（应用化学专业论文）AzaBODIPY荧光染料的合成及紫外和荧光光谱研究.pdf

浙江工业大学硕士学位论文 a z a b o d 口y 荧光染料的合成 及紫外和荧光光谱研究 摘要 a z a b o d 口y 荧光染料是近十年发展起来并受到广泛关注的一 类新型荧光化合物。它们具有极好的光物理性质，例如：较长的最大 吸收和发射波长、较高的荧光量子产率、较高的摩尔消光系数、较窄 的荧光光谱半峰宽、较高的光稳定性等等。 本文合成了八个新的a z a b o d p y 荧光染料1 a - h ，用取、 1 h n m r 、1 3 c n m r 和m s 等方法对其进行表征，并对其反应条件进 行优化。 染料1 a - b 是对称结构，经四步反应得到。以苯乙酮和苯甲醛衍 生物为最初原料，经羟醛缩合制得查尔酮，收率9 4 ，再经硝基甲烷 的m i c 蹦加成得到1 苯基3 芳基4 硝基丁酮，收率7 4 ，再与醋 酸铵反应得到对称的氮杂四芳基二吡咯甲川类化合物，收率4 1 ，最 后与三氟化硼络合得到染料1 a - b ，收率9 0 ，总收率2 5 7 。 染料1 c - h 是不对称结构，经六步反应得到。由中间体1 苯基3 芳基4 硝基丁酮经n e f 反应后，再与醋酸铵反应制得2 苯基4 芳基 吡咯，收率3 0 ，再经亚硝化得到2 亚硝基3 芳基5 苯基毗咯，收 率9 7 ，再与中间体2 苯基4 芳基吡咯反应制得不对称的氮杂四芳 n 浙江工业大学硕士学位论文 基二吡咯甲川类化合物，收率7 5 ，最后与三氟化硼络合得到染料 1 c - h ，收率9 0 ，总收率1 3 7 。 对荧光染料1 a - h 进行了紫外吸收光谱和荧光发射光谱的测定，探 讨了不同取代基对吸收光谱和荧光光谱的影响，考察了在不同溶剂 ( 氯仿、乙醇、甲苯) 中的溶剂效应。 关键词：a z a b o d p y 、荧光染料、紫外吸收光谱、荧光发射光谱、 合成 浙江工业大学硕士学位论文 s y n t h e s i so fa z a - b o d 口y f l u o r e s c e n td y e sa n d s p e c t rai ，r e s e a r c ho fu va n df l u o r e s c e n c e a bs t r a c t a z a b o d d yn u o r e s c e n t d y e s ，w h i c h a r ean e wn u o r e s c e n t c o m p o u n d s ，h a v ee m e 玛e da sav e 巧a c t i v er e s e 龃c hf i e l di nr e c e n ty e a r s t h e yh a v ee x c e l l e n tp h o t o p h y s i c a lp r o p e n i e s ，s u c ha sl o n gm a x i n m m d b s o 印t i o na n de 血s s i o nw a v e l e n g 也s ，h i g hq u 觚曲my i e l d s ，址g hm 0 1 a r e x t i n c t i o nc o e 伍c i e n t s ，s h a 印n u o r e s c e n c ee m i s s i o nc h a r a c t 舐s t i c s ，h i 曲 p h o t o s t a b i l i 吼e t c i n 也i st 1 1 e s i s ，e i g h tn e wa z a - b o d i p yn u o r e s c e md y e s1a hw e r e s y n t h e s i z e d ，a n dc h 觚l c t e 比e db yi r 1h 卜m r1 3 c 卜m 瓜a n dm s ，r h e r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i n l i z e d t h es y m m e t r i c a l l ys 伽】c t u r a l d y e s1 a _ bw a ss y n t h e s i z e di nf o u r s t 印s c o n d e n s a t i o no fa c e t o p h e n o n ew i 也b e n z a l d e h y d ed e r i v a t i v e s a 筋r d e dc h a l c o n e si 1 19 4 姐e l d ，a n dm i c h a e la d d i t i o no f1 1 i 仃o m e t h a n e g a v et h el p h e n 姐- 3 一a 川一4 - 1 1 i t r o - b u t a n o n ei n7 4 姐e l d ，t h e nc o n d e