（环境工程专业论文）不同材料包埋的菌株净化水产养殖水质的研究.pdf

南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务：( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。周时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 l f i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩： 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 随题 2 0 1 0 年6 月6 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 不同材料包埋的菌株净化水产养殖水质的研究 姓名陈颖学号 2 2 2 0 0 6 0 4 7 0 答辩日期 2 0 1 0 年5 月2 0 日 论文类别博士口学，男硕士口硕士专业学位一高校教师口同等学力硕士口 院系，所环境科学与环境工程学院专业环境工程 联系电话 l3 8 2 0 4 0 0 8 4 9 e m a i l c a u - y c h e n 16 3 c o r n 通信地址( 邮编) ：外环西线3 8 公里处天津林业果树研究所 备注：是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文使用授权书 根据南升大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务：( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字：j 垂乳 2 0 0 年r 月孑d 日 论文题目 彳、日材耕钆坦酌随橡黼膊裘殖求良酌纨宪 姓名 饼翁。 学号 x 讶o o b o 答辩口期 ) o l o年f 月印口 论文类别1 商士口学历硕士口硕士专业学位盯高校教师口 同等学力硕士口 院系所 砜宿觥马袜诸程 专 业 弼、旖。i 旌 联系电话 j 乏意知0 二肿7 e m a i l 曲j ，、，幽幼p 厶弓仞m 通信地址( 邮编) ：，互：意蕊蠢姝弼、洒铭嘏心壁泛湾就蜮尉研谚磊f2 0 0j j n 、 ， ? 泛。j 备注： 是否批准为非公开论文 t ， 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 取 含 涉 学 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级口限制( 2 年) 口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年可少于l o 年) 摘要 摘要 本文在试验中选择了光合细菌和芽孢杆菌两类不同的菌株，采用了海藻酸 钠、p v a 海藻酸钠和n a c s 微胶囊三种不同的固定化材料分别进行包埋，并对 包埋后的固定化细胞在水产养殖中的净化效果进行了比较。结果表明：以三种 不同材料包埋的固定化菌株，在去除养殖水的氨氮、亚硝酸盐和c o d 上比对照 有着显著的效果。以海藻酸钠c a c l 2 法包埋的微生物小球，去除养殖水中的氨氮、 亚硝酸盐和c o d 效果较好，但抗冲击力和机械性能较差。而p v a 海藻酸钠一饱 和硼酸法制各的微生物小球传质性稍差。n a c s p d m d a a c 微胶囊，由于膜较薄， 抗冲击力较差，而其中空的纯液态环境为细胞的生长提供了更大的空间，尤其 是水处理1 0d 后，被包埋的细胞去除氨氮、亚硝酸盐和c o d 的效果明显。同一 材料包埋的不同菌株对养殖水的净化效果也不相同，光合细菌去除水产养殖中 的n i - h + n 和c o d 效果明显。对亚硝酸盐的去除中，地衣芽孢杆菌效果明显好 于枯草芽孢杆菌。 另外，为了验证光合细菌与芽孢杆菌之间有协同作用的关系，本文按一定的 比例将光合细菌与芽孢杆菌进行混合固定化用于养殖水的净化，结果表明：固 定化混合菌的效果明显好于单一菌种，并且光合细菌与芽孢杆菌发酵液以l ：3 混合时，氨氮、亚硝酸盐和c o d 的去除效果最好，1 5d 后分别达到了8 2 3 、 8 5 和8 0 3 。 