a t i o n 、 i i riflji 套 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 1 。1 自然界的生物固氮作用 1 前言 氮气是空气的主要组成成分之一，它约占空气总体积的8 0 。氮又是生物细 胞的重要组成元素之一，也是生物生存必不可少的一种元素。氮素也是植物生长 发育以及影响作物产量的重要营养元素。分子氮的化学性质很稳定，因此大气中 的分子氮不能直接被高等生物和大多数微生物利用，只有将氮分子还原成氨以后 才能被植物和微生物利用。自然界中，有些微生物等能将空气中的氮气( n 2 ) 还 原成氮( n h 3 ) ，为植物或微生物的生长发育提供氮源，这种现象则称为生物固 氮( b i o l o g i c a ln i 仃o g f i x a t i o n ) 。自然界大气中的固氮作用有两条途径：一种是 在高温( 5 0 0 以上) 、高压( 3 0 m p a ) 、无机催化剂和特定设备里将氮转变成氨 的工业途径；一种是在常温、常压下通过固氮微生物或固氮酶将分子氮转变成氨 的生物固氮途径。与合成氨工业相比，生物固氮具有很大的优越性：固氮量大； 有利于生态环境的保护和农业的可持续发展，生物固氮将可能是未来绿色农业的 主要肥源之一；成本低；反应条件温和，可在常温常压下进行；肥效持续时间长 等。据估计，全球每年可供利用的还原态氮中约有6 0 来自生物固氮，工业合成 氨则约占2 5 ，其余1 5 则产生于闪电等【l 】。全球每年由生物固定的氮量约达 1 7 5 1 0 6 t ，约占全球植物需氮量的3 “，其中农业土壤固氮约9 0 1 0 6 t ，约为本世 纪7 0 年代后期每年施用化学氮肥4 0 1 0 6 t 的2 倍多 2 一l 。由生物固氮作用所形成 的氮素化合物，就成为土壤中氮素的主要来源。 可以说，生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥工厂。但是，迄今为止所发 现的绝大多数固氮微生物均不能在粮食作物水稻、小麦、玉米以及多种果树、蔬 菜上应用，即使少数可以的话，其固氮量也很少，所以这些作物的高产不得不依 赖化学氮肥【4 l 。另据f a 0 2 0 0 2 年的统计，目前粮食增产的4 0 是靠施用化肥取 得的，我国已经成为世界上最大的化肥生产国和消费国。2 0 0 2 年全世界化肥总 用量1 4 2 亿吨，我国用量为4 3 3 9 5 万吨，超过世界总用量的1 3 ，居世界之首。 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 尤其在氮肥的使用上，按作物播种面积计算，全国平均氮肥施用量达1 5 8 k g ，i l r n 2 ， 占全球氮素化肥消费量的6 0 ( f a 0 ，1 9 9 5 ) 【钉。而在作物生产中，氮素化肥的利 用率仅为3 3 ，另有6 7 被浪费，相当于每年全球损失1 5 9 亿美元f 6 】。一方面， 适量使用化学氮肥可使粮食高产；另一方面，生产化学氮肥要大量消耗能源，加 重大气污染和温室效应。此外，大量施用化肥，不仅提高农业生产成本，而且导 致水土污染，影响健康和破坏生态平衡1 7 】。 生物固氮作用在氮素循环中起着重要的作用，而随着世界人口的增长和经济 的发展，氮素循环在粮食生产和环境方面有着重要的影响和意义。如何发挥和提 高生物固氮的潜力以满足植物对氮的需求，并减少生产氮肥所带来的能耗和环境 污染，保持人类生存的环境和生态的平衡，将是未来研究的重大课题之一。因此 对生物固氮的研究具有重要的意义。 1 2 联合固氮作用 生物固氮作用是固氮微生物的一种特殊生理功能，根据固氮微生物与高等植 物以及其他生物的关系，可以分为两个类型，即自生固氮微生物和共生固氮微生 物，相应地生物固氮作用就分为自生固氮作用和共生固氮作用。