n s a t i o nw i t h 砌0 1 1 i u ma c e t a t ea 氐o r d e dt 1 1 ea z a d i p y 玎o m e t h e n ei n4 1 y i e l d ， f i n a l l yc o n l p l e x 撕o nw i 也b o r o nt r i n u o r i d eg a v ed y e s1 a - bi n9 0 ) ，i e l d t h et o t a l 如e l do f d y e s1 a bw a s2 5 7 t h ea s y m m e t r i c a l l ys t r u c t u r a l d y e s1c hw a ss y n t h e s i z e di i ls 诙 s t 印s t h e i 1 1 t e n n e d i a t e 1 - p h e n y l - 3 - a r y l 4 一1 1 i 仃o - b u t a n o n eb yt h en e f 浙江工业大学硕士学位论文 r e a c t i o na n dc o n d e n s a t i o n 谢t h 掘l m o n i aa 丘o r d e d 也e 2 - p h e n y l 4 a r y l p y r r 0 1 e si 1 13 0 y i e l d a n dc o n d e n s a t i o nw i t l ls o d i u mn i t r i t eg a v e 也e 2 一1 1 i 订o s o 一3 - a 聊一5 p h e n y l p y t r 0 1 e si n9 7 如e l d ，t h e nc o n d e n s a t i o nw i 也 t h ei i l t e r m e d i a t e2 - p h e n y l - 4 一a r y lp y l l r o l e sa f f o r d e d 也ea z a d i p y r r o m e t h e n e i 1 17 5 y i e l d ，缸a l l yc o m p l e x a t i o nw i 也b o r o n t r i n u o r i d eg a v ed y e s1 c - h i n9 0 y i e l d t h et o t a ly i e l do f d y e s1 c hw a s1 3 7 n ea b s o r b a n c es p e c 饥1 ma n dm o r e s c e n c es p e c 咖o f d y e s1 a _ h w e r ed e t e c t e d t h er e l a t i o nb e t w e e n p h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e sa n d s t m 船o fn u o r e s c e n td y e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h es 0 1 v e n te 能c t so f n u o r e s c e n td y e sw e r es t u d i e di 1 1m 鼠：r e n ts 0 1 v e n t s ( c b l o r o f o r n l ，e t h a n o l ， t o l u e n e ) i 汪w o r d s ：a z a - b o d 口yf l u o r e s c e n td y e s ，u va b s o r b a n c e s p e c t n l 驰n u o r e s c e n c ee n l i s s i o ns p e c 臼m m ，s y n t h e s i s v 浙江工业大学硕士学位论文 简写说明( a b b r e v i a t i o n s ) 浙江工业大学硕士学位论文 目录 第1 章文献综述1 1 1 引言 1 2荧光产生的理论基础 1 3描述荧光特性的参数 1 4分子结构与荧光的关系 1 5生物近红外荧光技术 1 6荧光标识染料的种类及主要特点 1 7a z a - b o d p y 荧光染料的研究进展 1 8a z a - b o d 口y 荧光染料的设计理由 第2 章a z a - b o d 口y 荧光染料的合成1 8 2 1 引言 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 2 2 2 2 2 3 对称的丸：a b o d p y 荧光染料1 a - b 的合成路线 不对称的a z a b o d p y 荧光染料1 c - h 的合成路线 2 2 4 中间体查尔酮的合成 2 2 5中间体1 苯基3 芳基4 硝基丁酮的合成 2 2 6 中间体对称的氮杂四芳基二吡咯甲川类化合物的合成2 2 2 2 7 对称的a 涩b o d 口y 荧光染料1 a - b 的合成 2 2 8中间体2 苯基4 芳基吡咯的合成 2 2 9 中间体2 亚硝基3 芳基5 苯基吡咯的合成 2 3 2 4 2 5 2 2 1 0 中间体不对称的氮杂四芳基二吡咯甲川类化合物的合成2 6 2 2 1 1 不对称的a 2 a _ b o d p y 荧光染料1 c h 的合成 2 3 结果和讨论 2 3 1a z a b o d p y 荧光染料合成的可能反应机理 2 3 2a z a - b o d p y 荧光染料合成的反应条件优化 2 - 3 3 部分化合物的结构表征。 