关键词：包埋；光合细菌；芽孢杆菌；n a c s p d m d a a c 微胶囊；水产养殖 a l g i n a t e s a t u r a t e db o r i c a c i dm e t h o dh a dal e s sm a s st r a n s f e re f f e i c i e n c y n a c s p d m d a a cm i c r o c a p s u l e sh a dp o o ri m p a c tr e s i s t a n c ed u et ot h et h i nf i l mi s t h en a c s o p d m d a a cm i c r o c a p s u l e sp r o v i d e dm o r es p a c ef o rc e l lg r o w t h a f t e r10 也t l l er e m o v a lo fn h 4 + - na n dc o dw a ss i g n i f i c a n t d i f f e r e n ts t r a i n se m b e d d e db y t h es a m em a t e r i a lh a dd i f f e r e n te f f e c to nt h ew a s t e w a t e rp u r i f i c a t i o n c o m p a r e dw i t h t w ok i n d so fb a c i l l u s ，t h ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i as h o w e dag r e a t e rr e m o v a lo f n l - h + - na n dc o d ，w h i l eb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sh a dag r e a t e rr e m o v a lf o rn i t r i t et h a n b a c i l l u ss u b t i l i s i na d d i t i o n , t h e p u r i f i c a t i o n o ft h ew a s t e w a t e rb yt h em i x t u r eo ft h e p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aa n db a c i l l u sw a so b s e r v e di no r d e rt oi l l u s t r a t et h es y n e r g i c e f f e c to ft h em i c r o o r g a n i s m s w h e nt h er a t i oo fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i am i x e dw i 廿1 t h eb a c i l l u sw a s1 ：3 ，t h er e l a t i v er e m o v a lr a t eo fn h 4 + - n 、n 0 2 - na n dc o dw a s 8 2 3 、8 5 a n d8 0 3 a f t e r1 5d k e y w o r d s ：i m m o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e ；p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i a ：b a c i l l u s s p ；n a c s - p d m d a a cm i c r o c a p s u l e ；a q u a c u l t u r e h 目录 目录 第一章引言1 第一节水产养殖的现状及问题1 第二节养殖废水的特点与水质指标1 1 2 1p h 值2 1 2 2 溶解氧2 1 2 3 总悬浮颗粒物t s s 2 1 2 4 有机物2 1 2 5 氨氮3 1 2 6 亚硝酸盐3 第三节微生物制剂在水产养殖中的作用3 i 3 i 微生物制剂的类型4 1 3 2 微生物制剂的作用机理5 1 3 3 微生物制剂的优点5 1 3 4 微生物制剂在我国的应用5 第四节固定化微生物技术及其在养殖水处理的应用9 1 4 1 固定化技术的优点9 1 4 2 固定化方法的类型9 1 4 3 共固定化技术1 2 1 4 4 固定化技术在水产养殖中的应用1 2 第五节生物微胶囊技术的研究1 3 1 5 1 生物微胶囊1 3 1 5 2 c s p d 粼微胶囊体系1 5 1 5 2 1n a c s p 蹦d 从c 微胶囊的制备1 6 第六节研究的主要内容、目的、意义1 8 1 6 1 