由于大量的研究 结果发现在甘蔗、玉米等禾本科植物的根际存在多种固氮微生物，且这些存在于 根际的固氮菌与植物存在着相对的寄主专一性，因此7 0 年代巴西学者d 6 b e r e i n e r 提出了联合固氮作用( a s s o c i a t i v en i 仃o g c nf i x a t i o n ) 的概念f 羽。在联合固氮体系 中，固氮菌聚居于植物根际、根表，甚至有一部分固氮菌进入根内、根细胞中， 将固定的氮提供给植物，与相应联合的植物具有较密切的关系但在植物根系上不 形成特异化结构，靠根系分泌物生存、繁殖。因此，一般认为联合共生固氮体系 是处于自生固氮体系和共生固氮体系的中间。联合固氮菌主要的共生对象是与人 类密切相关的粮食作物水稻、玉米、小麦等禾本科作物。 联合固氮作用在自然界中广泛存在，各种作物以及热带、亚热带牧草的根际 和根表等均发现联合固氮微生物存在，它们在提供土壤和作物氮素方面起一定的 作用，对非豆科植物的氮素补给具有一定的潜力。联合固氮不足之处一是特异性 差，联合关系不稳定；二是固氮能力不高和固氮量少，固氮作用不仅受铵的反馈 2 l 挚 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 抑制，还受到外界环境因素( 光，氧、温度、湿度等) 的制约，因而自然界中存 在的这一体系对作物的氮素贡献有限。内生固氮菌是指能在活的植物组织内生活 或者一部分生活周期在活的植物组织中而不引起植物病症和伤害的固氮微生物。 它可分为兼性内生固氮菌和专性内生固氮菌，前者在植物根表、根内以及土壤中 都表现出活跃的生存状态，而后者仅能在植物根内和茎叶等部位定殖，在土壤中 则很难存活。内生固氮菌的生物固氮作用不形成特异化结构，几乎可以在宿主植 物的各种营养器官内发挥固氮作用，从而为植物提供氮源。最早发现在一些甘蔗 品种的植株内部定殖的草螺菌和醋酸杆菌等内生固氮菌，并经测定表明其对植物 氮的贡献不可低估。甘蔗和植物内生固氮菌是禾本科植物第一个发现的有效内生 固氮系统，它的发现为禾本科作物生物固氮功能的应用提供了一个新的途径。 1 3 联合固氮菌与植物的相互作用 联合固氮菌大多寄生在植物体内或植物内根际，固氮菌将空气中的氮气固定 下来，部分用于自身的生长代谢，部分为宿主植物提供n 源，而宿主植物则为 固氮菌提供养分、能量等。总体来说，固氮细菌与植物之间是互相促进的作用， 但是固氮细菌与植物之间的关系也受到外界环境的影响。 1 3 1 联合固氮菌对植物的促进作用 ( 1 ) 为植物提供氮源：联合固氮细菌在内根际或者在植物体内的固氮对植 物含量有直接贡献。有些联合固氮菌将固定的氮素直接提供给植物吸收同化，有 些则将固定大气中的氮气部分提供给宿主吸收利用【9 l ，其余部分则被细菌转化为 细胞氮，由于细菌的生命周期比植物短得多，内根际细菌死亡崩解后释放的有机 氮也能逐步为植物根系吸收。 ( 2 ) 产生植物激素类物质：大量的研究表明，接种联合固氮菌在不同的环 境和土壤条件下对植物的生长，尤其是在幼苗期有明显的促进作用。主要原因在 于细菌产生的植物激素影响了宿主根的呼吸速率和代谢，并刺激侧根生长，根毛 数目增多，根系发达。联合固氮菌能提高根际和根内的激素水平，如h l l s s a i l l 、 f a i l i k 等发现接种固氮菌、固氮螺菌于玉米后产生i a a 、a b a 等植物内源激素 广西大擘硕士学位论文甘蔗内生田氮茵的分离与鉴定 的代谢的增强1 1 0 l 。 ( 3 ) 根系吸收利用无机离子能力增强。固氮菌能促使根系新陈代谢加强， 从而促进根系吸收能力增强【1 1 - 12 1 。 ( 4 ) 促进体内的生理变化。促进植物多元酚的分泌，而多元酚的功能与 植物色素形成、细胞壁构建、紫外线伤害的保护和真菌侵染的防御有关1 3 】。 促进植物体内a t p 含量增加。这可能是接种刺激质膜a r p 勰e 活性的结果，a t p 含量提高能增强幼菌植株的生活力【1 0 1 。促使植物氧化酶活性降低而还原酶活 性提高。