v 2 7 2 8 2 8 2 9 3 6 l 2 3 4 6 8 1 6 j o o 石 墨 n m 坞 侈 侈 抄 加 加 n 浙江工业大学硕士学位论文 2 4 本章小结 第3 章a z a b o d d y 荧光染料的紫外和荧光光谱研究4 5 3 2 实验部分。 3 2 1 仪器与试剂 3 2 2 a z a b o d p y 荧光染料紫外和荧光光谱的测定 3 3 结果和讨论 3 3 1 a z a - b o d p y 荧光染料的光谱性质 3 3 2 丸静b o d p y 荧光染料的溶剂效应 3 4 本章小结 第4 章 总结和展望5 3 4 1 总结 4 2 展望 参考文献 附图 1 部分物质1 如心偶图谱 2 部分物质1 3 c n m r 图谱 3 部分物质m s 图谱 3 部分物质取图谱 硕士期间已发表的论文 致谢 钙 钙 钙 钙 钙 钙 n 配 舄 舄 钳 鼹 鼹 b 鼹 n 佰 浙江工业大学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 1 引言 生物科学技术的发展带动了人类对于生命现象的探究，从而带动了人类对于 生命科学的研究，尤其是在微观的生物体系中，例如：细胞内的物质交换、d n a 遗传物质的复制、蛋白质的组成和功能等。当人们不再能够用肉眼直接的来获取 有用的研究现象和结果时，各种精密的生物分析手段便随着生命科学研究的需要 接踵出现了。其中最直接的方法就是提高显微镜的分辨率，通过采用高倍的电镜 来观察生物体内的物质流动与变化，但是这种方法有两个缺陷，一是不能够很好 的揭示生物体内反应的靶点和结合方式等具体细节，二是灵敏度也不够高。一些 科学家利用电化学的方法来检测生物体内化学和物理变化，通过检测生化反应过 程中电流的变化来推测反应进行的方式。虽然电化学方法较为灵敏，但是对于设 备和材料的要求比较苛刻，分析过程中的影响因素也较多，应用也还不够成熟。 相对于其他的分析方法而言，目前应用最为广泛的一种有效生物检测方法就 是荧光分析技术，这种分析技术是利用带有识别基团的荧光化合物分子作为检测 试剂，在与靶标物结合的前后，由荧光的强度或者波长的变化来判定靶标的种类 和浓度等相关参数。这类荧光分析技术具有较高的灵敏度和较好的操作可靠性， 同时它还广泛应用于设计生物体内小分子的探针，例如：k + 、n a + 、c a 2 + 等碱土 金属离子荧光探针【1 】，c d 2 + 、p b 2 + 、c p 等重金属离子荧光探针【2 】，蛋白质、糖 类、氨基酸等生物体内的大分子荧光探针【3 - 5 1 。 综上所述，荧光分析技术在生物分析领域有着不可替代的重要作用，而这种 分析技术的关键组成部分之一就是检测信息的传递者荧光染料。因此，荧光染 料的特性将直接影响到检测结果的准确性和灵敏性，因而开发适用于荧光标识的 荧光染料将对生物技术的发展起到巨大的推动作用。 1 2荧光产生的理论基础 由于分子中具有处于不同能级的电子，当光照射到分子上时，电子被激发， 由低能级跃迁到高能级，处于高能级的电子不稳定，通过辐射跃迁或非辐射跃迁 失去能量返回基态。荧光就是处在激发态的分子或原子返回基态的过程中伴随着 浙江工业大学硕士学位论文 放射出来的一种光能，受光照射激发的分子，发出的是分子荧光。 荧光现象早在1 6 世纪就被发现，但是对于荧光的产生原理直到1 9 世纪中期才 清楚。s t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后，发现他们的荧光波 长比照射光波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出的光，并且波长不同，荧 光是发射光被证实。根据“萤石”能发出这种光，提出了“荧光”这一名称。 e 堵邑量，f 荧光，p 磷光，i s c 体系间跨越，i c 内转换 图1 1 分子荧光的产生过程 荧光产生过程如图1 1 所示【铺】。