研究目的1 8 1 6 2 主要内容1 8 l - 6 3 研究意义1 9 i u 第三节结果与讨论2 4 2 3 1 三种包埋材料强度的比较2 4 2 3 2 固定化光合细菌对养殖水中氨氮的去除2 5 2 3 3 固定化光合细菌对养殖水中亚硝酸盐的去除2 6 2 3 4 固定化光合细菌对养殖水中c o d 的去除作用2 7 第四节小结2 8 第三章芽孢杆菌的固定化及对养殖水的净化作用3 0 第一节试验材料3 1 3 1 1 菌种3 】 3 1 2 培养基3 1 3 1 3 试验用水3 l 3 1 4 试剂3 1 3 1 5 试验设备3 l i v 目录 第二节试验方法3 2 3 2 1 种子液的制备3 2 3 2 2 活菌数测定3 2 3 2 3 包埋法3 2 3 2 4 对养殖水的净化3 3 3 2 5 检测方法3 3 第三节结果与讨论3 3 3 3 1 周定化枯草芽孢杆菌对养殖水的净化作用3 3 3 3 2 固定化地衣芽孢杆菌对养殖水的净化作用3 6 第四节小结3 8 第四章光合细菌与芽孢杆菌的协同作用3 9 第一节试验材料3 9 4 1 1 试验用菌液3 9 4 1 2 培养基4 0 4 1 3 试验用水4 0 4 1 4 试验设备4 0 第二节试验方法4 0 4 2 1 种子液培养4 0 4 2 2 混合发酵：4 0 4 2 3 混合菌的最佳配比4 1 4 2 4 混合菌的固定化4 1 4 2 5 水处理4 1 4 2 6 混合菌生长情况检测4 2 4 2 7 检测方法4 2 第三节结果与讨论4 2 4 3 1 混合菡的生长情况4 2 4 3 2 不同配比的混合菌的氨氮去除效果4 3 4 3 3 固定化细胞水处理中的氨氮去除效果4 4 v v l 第一章引言 第一章引言 第一节水产养殖的现状及问题 随着全球经济的发展和人民生活水平的提高，世界市场对水产品消费的需 求日益旺盛。近年来联合国粮食与农业组织( f a o ) 和各主要渔业国家对水产养 殖业发展的关心和支持明显加强，使其成为世界粮食生产产业中发展最快的部 门之一。据统计，在1 9 9 1 2 0 0 1 年1 0 年间，全球水产养殖业生产量增加了1 6 倍，价值量增加了1 0 倍，给世界渔业发展作出了巨大贡献i 。 我国自2 0 世纪9 0 年代初水产养殖的产量迅速增长，到2 0 0 4 年全国水产养 殖产量已达3 2 0 9 万吨，占世界总产量的7 0 以上。随着养殖规模的扩大，养殖 方式也由单一方式发展为池塘养殖、淡水大水面养殖、浅海养殖、海洋滩涂养 殖和工厂化养殖等多种方式并存。其中前四种养殖模式的面积占我国养殖总面 积的9 2 7 ，产量占9 1 1 t2 。 养殖方式的进步大幅度提高了水产品的产量，然而，推动水产养殖业发展 的同时，对其自身所依赖的水环境的破坏也日益加剧。一方面残饵、排泄物、 粪便等大大增加了养殖水体的有机氮的含量，造成养殖水体的富营养化，导致 水质恶化，给养殖过程中疾病的传播带来了有利条件，而养殖废水的大量排放 也给养殖水周围的水域造成了严重的破坏；另一方面，长期使用抗生素和其他 化学药物防治养殖病害，造成有毒物质残留在水体，影响野生种类的免疫力， 还造成生物残留，通过食物链危害人类健康。1 9 9 3 年，我国半密集型对虾养殖 产量比1 9 9 2 年降低约7 0 ，其主要原因就是养殖场排放的污染物使水源衰退。 由此可见，水产养殖水质状况的控制已成为制约生产发展的关键口j 。 第二节养殖废水的特点与水质指标 水是水生动物赖以生存的环境，水环境质量的好坏直接影响水产养殖的产 量和经济效益。残余的饵料同水生动物的排泄物一起进入水体，构成养殖废水 最主要的污染物来源。除此之外，养殖系统的特性、养殖种类、饲料的质量和 第一章引言 管理等因素都会对污水排放的数量和质量产生影响。 在水产养殖过程中，判断水质的好坏通常用溶氧、p h 值、氨氮、亚硝酸盐、 有机物、总悬浮颗粒物等指标来表示。 1 2 ，1p h 值 p h 值是水质的重要指标。淡水养殖p h 值一般控制在6 5 - 9 0 之间，海水养 殖p h 值一般控制在7 5 8 5 之间。p h 值过高或过低，对水产养殖动物都有直接 的损害，甚至会造成死亡。 1 2 2 溶解氧 溶解氧( d i s s o l v e do x y g e n ，d o ) 是水产养殖动物的生命要素。水产养殖动物 在水中需要呼吸氧气，轻度缺氧时会影响养殖对象的生长发育，严重缺氧时还 会造成水产养殖动物死亡。养殖水域中的溶解氧应保持在5 8m g l ，在养殖的 过程中，通常都要对养殖水体充氧以保证养殖对象的生长需求。渔业水质标准 要求一般在4 5m g l 以上t 4 1 。 1 2 3 总悬浮颗粒物t s s 悬浮颗粒物被认为是高密度循环水养殖生产中最重要的问题之一。