o k o n 和k a d u l n i k 报告接种固氮螺菌使根系租提物中i a a 氧化酶、多 酚氧化酶、虫漆酶等活性低于对照，而这些氧化酶活性降低可能是造成内源傲素 和多元酚水平提高的原因。 ( 5 ) 固氮菌可有效地抑制不同病菌引起的植物病害。这是由于内生固氮菌 定殖在植物体内占据了植物上的生态位点，由于生存空间的限制，就阻止了病原 菌的入侵和定殖，这些细菌还可以与病原菌形成营养竞争的对抗关系，使病原菌 得不到营养而死亡【1 4 1 。杨海莲研究发现阴沟肠杆菌对水稻稻瘟病、纹枯病、白 叶枯病都有一定的抑制作用。b r a u n 等也发现成团肠杆菌对丁香假单胞菌引起的 小麦粒瘟病的防治效果达4 5 v 7 4 。 1 3 2 植物对联合固氮菌的影响 根际土壤是受根系直接影响的土壤范围，由于植物根系向土壤微生物提供很 多有机质，以保证微生物完成其生活史。因此根内及根际土壤的微生物数量远远 高于远根土壤。微生物的活度是由代谢物总量和其可利用的碳决定的。不同植物 种类及其生育期及环境条件( 温度、光照、土质、湿度等) 不同，植物根系分泌 物的成分、含量等都有很大不同。植物分泌物的组成往往依赖于他们的代谢类型。 c ，植物小麦和水稻根分泌物中草酸含量比较多，而c 一植物玉米根分泌物中含有 大量l 苹果酸，这些变化在很大程度上影响着根际固氮菌的种类及聚集程度。 1 3 3 影响联合固氮的环境因素 联合固氮菌与植物构成的联合固氮体系由于没有在植物体形成特殊组织结 4 广西大学硕士学位论文甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 构保障，因此联合固氮体系的固氮效率受到多种因素的制约1 6 】，总的来说有 以下几方面： 1331 植物的营养生长 对玉米的研究表明，玉米根际联合固氮菌固氮活性随玉米营养生长旺盛期根 部分泌物增多而提高，在7 5 吐丝期最高1 7 l 。王子芳等对水稻根际固氮细菌的 生态与分布进行了研究，认为水稻根系固氮活性、固氮菌株比例与水稻生育期关 系密切，一般是光合作用活跃的抽穗期最高，光合作用较弱的成熟期最低f 1 8 】。 1 3 3 2 光强 b a l 锄d r e a u 等人的研究表明，无论是实验室还是田间实验都表明植物吸收光 能与固氮酶活性间呈线性关系陋舯。 1 3 3 3 温湿度 温度和湿度分别对联合固氮活性有不同的影响。气温的影响主要反映在植物 的光合作用进程和同化产物的运输速度上，当气温低于1 9 时，固氮活性不高， 气温高，光合作用强，增强光合产物的根部运输，反之，会降低光合产物的根部 运输率。各种固氮菌都有他们适宜的生长温度，如固氮螺菌，生长最适温度在 3 2 q o 之间，低于1 8 生长受阻，适应接种在喜温作物如水稻、玉米、甘蔗上 【1 9 】。中温性细菌的联合固氮效率在温带地区的冬季作物较低，而在开春后随着 土壤温度升高，作物迅速生长而提高。空气湿度主要影响叶片气孔和物质向上运 输，从而影响将根际所固定的氮运向植株地上部分。土壤水分也有很大影响，干 旱缺水对根际联合固氮不利【1 9 1 。 1 3 3 4 无机氦浓度 无机氮化物在植物体内对固氮酶活性有抑制作用f 2 0 1 。但是在土壤植物系统 中，根际的无机氮含量由于根的吸收而远较根外土壤中的为低。b a l a n d r e a n 等曾 在水稻根部施用铵肥，虽然短期内抑制水稻根际的固氮活性，但当铵被水稻吸收 后，促进了水稻生长和光合作用，从而提高了根际的联合固氮活性【2 l 】。罗孝扬 等已诱变出可耐7 5 i r l m n h 4 + 高浓度铵的固氮螺菌突变株圈。 1 3 3 5 土壤的酸碱度 土壤的酸碱度也影响固氮酶活性，酸性土壤和盐碱土壤都有各自适应的植物 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 和固氮细菌l 。 