通常情况下，荧光分子处于基态，当吸收光 后，荧光分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两 种类型，多重态用2 s + 1 表示，s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为o 或1 ，当 s 为o 时，分子内轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线 态( 大多数有机物分子的基态是处于单线态) ，分子吸收光能后，电子跃迁到高 能级，电子自旋方向不变，此时分子处于激发单重态( s o ，s l ，s 2 ，? “，表示 分子的基态和第一，第二，激发单重态，能量由低到高) 。如果处于基态单 重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电子自旋方向的变化，在激发态分 子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时s = 1 ，表明分子处于激发态的三重态， 用t 表示，t 1 、t 2 分别表示三重态的第一、第二激发态。分子中的电子从基态s o 跃迁到激发态s l 、s 2 比较容易发生，进行很快( 约1 0 4s ) ，而从基态单重态到激 发态三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子( 如s 2 ) 可以与其他同类分子或 溶剂分子碰撞通过内转换( 无辐射跃迁) 回到激发态的最低能级s l ，这一过程时间 为1 0 以2s ，处于激发态最低能级的分子寿命一般为1 0 4 1 0 。8s ，它们会放出光子返 回基态，这时产生的光就是荧光。即最低激发态( s 1 ) 分子回到基态( s o ) 会产生荧 光，从s 1 到t l 能量转化是系间跨越，从t 1 回到s o 有两种过程，一个是系间跨越， 无能量释放；另一个是放出光子，即磷光，在1 0 4 1 0s 间完成。 2 浙江工业大学硕士学位论文 1 3描述荧光特性的参数 吸收光谱就是荧光染料分子吸收光能使电子从基态跃迁到激发态而产生的 吸收光谱。 荧光激发光谱是指把荧光物质试液置于荧光光度计光路中，固定荧光发射波 长和狭缝宽度，扫描，得到荧光激发波长和相应荧光强度的关系曲线，即为荧光 激发光谱。 荧光发射光谱即荧光光谱的获得过程，类似于激发光谱。固定激发波长和狭 缝宽度，扫描，得到荧光发射波长和相应荧光强度的关系曲线，即为荧光光谱。 荧光物质的荧光激发光谱和发射光谱形状相似且成镜像对称。根据荧光产生 的原理不难理解这一现象，激发光谱所反映的是电子跃迁到第一激发态的情形， 而荧光光谱所反映的是电子从激发态的最低能级回到基态的情形。能量在基态的 振动能级上的分布情形和第一激发态中的振动能级上的分布情况相类似，所以激 发态光谱中跃迁能量最小的波长与荧光光谱中能够发射能量最大的波长相对应。 s t o k e s 位移指的是荧光最大发射波长跟最大吸收波长的差值。 荧光强度是指在一定条件下仪器所测得荧光物质发射荧光大小的一种量度， 荧光物质所发射的荧光无固定方向，实际上所测量的是某一方向的荧光，它除与 物质本身的荧光量子产率有关，还与介质、环境、仪器性能等因素有关。物质吸 收光越多，处于激发态的分子数越多，发出的荧光强度就越大。 f = 2 3 f i o 曲c ( 1 1 ) f 为荧光强度，f 为荧光量子产率，1 0 为照射到被测物质上的光强度，为该物质 的摩尔消光系数，b 为检测池厚度，c 为物质浓度。 荧光量子产率也称为荧光效率，是物质的固有属性，理论上定义为荧光物质 吸收光后所发射的荧光光子数与吸收的激发光光子数之比。在同一浓度下，产率 越大，荧光强度也大。可用下式测定： o s a 唧k = 删xj 鞠叫e j s 诅n d a i d ( 1 2 ) 式中：鼹砷l 。、西删分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；k l 。、k d a l d 分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度。 荧光寿命是指当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的l e 所 需的时间，它表示的是粒子在激发态存在的平均时间。可用下式测定： 浙江工业大学硕士学位论文 h 1 f o 虹= - 价 ( 1 3 ) f o 和f 。分别代表仁o 和f 呵时的荧光强度，通过实验测量不同时间的f 。值，确定 时。t 关系曲线，其斜率就是荧光寿命。 1 4分子结构与荧光的关系 有机荧光分子的荧光特性( 紫外吸收光谱、荧光发射光谱、荧光量子产率等) 首先取决于它自身的能量状态，即取决于它自身的分子结构，而外界因素( 浓度、 温度、压力、介质、酸度等) 对荧光特性的影响是次要的。科学家们对于荧光分 子结构与荧光特性关系的规律做了大量的研究，得出荧光分子的荧光性能与其共 轭体系的大小、共轭大兀键的共平面性及刚性程度、分子母体上取代基的种类及 取代基所在位置和分子的几何结构等因素有关，下面分别给予讨论。 一、分子共轭体系大小对荧光的影响。有机荧光分子都含有发射荧光的基团， 通常称为荧光团。荧光团必须含有共轭大7 【键，而且大尢键达到一定程度后才会发 出荧光，例如：( c h = c h ) n ( n 2 ) 、苯、萘、苯并杂环、对苯二醌等。