悬浮物 直接影响养鱼生产，它可以致死鱼类、降低生长速度、增加死亡率等等。 1 2 4 有机物 养殖水体中的有机物主要由残饵、浮游生物的代谢产物及养殖动物的排泄 物分解产生。有机物在浓度不高及溶解氧充分的情况下，对鱼类的生长影响不 大。当水体中有机物含量过高时，常导致水质恶化，鱼类生长缓慢甚至死亡。 养殖水中的有机物常用化学需氧量( c o d ) 和生化需氧量( b o d ) 来表示。化 学需氧量( c o d ) 是环境水质标准的主要监测指标之一，它反映了水体受还原性 物质污染的程度。由于有机物是主要的还原性污染物，c o d 指标可作为衡量水 质受有机物污染程度的综合标志，是水质监测的基本综合指标。 2 第一章引言 1 2 5 氨氮 氨是一种有刺激性的气态碱性化合物，是水生动物蛋白质代谢的重要终产 物。水中浓度过高的氨对鱼虾体内酶的催化作用和细胞膜的稳定性产生严重影 响，并破坏排泄系统和渗透平衡。随着养殖数量的增加，养殖水体中总有效氮 也会增加，其主要来自残饵、排泄物、粪便等。氨氮在水体中以非离子态和离 子态两种形式存在。非离子态氨对养殖生物的毒性较强。非离子态氨通过生物 表面渗入机体内，因其不具有电荷，具有较高的脂溶性，从环境中易以扩散形 式进入水生动物血液转换成n h 4 + 一n ，并释放o i t ，随着血液p h 的升高，对酶 水解反应和膜稳定性产生明显影响，表现出呼吸困难、不摄食、抵抗力下降等 现象导致养殖生物大批死亡p j 。 1 2 6 亚硝酸盐 亚硝酸盐是由氨转变而来的，由亚硝化细菌转化完成，其转化时间较短。 亚硝酸盐又通过硝化细菌被转变为硝酸盐，转化时间较长。天然水环境中亚硝 酸盐的浓度是非常低的，在集约化养殖过程中，由于硝化细菌活性失调或脱氮 作用过程的不平衡，都可能引起水中亚硝酸盐的过量产生。一般认为，养殖水 体中亚硝酸盐含量( 以氮计) 低于0 1m g l 时，对鱼类不会造成损害；含量达到 0 1 o 5m g l 时，就会产生中毒症状：含量高于o 5m g l 时，中毒症状明显加重， 某些器官功能会出现衰竭，严重时导致死亡1 6 j 。 在这些评价指标中，氨氮和亚硝态氮的控制尤为突出，他们是养殖水体化 合态氮的两种存在形式，对动物均有较大的毒性。在集约化养殖中，氨氮、亚 硝酸盐污染已成为制约水产养殖环境的最主要因素。 在实际生产过程中，养殖废水并不是某个单一指标的作用，而是多个指标 的协同作用。因此，在水产养殖中要同时检测和控制多项水质指标，必要时采 取一定的措施来保证水生动物的生长与繁殖。 第三节微生物制剂在水产养殖中的作用 2 0 世纪6 0 年代，h i d u 首先发现有效力细菌可以改善养殖环境，促进动物 第一章引言 生长。微生物在水产养殖环境中的生物修复作用主要是利用微生物( 细菌、真菌、 酵母菌或提取物) 对环境污染物的吸收、代谢、降解等功能，在环境中对污染物 的降解起催化作用，从而去除或消除环境污染的一个受控或自发的过程。 因为微生物可以明显改善水质，增加溶氧，降低氨氮与亚硝酸氮，抑制有 害微生物的繁殖，降解有机物，同时具有成本低、收效大等优点，各国学者开 始研发以微生物为主的制剂，将其用于水产养殖中改善水环境，防治水生动物 的病害。 1 3 1 微生物制剂的类型 微生物制剂主要有两大类，即单一型制剂和复合型制剂。 1 3 1 1 单一型制剂 单一型制剂是利用单一的菌株作用于水处理中。水质净化的单一型微生物 制剂有光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 、乳酸菌类( l a c t i ca c i db a c t e r i a ) 、芽 孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 、酵母菌( y e a s t s ) 、中间气单胞菌( a e r o m m a sm e d i a ) 、 荧光假单胞菌( p s e u d o m o n n a s f l u o r e s c e n s ) 、溶藻胶弧菌( v i b r i o a l g r i n o l y t i c u s ) 、 硝化细菌( n i t r o b a c t e r i a ) 和反硝化细菌( d e n i t r i f y i n g 肋c 纪，砌) 、蛭弧菌 ( b d e l l o v i b r i o b a c t e r i o v o r u s ) 等f 7 j 。2 0 世纪7 0 年代日本学者小林正泰等人，发 现光合细菌在鳗鲡、真鲷、对虾、河豚养殖中应用，对提高鱼苗存活率、促进 生长发育、增进体色等方面都有显著的作用，并且在防治鳗鲡水霉病、赤霉病、 对虾霉菌病、真鲷擦伤病有较好的疗效1 3 】。