1 4 甘蔗的联合固氮作用 1 4 1 甘蔗的固氮能力 虽然从固氮微生物的发现到现在已有1 0 0 多年的历史，蔗地间套种豆科作物， 利用根瘤菌的共生固氮作用来提高地力也早有应用，但甘蔗的联合固氮作用却是 在1 9 6 1 年d 曲e r e i i l e r 在巴西发现俯抑马唐根际有固氮效率高的生脂固氮螺菌协1 后 才被人们所认识。从7 0 年代开始，巴西、印度、南非、澳洲和我国等蔗糖生产国 家对甘蔗联合共生固氮进行了大量的试验和研究。在巴西，有些地方连续种蔗5 0 年以上，有的甚至超过l o o 年，在低氮投入( 新植蔗6 0 k g n 1 1 1 n 2 、宿根1 2 0 k g n hm 2 以下) 及每造收获时几乎全部植株氮素被带走( 每造甘蔗1 0 0 - 2 0 0 k g n mn 1 2 ) 的 情况下土壤的氮储量并不下降【2 5 刮。这种事实以及与甘蔗联合的固氮细菌的大 量存在的情况说明，甘蔗可能从生物固氮中获得相当多的氮素。 在巴西、印度、泰国等国家，甘蔗联合固氮的研究主要是利用1 5 n 平衡法、 1 5 n 同位素稀释法、1 5 n 自然丰度法和生理生化实验技术等方法进行f 3 3 1 ，经过试 验都证明了甘蔗具有高效的固氮能力，可以从生物固氮中获得3 0 一7 0 以上的氮 量。巴西培育出一批固氮品种如r b 7 2 4 5 4 、r b 8 3 - 5 4 8 8 、r b 8 3 - 5 0 8 9 、s p 8 0 1 8 4 2 、 c b 4 7 8 9 等在巴西的田间试验条件下显示了明显的固氮效果。0 l i 、，e i r a 等人【3 4 1 对同 一块甘蔗地土壤进行长达9 年( 1 9 8 4 年1 9 9 3 年) 的连续研究后发现，包括甘蔗 在内平均每年每平方米的土壤( 0 2 0 c m 深土层内) 能够从空气中获得3 1 5 9 的n 素。另一个经典的实验是1 9 8 7 年巴西的l i m a 等人( 3 5 】用含有6 4 昭土壤的盆栽甘蔗 试验，土壤内含o 8 9 k g 。1 的n 素，总共约含有5 2 9n 素。实验表明，当地品种c b 4 7 - 8 9 在2 年内收获甘蔗分别带走了合约1 6 5 9 和1 3 8 9 的n 索，而土壤中2 年总共只减少 了6 8 9 的n 素。广西从巴西引进r b 7 2 4 s 4 等品种，经过肥料试验研究表明只旌少 量的氮肥并不影响甘蔗的出苗率、分蘖率、蔗茎产量和蔗糖分1 3 6 1 ，间接证明巴 西固氮甘蔗品种在广西本地也有固氮活性。梁俊利用巴西固氮甘蔗品种与本地品 种，进行桶栽无氮肥试验，结果表明巴西固氮甘蔗品种在本地具有较高的固氮能 6 广西大学硕士学位论文甘蔗内生固氮菌的分离与鉴定 力，固氮酶活性远高于本地品种【3 7 1 。 然而甘蔗的生物固氮能力受到品种的遗传基础和生长环境的影响，不同的甘 蔗品种间的生物固氮能力存在较大差异，巴西的r b 7 2 4 5 4 、r b 8 3 5 4 8 8 、 r b 8 3 5 0 8 9 、s p 8 0 1 8 4 2 、c b 4 7 墙9 等相比其它品种具有较强的固氮能力，而我国 的甘蔗品种由于长年施放较多的氮肥，固氮能力普遍不高。 1 4 2 甘蔗固氯菌的分离和鉴定 自从d 6 b e r e i l l e r 从甘蔗根际分离得到固氮菌后，数十种甘蔗联合固氮菌被陆 续地发现。现在己分离到多种固氮菌，与甘蔗联合共生固氮有关的微生物主要有： 固氮菌( 4 ，d 6 衙) 如圆褐固氮菌( 一幽加d c d c c “珊) 和棕色固氮菌( a v 加p 肠甜) 等、拜氏菌( 扣肪躲t 妇) ，固氮螺菌( 彳舻缈f ，f 胁删) 、德克斯氏菌( 眈肛缸) 、 芽孢梭菌( c 蛔r 砌“m ) 、克氏杆菌( 胁撕耙肋) 、肠杆菌( 西如，d 6 卯妙) 、多粘 芽孢杆菌( 肋c 池印d 加砂煳) 【2 7 3 9 1 、固氮醋酸杆菌( 爿c p 6 d 6 口嘲，砒黝r ，印 f c 嬲) 驺鹤、草燥蔼( h e r b 口s p 矾l l u ms p p 1 弧h m b n b n l b | c d 凇鹣h s e m p e d i c 。