芳环类碳 氢化合物与直链的烯烃化合物相比，激发能向振动能的转换更难，因而荧光强度 更大。共轭体系越大，7 c 电子越容易激发，荧光( 或者磷光) 越容易产生，荧光发 射向长波方向移动，多数情况下荧光量子产率增加。荧光强度大的有机化合物绝 大多含有芳香环或者芳香杂环，芳香环数越多，共轭体系越大，荧光越强，但芳 香环或者共轭体系增加到一定程度时，只是荧光发射波长红移，荧光量子产率不 但没有增加，反而降低，这一现象涉及共轭大7 c 键共平面及其刚性的影响【9 】。 分子取得平面结构才能显示出荧光特性。对于具有强荧光的有机化合物和荧 光分子，仅有大的共轭体系还不够，还要分子的共轭体系必须具备共平面性并且 要有一定程度的刚性，如图1 2 所示，联苯由0 l 键连接，两个苯环由于立体结构效 应或者空间位阻不能共平面，处于最大自由度，量子产率为o 1 8 ，而芴相当于通 过一个亚甲基把联苯的两个苯环固定在一个平面上，不能扭曲或者转动，共平面 性大且刚性强，荧光量子产率接近1 。 4 浙江工业大学硕士学位论文 q po o 图1 - 2 两个荧光化合物的结构 二、取代基对荧光的影响。有机荧光化合物分子中的取代基对其荧光性能影 响显著，在荧光团上引入取代基有供电子和拉电子取代基两种类型，取代基的影 响分为取代基种类和取代基所处位置两种。 取代基种类的影响。供电子取代基增强荧光，这类取代基有：心限2 、她、 二n h 2 、o r 等，含有这类取代基的荧光有机分子，其激发态的产生常常是由取代 基的o 或n 的非键电子被激发到f 键上造成的，取代基共轭电子参与有机荧光分 子的大兀键等于扩大共轭体系，使最大吸收和荧光发射波长红移，荧光强度增强， 但是含供电子基团的荧光分子在极性溶剂中容易形成氢键而质子化，使其带部分 正电荷，荧光会显著减弱，离解出氢后荧光又恢复。拉电子取代基有：n 0 2 、 - n = n 、- c o r 、c = o 、- c h o 、一c o o h 、x ( f 、c l 、b r 、i ) 等，含有这类取代 基的荧光分子对荧光强度的影响与供电子基相反，即减弱荧光，波长蓝移。因为 这类取代基中的n 电子跃迁到7 c 键上属于禁阻跃迁，激发态分子数少，而且s 1 t l 的系间跨越占优势，放出光子的激发态分子数减少，致使荧光减弱。硝基吸电子 能力最大，对荧光抑制非常严重，几乎所有荧光化合物中引入硝基都没有荧光， 其s 1 t 1 系间跨越率达到o 6 。氰基虽然也是强吸电子基团，但是却表现出供电子 效果，它能使荧光增强。磺酸基以及羧酸基含不饱和基团，表现出吸电子性能， 减弱荧光，但当它离解出h 质子后带负电，又表现出供电子行为，荧光增强，一 般在荧光染料中引入磺酸基或者羧酸基是为了增加水溶性。 取代基位置的影响。取代基在荧光分子上的位置及取代基数量对荧光分子的 荧光量子产率的影响视具体情况而定，只有一个供电子取代基，处于空间位阻最 小或者没有位阻时，可以使荧光增强。当供电子基和拉电子基共存时，供电子基 结合在对于拉电子基共振电子密度减小的原子上，构成荧光性，即存在供拉电子 效应，从而使荧光大大增强。 芳香环中杂原子的影响。一般来说，杂原子对荧光的影响比较复杂，有时使 荧光增强，有时使其减弱，主要看杂原子的结构。 取代基加重效应对荧光的影响。通常情况下，随着取代基原子量的增加，化 5 浙江工业大学硕士学位论文 合物的量子产率会降低，例如：卤素、硫、磷等都存在加重效应【刀。 三、外部环境对荧光的影响。温度影响：一般情况下，荧光物质随着溶液温 度的升高，其荧光强度会降低，主要是分子内部能量的转换作用随着温度的升高 而加快和激发态分子和溶剂分子之间发生某些可逆的光化学反应这两方面原因 造成的。溶剂效应：通常情况下，溶剂的极性对荧光化合物的光谱会发生影响， 随着溶剂极性的增加，化合物的吸收和发射光谱会蓝移，这就是负向溶剂化显色。 p h 影响：很多荧光化合物尤其是含有氧、氮或酸根离子的荧光化合物，对p h 极 其敏感，因为该类染料的质子化和非质子化的两种状态能显著改变荧光分子的电 子云密度，从而极大改变其光谱特性。 1 5生物近红外荧光技术 生物样品自身在紫外区域有很强的吸收，荧光检测时会显现出一定强度的自 发荧光，造成强的荧光背景，从而极大地降低了检测的灵敏度。近红外荧光染料 由于能避开这个问题近年来受到了广泛的重视。甚至有专家认为，在荧光技术从 培养皿研究阶段发展到动物模型研究阶段过程中起最关键作用的就是近红外荧 光染料和以它们为基础设计的分子探针【1 0 1 。 人眼能有反应的光谱范围被定义为电磁光谱的可见光区，在光谱中的范围是 4 0 0 7 2 0 衄。紧接着可见区在长波长方向的区域即为近红外区( n e a r 砧a r e d ， n 叹) ，一般被认为的光谱范围是6 7 0 9 0 0n m ，见图1 3 。一般来说，适合近红外 荧光技术使用的工作区域均可称为近红外区。而对于染料来说，其最大发射波长 超过6 5 0n m ，即可被称为近红外染料。 