此后，多个国家开始应用微生物来改 善和治理养殖水环境，并取得了显著效果。 1 3 1 2 复合型制剂 复合型制剂由多株单一菌株组合而成，如美国a m 公司开发a l k e n c l e a r f l a ( 美菌方) ，用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等多种 微生物制成复合菌剂来处理环境污染取得较好效果【刀。2 0 世纪8 0 年代日本学者 研制出e m 微生物复合制剂，主要由光合细菌、乳酸菌、放线菌、酵母菌等具 有不同生理特性的多种菌群组成，在分解有机物、改善生态环境、促进生长发 育和防治病害方面有一定效果瞵j 。 4 第一章引言 1 3 2 微生物制剂的作用机理 微生物制剂的作用机理尚未得到系统的研究，综合近年来的研究成果，主 要有几种可能：( 1 ) 在水体中或养殖生物体内产生抑制致病菌生长的物质，竞 争性地排斥病原菌；( 2 ) 通过提供重要的营养物加强养殖生物体的营养；( 3 ) 通过提供重要的胞外酶类加强养殖生物体的消化作用；( 4 ) 有益细菌直接吸收 或降解水体中的有机物质或有毒物质从而改善养殖水体的水质f 9 1 。 1 3 3 微生物制剂的优点 微生物制剂产品及其菌种具有以下特征：( 1 ) 对养殖动物无毒害作用，并 且无污染、无残留；( 2 ) 能降解水体中的有害物质，并促进养殖水体微生态平 衡；( 3 ) 菌种具有稳定的生物学、遗传学特性；( 4 ) 菌种生长快，适用大规模 工业生产，能在储存保藏条件下较长时间地保持稳定和维持活力；( 5 ) 菌株抗 逆性强，适应各种水产养殖环境，在养殖水体内仍大量保持有活力的活菌。【】o 】 1 3 4 微生物制剂在我国的应用 我国在应用微生态制剂净化养殖水体方面的研究起步较晚，但发展较为迅 速。中国科学院水生生物研究所、黄海水产研究所等单位先后研制开发了包括 光合细菌、芽孢杆菌等在内的一系列微生物水质调节剂产品。在这些产品所用 的菌种中，光合细菌应用的较为广泛。 1 3 4 1 光合细菌在养殖水中的作用 光合细菌是光合成原核生物的一类，为一群能在厌氧光照或好氧黑暗条件 下利用有机物作供氧体兼碳源，进行不放氧光合作用的细菌。它分布广泛，几 乎遍布于土壤、泥炭、沼泽、淡水、海水、水生植物根系。光合细菌的应用广 泛，在环保、种植业、禽畜业、食品轻工业、新能源开发等方面都有重要用途。 在水产养殖上，光合细菌能在厌氧或好氧条件下，以水中的有机物作为营养进 行自身繁殖，并能迅速分解利用水中的氨态氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质， 通过生物转化，合成无毒无副作用且富含各类营养物质的菌体蛋白，不仅改善 和净化了养殖水体水质，还间接为养殖动物提供了高质量的饵料【l 。此外，光 5 第一章引言 合细菌还富含多种蛋白质、维生素、叶酸、生物素等，可刺激动物免疫系统， 促进胃肠道内的有益菌生长繁殖，增强消化和抗病能力，促进生长。 ( 1 ) 养殖水净化剂 养殖水中使用光合细菌能有效降低养殖水体c o d ，降低水体n h 4 + - n 、h 2 s 等有害物质的浓度，增加水体溶氧量，从而改善了水环境。其净水效果根据使 用光合细菌的种类、形式、浓度以及水质具体状况不同而存在差异。 陈秀为在模拟养殖水环境中以光合细菌改善水质后测定水中氨氮、c o d 、 溶解氧( d o ) 的变化情况，结果表明，光合细菌对于养殖水环境中氨氮的降解， 化学耗氧量降低和溶解氧增加均具有一定作用f l 刀。沈锦玉等在2 0 0 4 年利用光合 细菌改善池塘水质及对鱼类非特异性免疫和促生长作用，并测定了光合细菌对 池塘水质( 溶氧、氨氮、亚硝态氮、c o d ) 、透明度、p h 及异氧细菌总数的影响； 光合细菌添加于饲料后对鱼血清中溶菌酶活力及鱼生长的影响，同时进行了光 合细菌的大田应用试验。结果表明，光合细菌对池塘水的溶解氧、p h 没有影响； 而降低了水中氨氮、亚硝态氮、有机物( c o d ) ：水的透明度明显升高，异氧细菌 的总数比原来下降5 0 1 1 3 1 。王兰用从养虾池底分离得到的4 株光合细菌混合培 养后处理养虾池水，结果表明，光合细菌可以有效分解底泥中的污染物，第四 天水体中的c o d 和氨氮的去除率分别达到7 2 5 9 和8 9 2 i i 训。 ( 2 ) 优质饵料 光合细菌由于可起到补充营养、改善代谢机能、提高饵料转化率的作用， 因此，用其作为鱼虾贝类幼体开口饵料时，能大大提高幼体成活率。将光合细 菌作为辅助饵料加入到饲料中，可有效提高饲料效率。 