“啦! 。 上述的固氮微生物主要分布在根际和根部组织，在皮层组织和中柱组织以及微管 束中都有，其菌体数量每克鲜重组织可达1 0 5 1 0 8 ：在茎叶中相对要少，仅为根部 的l 1 0 ，在茎中主要分布在薄壁组织的胞间隙，有时也出现在维管束内f 4 3 郴】。 这些微生物的种类、数量随甘蔗品种、植株株龄、地域以及研究手段不同而有所 差异，主要是由好气的和厌气的及兼性厌氧的微生物组成；好气性的固氮生物数 量比厌气的多，但后者的固氮活性比前者强【4 6 】。整个甘蔗固氮菌系统中既有根 际及土壤固氮菌、体表固氮菌，也有内生固氮菌，但不同的固氮菌各自的作用还 未清楚。现在研究比较多的是内生固氮菌固氮醋酸杆菌( 4 c 曲0 6 a c f e r 西北。帅p 厅f c 淞) 和草螺菌( 胁r 6 唧护池m 印p ) ，认为它们可能是甘蔗生物固氮 系统中最重要的贡献者【4 9 1 。固氮醋酸杆菌微好氧，主要以蔗糖为生长碳源，最 佳生长条件为3 0 ，p h 5 5 ，1 0 蔗糖；该菌无硝酸还原酶，高水平n 0 3 一对固氮 作用无影响，n h 4 + 仅部分抑制圃氮酶活性。固氮醋酸杆菌分布较广，在巴西、 印度、澳大利亚、墨西哥、古巴、阿根廷、乌拉圭等热带蔗区，都可以从根部、 蔗茎和叶片中分离到此菌。该菌可以通过甘蔗种茎切段传播，地区间可通过引种 传播，不同甘蔗品种问的扩散可能是通过和甘蔗相关的介壳虫和v a 真菌孢子或 7 广西大学硕士学位论文甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 机戒损伤来完成。草螺菌生存在植物组织的内部；微好氧，固氮酶活性能够耐受 较高氧分压，不分解硝酸盐并且n 地+ 仅部分抑制固氮酶活性；其传播可能是通 过v a 菌根菌或种子传播。巴西的甘蔗固氮研究专家在当地甘蔗品种中主要是分 离出固氮醋酸杆菌和草螺菌。最近，古巴、德国、加拿大的三个实验室合作，分 别从古巴当地的一个品种的叶片和茎杆内分离得到两个固氮菌菌株t 2 和9 c ，经 过鉴定，t 2 可归类于葡萄杆菌属( g ? “c d n 口c p 向6 叩把r ) ，而9 c 的1 6 sr r n a 基因 分析结果与产气细菌( 阳肋8 口) 、克雷伯氏菌属( 日e 6 s f p 如) 、肠杆菌( 砌胞，0 6 口c 甜) 相似，但是生理生化鉴定的结果又不尽相同，最终认定为是一种新的固氮细菌 【4 7 | 。 1 5 存在的问题与展望 ( 1 ) 甘蔗内生联合固氮菌种类繁多，目前报道的存在于甘蔗体内的有固氮 能力的细菌达一百多种，但是没有系统的归类。不同地方的甘蔗品种中含有的内 生固氮菌种类不同，即使在同一地区的甘蔗品种中含有的内生固氮菌种类也不尽 相同，显然，系统地探讨各地各品种中内生固氮菌的数量与种类，有利于了解甘 蔗的固氮能力，以对该品种作出更全面的评价。 ( 2 ) 每一种甘蔗体内分别有哪几种固氮菌，真正与甘蔗联合起作用的又是 哪几个? 这些问题依然没有研究清楚。甘蔗内生固氮菌与宿主之间的生理生化关 系尚未明了【4 8 】；固氮细菌在甘蔗体内的固氮活力并不稳定，同种细菌在相同宿 主中，在不同的生长时期表现的固氮活力不同，而在相同时期的不同部位活力也 不同。因此，将固氮细菌分离出来，进行离体观察研究，有助于理解甘蔗内生固 氮菌与宿主之间的理化关系，明确固氮细菌的固氮酶活性表达规律。 ( 3 ) 在了解甘蔗固氮菌各种特性的情况下，将活力高的固氮菌回接到甘蔗 体内，或把固氮菌制作成固氮肥，增强甘蔗的固氮能力，减少氮肥的使用量，节 约生产成本，将是未来很有意义的研究课题。 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 1 。