图1 3 近红外区在光谱中的位置 由于很多人们感兴趣的生物分子本身不发荧光，或发光不足，因此为了方便 研究分析这些分子，可通过引入具有荧光的物质与其结合，通过荧光分析技术来 实现对这些重要分子的研究分析，其中有机荧光染料是最为常用的荧光物质。在 6 浙江工业大学硕士学位论文 生物样品分析中，需分析的目标分子往往不具有荧光，而生物样品中的另一些成 分在一定光谱范围却有较强的吸收和荧光发射。如下图1 - 4 所示，血红蛋白和组 织色素等的吸收和荧光光谱分布在几乎整个紫外可见区( 如藻胆蛋白的吸收光谱 范围是4 7 0 6 5 0n m 【l l 】) ，而脂类和水在中红外区有强的吸收，只有近红外区 7 0 0 9 0 0n m 是个空白区【1 0 1 2 1 。 j 重噩至口匪翌日固 i 血红虽皇组织色素 li 迎红外区li 腊类。7 h 、 图1 4 生物样品在近红外区表现出最弱的背景吸收和自发荧光 在紫外可见区进行荧光检测所存在的问题主要体现在以下三个方面：一、生 物样品在这个区间的吸收使光进入生物组织内部变得困难；二、紫外可见光在组 织内的散射光干扰较强，因为散射光强度与波长的六次方成反比，即波长越短， 散射越强，同样造成紫外可见光进入生物体内的深度也不够；三、生物样品中某 些成分的自发荧光形成很强的背景干扰，使荧光检测效率大大降低。 相反，近红外区荧光检测所表现出的独特优势，基本上可以克服上述问题。 在对小鼠的光照对照实验中【1 3 1 ，发现在相同条件下小鼠体内近红外光( 6 7 0m ) 的光子数是绿光( 5 3 0n m ) 的四倍，理论计算显示近红外光渗透进入组织的深度 能达到7 1 4c m ，最为重要的是荧光背景几乎被完全消除，荧光效率大大提高。 1 6荧光标识染料的种类及主要特点 图1 5 芘类荧光染料的母体结构 该类染料的母体本身荧光不强，但是当其含有供电子基团时，其衍生物的 荧光可以达到很强( o 5 ) ，a 位是一个反应活性最大的位点，可以与含碳基的 化合物反应，引入活性基团，如图1 5 所示。因为芘是平面结构，所以芘分子在 溶剂中有很强的积聚效应，导致一个长波长的荧光发射在4 7 0n m 附近出现，这 7 浙江工业大学硕士学位论文 个性质常常被用来设计成芘基激缔合物荧光探针【1 4 ，另外芘的平面性也使得该 类染料比较适合作为d n a 的嵌入型探针。这类染料的优点是极其稳定，长时间 接受光照或酸碱都不会引起结构的变化，但是缺点也是非常明显，最大吸收波长 过短( 8 0 ，0 0 0c m _ m 一， 有利于提高染料的光敏性能，便于应用在生物分析领域；二、具有很高的荧光量 子产率，普遍能够达到0 6 以上；三、光谱性质非常稳定，不易受到溶剂极性和 p h 值的影响；四、荧光光谱半峰宽较窄，这样使得染料在应用到分析领域的时 候检测灵敏度非常高，待测的样品只要有微量存在的前提下，荧光探针分子就能 够用显著的荧光变化指示出样品的存在；五、具有较高的光稳定性，不会因为荧 光分析过程中受激发光的照射而导致染料结构的迅速光降解，从而保证了光谱信 号的变化仅源于受检测的样品；六、分子结构中不含离子电荷，这样可避免因为 电荷的存在导致染料分子与溶液中其它离子间静电相互作用的可能，减少了干扰 源。然而，这类荧光染料的缺点是大部分的荧光发射波长在5 3 0 6 3 0n m 之间圆， 从而影响了其在近红外荧光分析领域的广泛应用。 总结以上所描述的几类荧光染料，我们可以发现，这些染料都存在着各种 缺陷，特别是应用到近红外生物分析领域还有很多的局限性，改进这些染料的性 能是其中的一个解决的方案，但是这些染料的基本结构也注定了对于这些染料分 子小规模的修饰只能部分的改善他们的应用性能，不能够从根本上克服这些染料 的缺陷。因此，设计新型的荧光染料应用于近红外生物分析领域就成为目前近红 外荧光染料发展和应用的迫切需要。 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 1 7a z a - b o d i p y 荧光染料的研究进展 a z a b o d 口y 荧光染料是近十年才发展起来，并受到广泛重视的一类新型荧 光化合物。1 9 4 3 年，r o g e r sm a 课题组首次报道了没有与b f 2 络合的四芳基氮杂 二吡咯甲川类化合物 2 3 1 ，其结构如图1 1 1 所示，然而在其后的近5 0 多年中，这个 结构没有引起其他科学家的关注。直到2 0 0 2 年，o s h e ad f 课题组报道了其与 b f 2 络合的产物 2 4 】，俗称a z a - b o d i p y 荧光染料，如图1 1 2 所示，从此该类荧光 染料才开始被广泛地研究。 图1 1 1四芳基氮杂二吡咯甲川类化合物 1 a r h 署一e j n 3 b f 3 0 e t 2 ，d i e a ，c h 2 c 1 2 r l1 6 h b f 3 0 e t 2 d i e a ，c h 2 c 1 2 b r r t 1 6 h 2 4 图1 - 1 2 这类荧光染料可作为光敏剂应用于光动力学疗法。光动力学疗法( p d t ) 是 一种治疗癌症的新方法【2 5 之7 】。