陈军在鱼种培养中应用光合细菌，结果发现，主养黄颡鱼池塘，黄颡鱼规 格比对照组池塘高1 5 尾，产量提高2 4k g 亩，饵料系数降低o 7 3 ，成活率提 高3 3 4 i ”】。张清海在鲍育种中应用光合细菌，既减少了能源费用，又使得鲍苗 长势良好【1 6 1 。张道南等利用沼泽红假单胞菌投喂孵化后的金鱼苗，1 5d 后，鱼 苗平均质量比对照组增加了4 4 4 蜊 j 。 ( 3 ) 预防和治疗疾病 光合细菌对细菌病、真菌病都有较好的防治效果。有研究表明，荚膜红假 单胞细菌细胞壁中所含的多糖类为广谱的非特异性免疫激活剂，可以增强鱼的 体质和抗病力，起到预防疾病的作用。 福州大学的徐珊楠等人的研究表明荚膜红假单胞菌、球形红假单胞菌、胶 6 第一章引言 质红假单胞菌和沼泽红假单胞菌的代谢产物对4 8 株病原菌( 包括水产养殖病原 菌、人体条件致病菌和植物病原菌真菌等) 的拮抗试验表明，4 株紫色非硫光合 细菌的代谢产物中含有广谱抑菌物质，对2 9 株革兰氏阳性和革兰氏阴性病原细 菌均有较好的抑制作用【l 引。 1 3 4 2 芽孢杆菌在养殖水中的应用 近年来，芽孢杆菌在改善养殖水体环境质量，提高养殖水生动物免疫力， 降低发病率，促进动物生长等方面引起了水产界的广泛关注。芽孢杆菌，革兰 氏染色阳性，是鱼池中普遍存在的一类好气性细菌，多属芽孢杆菌属，能分泌 出活性强的多种酶类，在其生命过程中又能以孢子体形式存在，易于生产和保 存，作为饲料微生态添加剂和水体微生态调控剂都有着广阔的应用前景i l 引。芽 孢杆菌的作用机理是可以产生大量的胞外酶( 蛋白酶、淀粉酶和半纤维素水解酶 等) ，这些酶类可以促进养殖生物体对饲料的消化和吸收，提高饲料的利用率， 从而促进动物生长，亦可把水中及底泥中的蛋白质、淀粉、脂肪等有机物分解、 吸收，有降低水体富营养化和清除底泥的作用，芽孢杆菌还可以通过消灭或减 少病原体来改善水质【2 0 l 。 ( 1 ) 减少病害的发生 近年来，芽孢杆菌被人们看作益生菌的代表，其主要因为芽孢杆菌既可以 抑制致病菌的增加，又可以提高养殖动物的免疫力，增强对疾病的抵抗能力。 芽孢杆菌通过营养竞争、空间竞争或分泌抗生素、细菌素等抑制其他微生物生 长，当芽孢杆菌在消化道内形成优势菌群时，就可以抑制消化道粘附的病原菌， 从而排除或控制潜在的病原体。 李卓佳分析比较施用芽孢杆菌制剂的虾池和没有施用任何有益菌的虾池在 养殖后期不同空间的微生物群落结构和代谢功能的差异。结果表明，施用了芽 孢杆菌的虾池，芽孢杆菌在虾池表泥和底泥形成可培养细菌的优势菌属，表泥 和底泥总异养细菌数量增加而水体总异养细菌数量降低，水体s h a n n o n 指数、 s i m p s o n 指数和m c i n t o s h 指数以及底泥m c i n t o s h 指数显著升高，虾池水体、表 泥和底泥微生物群落代谢功能均有不同程度地升高。这说明芽孢杆菌可通过改 善环境微生物群落的生物量和结构来改善整个虾池的水质环境1 2 。 ( 2 ) 改善养殖环境 芽孢杆菌可降解和转化养殖过程中产生的残饵、动植物的残体及代谢排泄 第一章引言 物累积下来的许多有毒有害物质，减少或消除氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等有害 物质，改善水质。 孙冬岩等对枯草芽孢杆菌对水质净化作用的研究结果证实，枯草芽孢杆菌 有明显降低亚硝酸盐的作用，能有效改善水体各项水化学指标，起到改善水质 的作用【列。谢航在研究地衣芽孢杆菌降解水产养殖中的残饵中发现，在适宜的 条件下，地衣芽孢杆菌对饲料中的蛋白质和淀粉的去除率可达到6 0 团j 。 ( 3 ) 促进水生动物的生长 芽孢杆菌可以在动物消化道内生长、繁殖和活动，并能产生多种营养物质， 如维生素、氨基酸、短链脂肪酸、促生长因子等，参与动物体的新陈代谢。有 的芽孢杆菌( 如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等) 还可以产生 消化酶，消化分解水生动物无法利用的食物成分。 刘波等在饲料中添加地衣芽孢杆菌投喂异育银鲫，结果表明，添加2 0 0m g k g 和3 0 0m g k g 地衣芽孢杆菌均显著提高了食糜蛋白酶、淀粉酶活性和肠道组织 蛋白酶活性以及鱼体增重率和干物质、粗蛋白及磷的表观消化率并降低了饵料 系数1 2 4 1 。 1 3 4 3 混合菌株的协同作用 依据互生关系，两种或两种以上可以单独生活的微生物，当他们生活在一 起时，通过各自的代谢活动而有利于对方或偏利于一方的一种生活方式。因此， 单菌制剂的使用效果可能不及具有互生关系( 或只要不具拮抗关系即可) 的多菌 联合制剂的使用效果。