6 本研究的内容及意义 ( 1 ) 研究内容：尽可能广泛地收集不同地域和不同基因型来源的甘蔗品种 或无性系，从它们体内分离筛选出具有固氮能力的细菌，进行离题培养，研究它 们的生长特点及各种生理生化特性并将它们系统地分类、鉴定。 ( 2 ) 研究意义：了解不同地域和不同基因型来源的甘蔗品种体内固氮菌的 种类和数量，以及所含固氮菌的生长特点和生理生化特性，从而可以更深入地了 解这些甘蔗品种的固氮潜力。此外，在了解不同来源固氮菌的特性之后，将为今 后研究甘蔗内生固氮菌与宿主之间的理化关系，明确固氮细菌的在甘蔗体内固氮 酶活性表达规律，从而摸索出不同甘蔗品种的固氮特性或固氮规律。本研究还为 今后将高活力的固氮菌回接到甘蔗体内，或把固氮菌制作成固氮肥以增强甘蔗的 固氮能力等研究提供重要的参考。 9 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 2 1 实验材料 2 1 1 供试甘蔗材料 2 材料与方法 广西甘蔗研究所资源圃内的1 0 6 个甘蔗品种或无性系，名称为7 3 ( 9 4 9 0 ) 、 5 l ( 9 4 3 7 ) 、7 2 ( 9 4 3 5 ) 、3 1 ( 9 4 3 1 ) 、2 2 ( 9 3 ，2 6 ) 、崖城8 9 _ 4 、5 2 ( 9 4 3 8 ) 、桂 糖8 3 4 9 2 、桂糖6 如7 3 、f 1 3 4 、菲6 3 1 7 、桂糖6 9 1 5 6 、桂糖9 0 9 5 、崖城8 5 - 8 8 l 、 粤糖5 7 _ 4 2 3 、c p 4 9 5 0 、c p 8 1 1 2 5 4 、粤糖6 3 2 3 7 、大野、n c 0 3 l o 、崖城8 2 9 6 、 c p 5 7 6 1 4 、b 8 、b 3 、r b 7 2 - 4 5 4 ，r o c 2 2 、川3 、8 0 - 2 0 、7 0 6 1 1 、c 0 4 1 9 ，8 0 1 6 1 ， c 0 1 1 4 8 、桂糖1 0 号、崖城5 8 - 4 7 、6 2 _ 4 0 、粤糖8 5 1 7 2 2 、c 0 2 8 1 、桂糖7 3 1 6 7 、 桂糖8 9 5 、p t 4 3 5 2 、c p 7 4 2 0 0 5 、崖城8 9 - 8 、湛蔗7 4 1 4 1 、崖城8 9 9 、崖城9 0 一5 6 、 桂林竹蔗、菲6 2 2 1 、c 0 6 1 7 、崖城9 0 - 4 5 、p i n d a f 、c p 7 2 1 2 1 0 、c p 2 8 1 1 、崖城 7 1 3 7 4 、r o c 2 0 、c 0 2 9 0 、春尼、f 1 0 8 、粤糖8 6 3 6 8 、r o c l 6 、b 4 、b a d i l a 、桂 1 1 变、s p 7 0 1 1 4 3 、崖城5 8 4 3 、桂糖4 号、p h i l i 6 6 。0 7 、桂糖1 2 号、卑糖6 3 2 3 7 、 8 0 3 2 、8 0 一4 9 、n c 0 3 7 6 、粤糖8 3 2 7 1 、c 0 4 2 1 、粤糖8 1 3 2 5 4 、q 7 5 、p o j 2 8 7 8 、 洛古蔗，p 0 j 2 7 2 5 、崖城7 3 5 1 2 、桂糖9 3 。1 0 2 、潭州竹蔗、崖城8 7 4 2 、r 0 c 1 、 华南5 6 1 2 、n c 0 3 7 6 、桂糖8 4 3 3 2 、桂糖8 6 2 6 7 、c 0 7 4 0 、r o c l 0 、2 4 ( 9 4 3 2 ) 、 芦蔗、3 3 ( 9 3 2 1 ) 、桂糖6 0 1 4 9 、崖城8 4 1 2 5 、b 5 、b 9 、云蔗8 0 1 8 9 、巴西4 5 、 绦纹1 3 4 、崖城8 2 1 0 8 、n a 5 6 。7 9 、桂糖l 号、云蔗8 9 3 5 l 、q 1 2 4 、云蔗8 0 3 2 、 7 5 2 1 1 。 