它基于两个因素，一个是光敏剂，另一个是与这种 光敏剂吸收光谱相匹配的相应波长的光。光敏剂注入人体并代谢一段时间后，在 肿瘤组织中的浓度要比在正常组织中高，此时若用相应波长的激光照射患处，可 对肿瘤组织进行靶破坏。p d t 对于癌症的治疗具有极高的选择性，在没有光照射 的区域，光敏剂是没有毒性的，只对受照射区域产生影响。 在a z a - b o d 口y 荧光染料发色团中心p 位置引入溴原子4 ，是为了增加三重激 发态的产生。三重态光敏剂与氧相互作用产生单态氧，这种单态氧被认为是p d t 浙江工业大学硕士学位论文 中的主要细胞毒素，它可造成细胞膜的不可逆损伤，使组织的脉管系统被破坏， 细胞最后因得不到营养供给而死亡，最终靶组织被根除，而正常组织由于光敏剂 浓度较低而得到保护。 2 0 0 4 年，他们继续扩大上述的成果，首先对合成a z a - b o d d y 荧光染料的条 件进行优化，得出最佳反应条件，试剂醋酸铵，溶剂丁醇，回流状态下反应时间 2 4 小时，分离纯化收率4 7 。接着他们通过在a z a b o d d y 荧光染料发色团中心b 位置引入溴原子研究其光物理性能，得出引入溴原子后，最大吸收波长变化不大， 只产生轻微蓝移，而荧光量子产率却大幅度减少，其原因可能是当引入溴原子到 荧光染料中心上，产生较强的重原子效应，导致荧光量子产率降低。同时他们研 究了溶剂对a z a b o d i p y 荧光染料的影响，得出不同的溶剂( 甲苯、氯仿、乙醇) 对a z a b o d d y 荧光染料的荧光光谱波长基本没影响【2 8 1 。 2 0 0 5 年，o s h e ad f 课题组报道了一类新的a z a - b o d 口y 荧光染料【2 9 1 ，如图 1 1 3 所示。当这类染料用作p d t 试剂时，可通过调节p h 值实现控制其选择性。通 过光诱导电子转移机理，未被质子化的氨基受体使光敏剂的激发态快速达到平 衡，没有发生能量的转移从而抑制了细胞毒素试剂( 单态氧) 的产生，最终不能 杀死细胞。相反地，当氨基受体被质子化时，光诱导电子转移停止，发生能量的 转移，产生细胞毒素试剂( 单态氧) ，从而杀死细胞【3 0 ，3 1 1 。 x 5 x ”f m a r 2 = p hp h 4 m e o c 6 h 4 x = h hb r 5 b 5 c 5 d 图1 1 3 2 0 0 6 年，o s h e ad f 课题组报道了一类新的a z a - b o d 口y 荧光染料【3 2 】，并 把它们应用于荧光传感器领域。荧光传感器是一类能将分子识别事件通过荧光信 号有效表达的分子3 3 1 。典型的荧光传感器一般是由荧光团通过连接基与接受体 相连而成。如图1 - 1 4 所示，它们都拥有受体( 氨基) 连接基( 亚甲基) 一荧 1 2 浙江工业大学硕士学位论文 光团( a z a b o d i p y ) 这一体系。这类荧光传感器可用于分析检测质子、阳离子、 阴离子、糖类和缩氨酸等】，它的原理是当氨基受体接受客体时，导致光诱导 电子转移机理失效，从而体现出荧光性，荧光传感器打开。他们通过研究p h 值 和溶剂极性对这类荧光传感器的影响，得出如下结论：随着p h 值( 1 0 4 ) 的 减少，荧光性增强，荧光传感器打开；随着溶剂极性( d 坶、t h f 、二嗯烷、环 已烷) 的减少，荧光性增强，荧光传感器打开【3 引。 n b n b 6 a6 b 图1 1 4 最近，o s h e ad f 课题组对a z a b o d 口y 荧光染料进行基团修饰， 系列新的荧光传感器 3 6 。3 8 1 ，如图1 1 5 所示。 、 7 r 开发出一 n 一 8 ar = h ，8 b r = c h 3 9 图1 1 5 这类传感器都是基于内在的电子转移机理来响应酸性变化的，随着酸性的变 化，荧光传感器产生灵敏的响应，控制荧光性的关开，其中荧光染料7 和9 都是 内在的双重性质的荧光传感器。当p h 从5 6 mh c l 变化时，荧光染料7 上的一个氨 基与旷结合形成氨基正离子，随着酸性的增强，另一个氨基也与旷结合形成氨 基正离子，在这一过程中，最大吸收波长发生蓝移从8 0 0n i n 到7 5 0 嫩再到6 5 0n m ， 最大荧光发射波长也发生蓝移从8 3 0n m 到7 6 0 姗再到6 8 0n m ，相应的比色度变化 。 卧舞 浙江工业大学硕士学位论文 为从红色到紫色再到蓝色，因此荧光染料7 也可作为高灵敏性的多重响应的酸性 指示剂。比较荧光染料8 a 和8 b 是为了研究其受限制的构象对其氨基受体的影响， 他们研究发现通过细微的构象的改变，能够控制分析物引起光物理性能响应。 2 0 0 7 年，g a w l e yr e 课题组报道了一类基于a z a - b o d p y 荧光团一亚甲基 连接基一冠醚受体这一体系的荧光传感器【3 9 1 ，如图1 1 6 所示。