（微生物学专业论文）羊肚菌胞外多糖与胞内硒多糖抗氧化活性研究.pdf

一 j 广 j 符号说明 b h t ：2 , 6 一d i - t e r t b u t y l - 4 - m e t h y l p h e n o l ，2 ，6 二叔丁基对甲酚 d t n b ：5 ，5 一d i t h i o b i s 一( 2 一n i t r o b e n z o i ca c i d ) ，5 ，5 - - 硫硝基苯甲酸 k d p p h ：2 , 2 一d i p h e n y l 一1 - p i c r y l h y d r a z y l ，二苯基苦基苯肼自由基 ie p s ：e x t r a c e l l u l a p 。l y s a c c h a r i d e s ，胞外多糖 g s h ：g l u t a t h i o n e ，谷胱甘肽 g s h p x ：g l u t a t h i o n ep e r o x i d s a d e ，谷胱甘肽过氧化物酶 m d a ：m a l o n d i a l d e h y d e ，丙二醛 m i p ：i n - p o l y s a c c h a r i d eo fm e s c u l e n t a , 胞内多糖 m i p 一1 ：i n p o l y s a c c h a r i d eo f m e s c u l e n t a , 去杂质后的m i p n b t ：n i t r o t e t r a z o l i u mb l u ec h l o r i d e ，氮蓝四唑 o d ：o p t i c a ld e n s i t y , 光密度 p b ：p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n ，p b 设计 p d a ：p o t a t od e x t r o s ea g e r ，马铃薯培养基 r s m ：r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ，响应面法 s e - m i p ：s e - p o l y s a c c h a r i d eo f m e s c u l e n t a , 富硒胞内多糖 s e - m i p l ：s e - p o l y s a c c h a r i d eo fm e s c u l e n t a , 去杂质后的s e m i p s o d ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，超氧化物歧化酶 k t b a ：2 - t h i o b a r b i t u r i ca c i d ，2 硫代巴比妥酸 t c a ：t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，三氯乙酸 0 j 户 l k 1 1 2 真菌多糖的提取0 6 1 1 3 真菌多糖的分离纯化0 6 1 1 4 真菌多糖的纯度测定0 7 1 1 5 真菌多糖的结构鉴定0 8 1 1 6 真菌多糖的生物学功能0 8 1 1 7 多糖的构效关系1 3 1 2 真菌硒多糖研究概述1 4 1 2 1 硒多糖的来源1 5 1 2 2 硒多糖的提取及分离纯化1 5 1 2 3 硒多糖的组成结构1 5 1 2 4 硒多糖的生物活性一1 6 1 3 羊肚菌多糖研究概述17 1 4 本研究的目的和意义2 l 2 材料与方法2 2 2 1 供试菌种2 2 2 2 培养基2 2 2 3 主要仪器设备及试剂2 2 2 3 1 主要仪器设备2 2 2 3 2 主要试剂“2 2 2 4 实验方法2 3 2 4 1 羊肚菌的液体深层培养2 3 2 4 2 富硒羊肚菌液体深层培养2 4 2 4 3 菌丝体生物量的测定2 4 2 4 4 羊肚菌多糖( 硒多糖) 的提取及含量测定2 4 2 4 5 多糖( 硒多糖) 的分离2 5 2 4 6 胞外多糖的提取2 7 2 4 7 多糖( 硒多糖) 体外抗氧化活性2 8 2 4 8 多糖的( 硒多糖) 体内抗氧化活性2 9 3 结果与分析3 5 3 1e p s 提取的提取优化3 5 3 1 1 单因素试验3 5 3 1 2p b 试验3 9 3 1 3 响应面法优化4 0 3 2e p s 的体外抗氧化活性4 4 3 2 1e p s 对超氧阴离子自由基0 2 清除作用4 4 3 2 2e p s 对羟基自由基o h 清除作用- 4 5 3 2 3e p s 对d p p h 自由基的清除作用4 6 3 - 2 4e p s 还原能力测定4 6 3 3 硒含量测定4 7 3 4s e m i p 和s e m i p 1 的体外抗氧化活性4 8 3 4 1 清除超氧阴离子自由基o ：作用4 8 3 4 2 清除羟基自由基0 h 作用4 8 3 4 3 清除d p p h 自由基的作用4 9 3 4 4 还原力测定5 0 n 一 ， k 飞 3 5e p s 的体内抗氧化活性5 1 3 5 1 e p s 对小鼠组织和全血s o d 活性的影响5 l 3 5 2 e p s 对小鼠组织和全血g s h p x 活性的影响5 2 3 5 3 e p s 对小鼠组织和全血m d a 含量的影响5 3 3 6s e m i p 和s e m i p l 的体内抗氧化活性5 4 3 6 1 s e - m i ps e - m i p 1 对小鼠组织和全血s o d 活性的影响5 4 3 6 2s e m i ps e m i p 1 对小鼠组织和全血g s h p x 活性的影响5 7 3 6 3s e m i ps e m i p 1 对小鼠组织和全血m d a 含量的影响一6 0 4 讨论6 5 4 1e p s 的提取条件6 5 4 2 羊肚菌对微量元素硒的富集6 5 4 3 多糖含量的测定6 5 4 4 多糖的分离。6 5 4 5 抗氧化能力6 6 4 6 尚待进一步开展的工作6 6 5 结论6 7 参考文献6 8 致谢7 7 攻读硕士学位期间发表论文情况一7 8 i i l l k 山东农业大学硕士学位论文 捅要 羊肚菌( m o r c h e l l ae s c u l e n t a ) 隶属于子囊菌亚f - ( a s c o m y c o t i n a ) ，盘 菌纲( d i s c o m y c e t e s ) ，盘菌目( p e z i z a l e s ) ，羊肚菌科( m o r c h e l l a c e a e ) ，羊肚 菌属( m o r c h e l l a ) 。