另以巴西报道的常用标准固氮草螺菌( 胁，6 卿f ，i 池r “6 ，括“6 口6 f ，l c 册s ) 为对 照菌株( c k ) ，本文缩写为h r 。 1 0 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 2 1 2 主要试验试剂 e x 阳d n a 聚合酶、d n t p 购自大连宝生物( 1 酞a r a ) ： c t a b 、蛋白酶k 、 t r i s 、e d l a 等购自s a n g o n ；限制性内切酶来自f e n l l e n t a s ；引物由s a l l g o n 合成： 小量回收试剂盒购自上海华舜生物科技公司，质粒p u c l 9 、大肠杆菌j m l 0 9 由 广西甘蔗研究所保存；测序由上海鼎安科技公司完成。 2 2 实验方法 2 2 1 甘蔗内生固氮菌的分离 桶栽上述品种，不施氮肥，在宿根伸长期取其叶片和蔗茎，清水洗干净，在 超净工作台上先以7 0 酒精表面消毒，再用0 1 升汞消毒5 m i l l ，灭菌水冲洗3 次以后，在灭菌过的研钵中磨碎，转入6 0 l i l l 磨口的白小口瓶中，加入液体l g i - p 或者j n f b 培养基，封口，3 0 ，每m i l l l l o 转摇床培养，3 d 后提取上清液转入 新的培养基继续培养，共转接培养三次后，分别在l g i - p 或者小f b 固体培养基 平板上划线培养，再挑选单菌落继续培养，测定其固氮酶活性，选取固氮酶活性 高的菌株继续繁殖，从而得到纯化的且固氮酶活性高的固氮菌。 2 2 2 分离培养基 分别使用2 种培养基l g i p 和j n f b ( 主要成分见附录2 ) 2 2 3 固氯菌生理生化指标的测定【5 1 。5 5 】 2 1 2 3 1 固氮酶活性的测定 固氮酶活性的检测采用乙炔还原法。将待测菌株接种于灭菌过的6 0 1 1 1 l 磨口 白小口瓶中( 内含1 0 i i l i 液体培养基) ，摇床( 1 1 0 转分，3 0 ) 培养7 l o d 后 从瓶内抽出0 6 l i l l 气体，然后再注入0 6 l i l l 乙炔气体，继续培养2 4 l l 用气相色 谱仪( 安捷伦6 8 9 0 m ) 检测乙炔还原活性，以肛m o l c 2 h 2 m c e l l s 表示固氮酶活性 广西大学硕士学位论文甘蔗内生固氮茵的分离与签定 大小。 2 2 3 2 格兰氏染色试验 ( 一) 染色 ( 1 ) 用接种针挑取少量菌液，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，于酒精 灯火焰上固定。 ( 2 ) 用结晶紫混合液染色l m i n 后，水洗。 ( 3 ) 加碘液染l m m ，水洗，吸干。 ( 4 ) 用洗脱液轻轻冲洗玻片，至洗脱液无紫色产生( 约3 0 s ) 。 ( 5 ) 用复染液染2 3 m i i l ，水洗，凉干。 ( 二) 镜检观察 在显微镜下，先用低倍镜锁定位置，再在油镜下观察，并照相。深紫色为格 兰氏染色阳性细菌，淡红色为格兰氏染色阴性细菌。 。 2 2 3 3 氧化酶测定 在于净的培养皿里放一张小滤纸，用接种环挑取一环菌液涂抹在滤纸上，再 滴上l 的二甲基对苯撑二胺水溶液，仅使滤纸湿润即可，不宣过湿。1 0 s 内观 察颜色变化，若显示紫红色为氧化酶阳性，6 0 s 以上出现红色者不计，按阴性处 理。 2 2 3 4 好氧，厌氧性试验 用接种环挑单菌落到含有硫乙醇酸钠的培养基内静置培养，3 5 d 后观察结 果，好氧菌在培养基的上部生长，厌氧菌则在培养基的下部生长。 2 2 3 5 含碳化合物的利用试验 在空白基础培养基中分别加入葡萄糖、乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、肌醇、 阿拉伯糖、阿拉伯醇、棉子糖、山梨醇等作为碳源。