徐光龙等在南昌、吉安等地推广应用配制的复合微生态 制剂( 在光合菌液中加入适量芽孢杆菌液，配成复合微生态制剂) ，结果表明， 该制剂对去除水中有害物质、改善水质、促进鱼体健康发育、抑制有害病菌的 繁殖与耗氧、降低发病率效果显著，养殖鱼类成活率达9 1 以上1 2 引。万海龙将 光合细菌与硝化细菌按比例混合后进行试验，结果证明，其对非离子氨急性毒 性具有解毒作用。在l d 5 0 剂量下作用2 4 小时，8 剂量培养物可以使食蚊鱼死 亡率由5 0 降低到1 0 。在饲料污染亚适状态下能不同程度地促进鱼类生长及 降低死亡率，体长为3 5m n l 的鲤鱼苗在1 5p p m 的浓度下体长增长率为3 2 5 。 同时还具有水质改良和净化作用1 2 6 j 。张克强用两种芽孢杆菌为主导菌，与啤酒 酵母菌混合发酵投加入养殖水体中，对养殖水体中各项水质因子进行控制和处 理，水质各项指标均优于对照池，达到养殖水体良好水质水平。混合培养发酵 8 第一章引言 液效果好于芽孢杆菌单独发酵作用i 2 刀。 微生物制剂能吸收分解水中的氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等有害物质以及鱼 类产生的粪便和残饵，提高养殖水体中的溶氧，调节水体的p h 值，从而达到改 善养殖水体环境的目的。但是游离态的有益微生物在恶劣的环境中很难存活并 繁殖为优势种群，容易被水流冲走、被其它生物所食，因此难以稳定地长期发 挥作用。固定化细胞技术与微生物技术的结合，可以很好地解决这一问题，将 利用微生物进行水处理的应用提高到了一个新的水平。 第四节固定化微生物技术及其在养殖水处理的应用 1 9 5 9 年，由h a t t o r i 等人首次实现了大肠杆菌的固定化，此后该技术发展迅 速。2 0 世纪7 0 年代以后，由于水污染严重，迫切需要一种高效、快速且能连续 处理的废水处理技术，微生物固定化技术从而在污水处理中得到广泛应用，效 果较好，至今已经形成了较为完备的理论和方法。 1 4 1 固定化技术的优点 固定化微生物技术是用化学或物理的手段将游离细胞或酶定位于限定的空 间领域，并使其保持活性，反复利用的方法。固定化微生物技术不仅有利于优 势菌株的固定，提高难降解有机物的降解率，还能在局部空间内维持高浓度的 生物量，具有反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物容易分离、处 理设备小型化、稳定性强、丧失活性可恢复等优点。 1 4 2 固定化方法的类型 固定化方法按照固定载体与作用方式不同，可分为5 种类型：吸附法、交 联法、共价键结合法、包埋法和无载体固定化法。 1 4 2 1 吸附法 所谓吸附法就是依据带电荷的细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力 的作用，使细胞固定在载体表面和内部形成生物膜，吸附法又可分为物理吸附 法和离子吸附法。物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、 9 第一章引言 多孔玻璃、碎石、卵石、铅炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表 面使其固定化。离子吸附是利用微生物在解离状态下离子键作用而固定于带有 相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有d e a e 纤维素、c m 纤维素等。 该方法简单、经济，但吸附剂载体与生物物质之间作用力为范德华力、氢键、 静电力等，结合较弱，在p h 值、温度或离子强度变化的情况下会使固定化不稳 定，而且在很多情况下，吸附剂对酶的非特异性吸附会引起蛋白质失活，吸附 法固定生物物质量相对于其他固定化方法较低。 1 4 2 2 交联法 交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶或细胞发生分子间交 联而得到固定的一种方法。该方法中的交联剂与酶结合常会引起蛋白质高级结 构的改变，导致酶的失活，因此常添加一定量的辅助蛋白提高固定化酶的稳定 性。除此之外，采用的交联剂大都比较昂贵，因此应用受到一定的限制。常用 交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺等。 1 4 2 3 共价法 共价法就是使非水溶性载体与酶或细胞表面的功能基团以共价键的形式结 合。用共价法固定酶，载体与酶的结合牢固、半衰期长，但常因反应剧烈而引 起酶蛋白结构发生变化。常用于共价法的功能基团有氨基、羧基、巯基、羟基、 酚基等。 1 4 2 4 无载体固定化法 细胞絮凝形成颗粒的一种固定化细胞的方法。这种方法操作简单，细胞的 生理和生态环境不受外来物质的干扰，颗粒整体活性好，但内部结构疏松，结 合不牢固。