富含多糖、蛋白质、微量元素、食用纤维和维生素等生 物活性物质。羊肚菌多糖是羊肚菌主要的活性成分之一，具有降血脂、抗 肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等多种药理活性。 硒( s e l e n i u m ) 是人体必需微量元素，缺硒与肿瘤的发生有关，硒对 预防癌症、克山病、大骨节病等有重要作用，并具有延缓衰老，提高机体 免疫力的功能。硒多糖兼有多糖和硒二者的活性，其生物活性普遍高于多 糖和硒，且更易于机体吸收和利用。近年来对多糖和硒活性的研究已经较 为深入，但将多糖与硒有机结合成为硒多糖，国内外的研究尚处于起步阶 段。 本文以羊肚菌为出发菌株，通过单因素试验、p b 试验和响应面试验 等方法确定了羊肚菌胞外多糖最佳提取条件。通过对羊肚菌进行富硒液体 培养，得到了胞内硒多糖，初步分析了其抗氧化能力，得到以下结论： l 、胞外多糖( e x p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) 的最佳提取条件 响应面优化结果为浓缩温度8 4 0 7 ，沉淀时间2 2 1 9h ，沉淀p h8 4 4 ， 此条件下羊肚菌胞外多糖的理论值达5 4 5 l 。考虑到操作方便，将最佳 提取条件调整为：浓缩温度8 4 ，沉淀时间2 2h ，沉淀p h8 4 。在此条件 下，胞外多糖提取量为5 3 6g l ，稍低于理论值5 4 5g l 。 2 、e p s 的体外抗氧化活性 测定了e p s 对二苯基苦基苯肼自由基( d p p h ) 、超氧阴离子自由基( 0 2 。) 和羟自由基( o h ) 的清除能力，同时用普鲁士蓝法测定还原力。结果表明， e p s 有明显抑制0 2 、- o h 和d p p h 自由基的作用，并具有一定的还原力， 呈现量效关系。e p s 对0 2 。、o h 和的d p p h 半数抑制浓度( e c s o ) 分别为l l1 士 4m g l 、1 0 3 士4m g l 和1 8 94 - 8m g l 。 3 、s e m i p 和s e m i p 1 的体外抗氧化活性 通过羊肚菌液体富硒培养得到富硒胞内多糖，即s e m i p 和s e - m i p - l 。 s e m i p 和s e m i p 1 分别是羊肚菌破壁醇沉后硒多糖和去蛋白后硒多糖组 分。利用原子吸收分光光度法测得s e m i p 中硒含量为1 9 7 8r t g g ， 羊肚菌胞外多糖与胞内硒多糖抗氧化活性研究 s e m i p 1 中硒含量为1 2 11 肛g 馆。同样方法，得到羊肚菌的m i p 和m i p 1 组分，作为抗氧化活性测定的阳性对照。 结果表明，s e m i p 和s e m i p 1 均有明显抑制0 2 、o h 和d p p h 自由基 的作用，并具有一定的还原力，呈现量效关系。s e m i p 和s e m i p 1 对0 2 。的 e c s o 分别为1 1 74 - 6m g l 和1 3 24 - 7m g l 。对- o h 的e c s o 值分别为1 4 2 - 4 - 8 m g l 和2 0 14 - 8m g l 。对d p p h 的e c s o 值分别为1 3 14 - 4m g l 和1 3 6 士5 m g l 。 4 、e p s 的体内抗氧化活性 通过测定小鼠心、肝、脾、肾组织和全血的脂质过氧化物含量、谷胱 甘肽过氧化物酶及超氧化物歧化酶的活性，观察了e p s 对机体各组织及全 血抗氧化能力的影响。结果表明，e p s f l 邑提高小鼠组织及全血超氧化物歧 化酶( s o d ) 和谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 活性，并能降低丙二醛 ( m d a ) 的含量，提高了机体抗活性氧损伤的能力，为防止或减轻脂质 过氧化损伤提供了试验依据。 5 、s e m i p 和s e m 口1 的体内抗氧化活性 测定了小鼠血、心、肝、脾、肾组织中m d a 含量、s o d 和g s h p x 酶活性。结果表明，s e m i p 可显著或极显著地提高s o d 和g s h p x 活性， 并降低m d a 含量；s e m i p 1 可显著或极显著降低血清及各组织中m d a 含量，但对s o d 和g s h p x 活性无显著影响。s e m i p 和s e m i p 1 均能 有效地提高机体组织抗氧化能力，防止组织脂质的过氧化损伤。 试验结果表明，羊肚菌胞外多糖和胞内硒多糖均具有较强的体内和体 外抗氧化能力，为羊肚菌多糖的抗氧化机制及构效关系的深入研究奠定了 基础。 关键词：羊肚菌；胞外多糖；硒多糖；抗氧化 2 j 夕 。 j m o r c h e l l ae s c u l e n t a ，w h i c h b e l o n g s t o a s c o m y c o t i n a , d i s c o m y c e t e s , p e z i z a 彪s , m o r c h e l l a c e a e , m o r c h e l l a , i san u t r i t i o n a la n dm e d i c i n a lm u s h r o o m w i t hr e f r e s h i n gf r a g r a n c e i tc o n t a i n sm a n yb i o l o g i c a la c t i v em a t e r i a l s ，s u c ha s p o l y s a c c h a r i d e s ，p r o t e i n ，t r a c ee l e m e n t s ，d i e t a r yf i b e ra n dv i t a m i n s ，e r e 1 1 1 e p o l y s a c c h a r i d e sf r o m 肱e s c u l e n t ah a dt h ef u n c t i o n so fa n t i t u m o u r f a t i g u e r e s i s t a n c e ，a n t i v i r u sa n di m m u n o r e g u l a t i o n s e l e n i u mi sa ne s s e n t i a l 位a c ee l e m e n to fh u m a nb e