这类荧光传感器 主要是用于检测贝类毒素，其工作原理为：当贝类毒素不存在时，相当于氨基未 被质子化，光诱导电子转移机理生效，荧光性关闭；当贝类毒素与冠醚络合时， 相当于氨基被质子化，光诱导电子转移机理失效，荧光性打开，从而可检测出是 否存在贝类毒素】。 n b 图1 1 6 2 0 0 8 年，o s h e ad f 课题组报道了一类新的a z a b o d 口y 荧光染料【4 l 】，并把 它们应用于近红外区域的荧光探针领域，如图1 1 7 所示。荧光探针是指用荧光 试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物 质，使检出限大大降低，可方便快速地检测金属离子、有机分子和生物大分子 ( 多肽、蛋白、核苷酸) 等。这类荧光探针的特点是具有较高的荧光量子产率和 荧光发射波长超过7 5 0n m ，发射波长在7 5 0 9 0 01 1 i n 区间的荧光探针可有效避免 细胞内自身短波长荧光体的干扰，因此这类荧光探针在生物检测领域中具有极大 的潜在应用价值。 1 4 浙江工业大学硕士学位论文 1 1 ar = h r 一= h 1 1 br = o c h 3r 1 = h 1 1 cr = h r 1 ：o c h 3 图1 1 7 2 0 0 9 年，o s h e ad f 课题组报道了一类基于a z a - b o d i p y 荧光染料固载化的 荧光探针【4 2 1 ，通过固载化增强了a z a b o d 口y 荧光染料的荧光亮度和光稳定性， 如图1 1 8 所示。同年，他们报道了一类p h 值响应的近红外区域的荧光探针【4 3 1 ， 如图1 1 9 所示。随着p h 值( 5 _ 8 ) 的增大，这类荧光染料的荧光性逐渐降低， 直至荧光性关闭。引入糖基m 】的目的是为了增强a z a b o d p y 荧光染料的水溶 性，达到轻微水溶性的要求，有利于生物领域的应用。 n b 1 2 aa r 2 2c 6 h 5 a r l 2c 6 h 5 1 2 ba r 2 。c 6 h 5 a 2p c h 3 0 c 6 h 5 12 c a r 2 = p ( c h 3 ) 2 n c 6 h 5a = c e h 5 图1 1 8 p h 1 3 图1 1 9 1 5 h q 可 羚 浙江工业大学硕士学位论文 1 8a z a b o dip y 荧光染料的设计理由 通过对荧光染料种类的综述，我们得出适宜近红外生物分析领域的荧光染料 应该具有以下特征： 一、荧光量子产率较高。荧光量子产率高将有助于提高检测的灵敏度，使检 测极限维持在较低浓度的水平。 二、最大吸收和发射波长较长，接近于近红外区域。因为生物体内存在很 多有机共轭小分子，例如：嘧啶、嘌呤、蛋白质分子、各种氨基酸等，它们在紫 外区域都有吸收和发射光谱，如果荧光染料的吸收波长在紫外或者较短波长区 域，将会降低荧光探针的灵敏度，并且某些干扰分子的自发荧光会掩盖探针的发 射光谱，使检测的结果容易出现偏差。另外，紫外激发光照射在生物组织内而造 成的散射光也对荧光的检测灵敏度构成了很大障碍。 三、较高的稳定性。无论是在光照下、酸碱条件下，或者在较高温度下，染 料的化学性质应该稳定，不会发生严重的光氧化现象，不会在酸碱条件有较小改 变的状况下光谱发生较大的波动，也不会在稍高的温度下导致染料分子迅速的分 解。 四、具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力，这样能够使荧光探针适 合应用于细胞领域。染料分子要具有一定的油溶性和水溶性，油溶性是为了便于 穿透细胞膜，水溶性是为了有助于在细胞内很好的分散。 五、对生物体没有或者仅有极小的毒害。荧光探针应该只对特定的靶标发生 作用，而不应该由于自身结构的原因而对细胞内其它活性组织产生破坏作用，而 作为荧光探针重要组成部分的荧光团当然要对细胞的毒害作用最小，尽量不要干 扰细胞的活性。 基于以上五点，提出设计合成a z a - b o d 口y 荧光染料，因为他们具有极好的 光物理性质，具体表现如下： 一、具有较高的摩尔消光系数，通常范围7 5 ，o o o ，8 5 ，0 0 0m 4 c m ，有利于提 高染料的光敏性能，比取代卟啉( 3 0 0 0 5 0 0 0m 。1 c m 。1 ) 大的多，这个强烈的吸收 能有效促进单氧的产生，因此这些分子也是潜在的光敏剂应用于光动力学疗法。 二、具有较长的最大吸收和发射波长，最大吸收波长范围6 5 0 8 0 0 衄，最大 发射波长范围在6 5 0 8 5 0n m ，接近近红外区( 7 0 0 9 0 0 衄) 。 1 6 浙江工业大学硕士学位论文 三、具有稳定的光谱性质，不易受到溶剂和p h 的影响。不易受到溶剂影响 的这一性质对于设计能在不同溶剂中工作的分子探针非常重要，因为必须要保证 染料光物理性能的不变性才能方便的应用在测试领域。对于p h 不敏感这个性能 使这类染料适合应用在d n a 测序和d n a 标记领域。 四、具有较窄的荧光光谱半峰宽，这样使得染料在应用到分析领域的时候检 测灵敏度非常高，即使待测的样品只有微量存在的前提下，荧光探针分子也能够 用显著的荧光变化指示出样品