分装到试管后，用接种环挑 单菌落到培养基内静詈培养，每一测定菌都必须接种未加碳水化合物的空白基础 培养基作对照。适温培养2 5 d 后观察，凡测试菌株在有碳水化合物的培养基中 的生长情况明显超过空白基础培养基的生长情况者为阳性，否则为阴性。如果两 种培养基上生长差别不明显，可在同一培养基上连续转按培养三次，如差别仍不 明显，则为阴性。 2 广西大学硕士学位论文 甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 2 _ 2 3 6 淀粉水解试验 在l g i p 或者j n f b 培养基中加入o 2 的可溶性淀粉，1 2 1 ，1 5 m i n 高压 灭菌后倒成平板，将待测菌株在平板上面划线培养。形成菌落后，在平板上面滴 加碘化钾一碘液，以铺满菌落周围为度，平扳呈蓝色，而菌落周围如有不变色的 透明圈出现，说明淀粉已经被水解，计为试验阳性，若全部为紫色，则为阴性。 2 2 3 | 7 明胶水解试验 在l g i p 或者腑b 液体培养基中加入1 的明胶，分装到试管后1 2 1 、 1 5 m m 高压灭菌。将待测菌株穿刺接种于明胶高层约2 3 深度处，接种量应较多， 适温培养7 1 4 d ，另用未接种的培养基同时培养作对照。观察结果时，应先置 冷水浴( 低于2 0 ) 中，待未接种的空白明胶凝固后，再观察接种细菌的培养 基是否已经被细菌液化，如确被液化或者部分液化，即为试验阳性，若仍为凝固 状态，则为阴性。 2 2 3 8 产生吲哚试验 将待测菌接种于含色氨酸的培养基中适温摇床培养三至五天后，取对二甲基 氨基苯甲醛液数滴，沿试管壁缓缓加入，均匀摇动试管，在液层界面形成红色者 为阳性反应。若仍为黄色，则为阴性反应。 2 2 3 9 产生h 2 s 试验 固体培养基中加入硫酸亚铁，用接种针挑取待测菌穿刺接种至培养基2 3 深 度。静置适温培养3 5 d 。沿穿刺线产生黑色者为阳性反应，不显示黑色则为阴 性反应。 2 2 3 1 0 尿酶测定试验 在培养基中加入尿素和酚红，用接种环挑单菌落接种到培养基，摇床上适温 培养1 2 2 4 h ，培养基变成红色者为阳性，不变色则为阴性。 2 2 3 1 1 硝酸还原酶测定 某些细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨和氮等。如果培养基中 的硝酸盐被还原为亚硝酸盐，当培养液中加入格里斯氏试剂时，则溶液呈粉红色 或棕色。 广西大学硕士学位论文甘蔗内生固氮茵的分离与鉴定 2 2 4 影响固氮菌生长的环境因子效应试验 2 2 4 1 耐盐性试验 在液体l g i p 或者州f b 培养基中分别加入o 、3 、6 、9 、1 2 、1 5 的n a c l ，高压灭菌后，将待测菌接种到培养基中，适温振荡培养5 7 d 后， 取菌液分别稀释1 0 4 倍和1 0 6 倍，均匀涂布于固体培养基上培养，3 5 d 后数平 板上的菌落数，菌落数乘以稀释倍数即可以估计出菌液中的细菌浓度。重复三次， 取平均值。 2 2 4 2 最适糖浓度 在液体l g i - p 或者j n f b 培养基中分别加入o ，5 、l o 、1 5 、2 0 、 2 5 、3 0 、3 5 的蔗糖，高压灭菌后，将待测菌接种到培养基中培养。检测方 法同2 2 4 1 。 v 2 2 4 3 最适p h 值 将液体l ，g i p 或者j n f b 培养基的p h 值分别用n a o h 或h c l 调整为3 、4 、 5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、1 l ，高压灭菌后，将待测菌接种到培养基中培养。检测方 法同2 2 4 1 。 22 4 4 最适生长温度 将细菌放在摇床上培养，温度分别调整为1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、 3 5 、4 0 、4 5