i n g ，a n dp a r t i c i p a t e si n s y n t h e s i so fe n z y m e sa n dp r o t e c t st h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fb i o m e m b r a n e f r o mo v e r o x i d a t i o na n dd a m a g e s e - d e f i c i e n c yc a nc a u s ea b o u t4 0d i s e a s e s a n i m a l s s e l e n i u m p o l y s a c c h a r i d e ( s e - p o l y s a c c h a r i d e ) h a st h e e f f e c t so f s e l e n i u ma n dp o l y s a c c h a r i d e t h e r ea r ef e w e rr e p o r t sa b o u tt h eo r g a n i c c o m b i n a t i o no fp o l y s a c c h a r i d ea n ds e l e n i u mi n t os e l e n o - p o l y s a c c h a r i d e i nt h i sp a p e r ，t h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n sf o rme s c u l e n t ae x o p o l y s a c c h a r i d e ( e p s ) i ns u b m e r g e dc u l t u r ew e r eo p t i m i z e do nt h eb a s i so ft h es i n g l e f a c t o r t e s t s ，p l a c k e r - b u r m a n ( p b ) d e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yf r s m ) t h e 跏v i t r oa n di nv i v oa n t i o x i a n ta c t i v i t i e so fs e - p o l y s a c c h a r i d ea n de p s w e r ee v a l n a t e d 1 o p t i m i z a t i o ne p se x t r a c t i o n t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sf o re p sp r o d u c t i o nw e r ec o n c e n t r a t i o n t e m p e r a t u r e8 4 0 7o c ，p r e c i p i t a t i o nt i m e2 2 19h ，a n dp h8 4 4 ，w h i l et h e p r o d u c t i o no fe p sw a sp r e d i c t e db e 5 4 5g l i nv i e wo ft h e o p e r a t i n g c o n v e n i e n c e ，t h eo p t i m a le x t r a c t i o np a r a m e t e r sw e r ed e t e r m i n e d t ob e c o n c e n t r a t i o nt e m p e r a t u r e8 4o c ，p r e c i p i t a t i o nt i m e2 2ha n dp h8 4 ，a n dt h e p r e d i c t e d e p sp r o d u c t i o nw a s5 3 6 g l ，s l i g h t l y l o w e rt h a nt h a to ft h e m a x i m u mp r e d i c t e dv a l u e 2 a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f e p s nv i t r o r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee p sh a ds i g n i f i c a n t l ys c a v e n g i n ge f f e c t so n s u p e r o x i d ea n i o n ，h y d r o x y la n dd p p hr a d i c a l sa n dr e d u c i n gp o w e r t h ee c s 0 v a l u e so fe p ss c a v e n g i n gs u p e r o x i d ea n i o n ，h y d r o x y la n dd p p hr a d i c a l sw e r e 3 羊肚茵胞外多糖与胞内硒多糖抗氧化活性研究 1 ll4 - 4m g l ，1 0 34 - 4m e r l e ，a n d1 8 9 士8m g l ，r e s p e c t i v e l y 3 a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fs e - m i pa n ds e m i p li nv i t r o s e - m i pa n ds e - m i p - 1w e r et w oc o m p o n e n t so fme s c u l e n t am y c e l i a ，a n d o b t a i n e db ya l c o h o ls e d i m e n t i n ga n dp r o t e i nr e m o v i n g ，r e s p e c t i v e l y t h e s e l e n i u mc o n t e n t so fs e m i pa n ds e - m i p - 1w e r e19 7 8 t g ga n d12 1 lp g ， r e p s e c