常用的絮凝剂有p e g 等。 1 4 2 5 包埋法 包理法是将微生物菌体包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内，小分子的底物 和产物可以自由出入，而微生物却不会漏出。常用的包埋法固定微生物的载体 材料有天然高分子多糖类的海藻酸钙凝胶和卡拉胶、聚乙烯醇( p v a ) 、聚丙烯 酞胺( a c a m ) 等。其中，天然高分子凝胶对微生物无毒，传质阻力小，但结 合强度小；有机合成高分子凝胶强度高，影响微生物生物活性，同时传质阻力 1 0 第一章引言 大。 固定化细胞技术被应用到水产养殖中，多采用吸附和包埋的方法。吸附法 由于所能固定的生物量少、结合力弱、不稳定、蛋白易失活等缺点而在以固定 化微生物进行水处理的应用中受到了一定的限制。包埋法是使细胞扩散进入多 孔性载体内部，或利用高聚物在形成凝胶时将细胞包埋在其内部。包埋法是目 前研究最广泛的固定化方法，该法对微生物活性影响小，可将微生物锁定在特 定的高分子网络中，因此制作的固定化微生物小球的强度高。根据所用材料和 方法的不同包埋法又可分为凝胶包埋法和微胶囊法两种i 蹦】。 凝胶包埋法是利用单体聚合或高分子物质形成网格状凝胶，酶和细胞镶嵌 在凝胶的网格中。常用的载体有聚乙烯醇( p v a ) 、丙烯酰胺( a c a m ) 、聚乙烯 乙二醇( p e g ) 、琼脂、海藻酸钙、卡拉胶等。海藻酸钠( c 6 h 7 0 6 n a ) 是近年来最 为常用的包埋载体，具备良好的生物相容性。其中海藻酸作为一种高分子电介 质，其一价盐( n a 、k ) 为水溶性盐，而二价以上的盐( c a ，a 1 ) 为水不溶性盐， 因而可形成耐热的凝胶或被膜，这是海藻酸钠经c a c l 2 溶液钙化处理后形成固定 化凝胶的重要依据。同时，海藻酸钠易与蛋白质、明胶等多种物质共溶，并可 与细胞混合成均匀的悬浮液，使凝胶具有微生物分布的均匀性。海藻酸钙无生 物毒性，传质性能好，但强度较低。海藻酸钠固定化小球在有高浓度磷酸盐、 m 孑+ 、l ( + 等物质存在时易碎、易溶解【2 9 1 。用聚乙烯醇( p v a ) 固定化后的细胞活 性小，存活时间比海藻酸钠包埋法长。但p v a 凝胶硬化所需时间较长，固定化 要求的条件复杂。p v a 凝胶存在着难以制成球状或成球难以控制的缺点。在p v a 凝胶固定过程中添加多糖类( 海藻酸钠等) 可以克服这一缺点。海藻酸钠的加入 可改善颗粒的表面性能，成球容易，并减少粘连，且由于海藻酸钠的混入还可 提高颗粒的传质性能。 采用凝胶包埋常会遇到一些问题，细胞常常会从凝胶的网格泄漏到培养基 中，由于氧气和营养物质在凝胶中传质限制，细胞只能在凝胶表面生长。同时， 凝胶的网格孔径限制了细胞的生长，由于机械强度的原因，凝胶中最多包埋凝 胶体积2 5 的细胞。 微胶囊技术是采用成膜材料把固体、液体或气体固定在微小空间从而实现 特定释放或功能的技术。固定在胶囊内部的物质称为囊芯，外部的成膜材料称 为囊材，其粒径一般从几个微米到几个毫米。其优点是可以控制释放，增加物 质稳定性，降低物质毒性，囊心空间阻隔小等1 3 。 用作养殖水处理中 质稳定，易成球，耐降 营养物的流入和代谢物 1 4 3 共固定化技术 固定化混合细胞处 具有比单一细菌更高、 合细菌对环境的适应性 性高、性能稳定等特点 布一p v a 复合载体包埋的固定化混合细菌细胞应用于养殖池水质的净化。实验结 果表明：6 0 的光合细菌与4 0 的蛋白质降解菌混合时，除氨效果最强，其除氨 活性比单株光合细菌高9 。试验中还发现用含3 的沸石粉的无纺布一p v a 复合 载体包埋混合菌株在虾池进行了2 8 0 升水体的野外实验，n h 3 n 及c o d 分别下 降了8 0 2 和7 6 1 t 3 1 1 。 1 4 4 固定化技术在水产养殖中的应用 近年来国内外学者对固定化技术在养殖废水中的应用进行了大量的研究工 作。1 9 9 9 年h i s a s h in a g a d o m i 在p v a 包埋光合细菌去除养殖水中氨氮的研究中 发现，用海藻酸钠和p v a 包埋的r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e ss 对鲤鱼养殖水中的 c o d 有很好的去除效果【3 2 】。b a l d e r s t o n 等在高密度、闭合式鲑鱼养殖池中，利 用固定化反硝化细菌，有效地去除了养殖废水中的硝酸盐p 引。郑耀通、胡开辉 在p v a 和海藻酸钠凝胶中添加了s i 0 2 和c a c 0 3 不仅增加了载体的稳定性，提高 了养殖水氨氮和c o d 的去除率，而且饲养的鱼