t i v e l y m i pa n dm i p 1o fm e s c u l e n t am y c e l i aw e r eo b t a i n e da c c o r d i n g t ot h ef o r m e rm e t h o d ，u s i n gp o s i t i v ec o n t r o l so fa n t i o x i d a n ta c t i v i t ya s s s yi n v i t r o t h es e - m i pa n ds e - m i p 1h a ds i g n i f i c a n t l y s c a v e n g i n g e f f e c t so n s u p e r o x i d ea n i o n ，h y d r o x y l ，d p p hr a d i c a la n dr e d u c i n gp o w e r t h ee c s o v a l u e so fs e - m i ps c a v e n g i n gs u p e r o x i d ea n i o n ，h y d r o x y la n dd p p hr a d i c a l s w e r e11 74 - 6m g l ，1 4 24 - 8m g l ，a n d1 3l 士4m g r l ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h e e c s 0v a l u e so fs e m i p 1w e r e1 3 24 - 7m g l ，2 0 14 - 8m g l ，a n d1 3 64 - 5m g l ， r e s p e c t i v e l y 4 a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so f e p s nv i v o t h ee f f e c to fe p so na n t i o x i d a t i o nc a p a c i t yo fm i c ew a so b s e r v e db y m e a s u r i n gt h es u p e r o x i d ed i s m u t a s ea c t i v i t y , g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s ea c t i v i t y , a n dt h e l i p o p e r o x i d ec o n t e n t 1 1 1 e nv i v or e s u l t ss h o w e dt h a te p sc o u l d s i g n i f i c a n t l y e l e v a t et h e a c t i v i t y o fs u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) a n d g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s ea c t i v i t y ( g s h p x ) ，a n dd e c r e a s et h em d a c o n t e n ti n m i c eb l o o d 5 a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fs e m i pa n ds e m i p 1i nv i v o n l ei nv i v oa n t i o x i d a n te f f e c t so fs e m i pa n ds e m i p 1o ns o da n d g s h p xa c t i v i t ya n dm d ac o n t e n ti nt h eb l o o d ，h e a r t ，l i v e r ，k i d n e y ，s p l e e no f m i c ew e r ei n v e s t i g a t e r e s u l t ss h o w e dt h a ts e - m i pc o u l dr e m a r k a b l yi n c r e a s e t h ea c t i v i t yo fs o da n dg s h p x ，d e c r e a s et h em d ac o n t e n t s e m i p - lc o u l d s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et h em d ac n t e n t , h a v i n gn oo b v i o u si n f l u e n c eo nt h e a c t i v i t yo fs o da n dg s h p x t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ee p sa n ds e - p o l y s a c c h a r i d eo fme s c u l e n m h a ds i g n i f i c a n t l ya n t i o x i d a n ta c t i v i t yi nv i v oa n di nv i t r o ，w h i c hc o u l db eu s e d 4 0 p 5 羊肚菌胞外多糖与胞内硒多糖抗氧化活性研究 1 引言 1 1 真菌多糖概述 1 1 1 在生物学中的重要地位 真菌被作为药物在我国已有悠久的历史。明代李时珍的本草纲目 记载了2 0 多种真菌的药效( 闳三弟，1 9 9 7 ；陈金烟等，2 0 0 2 ) 。药用真菌 是指能治疗疾病、具有药用价值的一类真菌，即在菌丝体、子实体、菌核 或孢子中能产生氨基酸、维生素、多糖、甙类、生物碱、甾醇类、黄酮类 及抗生素等多种物质，对人体有保健、对疾病有预防、抑制或治疗作用的 真菌( 李林玉等，2 0 0 7 ) 。现已证明，各种食( 药) 用真菌的活性成分主要 在于其中的真菌多糖( 魏天儒等，2 0 0 7 ) 。真菌多糖系真菌中分离出的由 l o 个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，是从真菌子实体、 菌丝体、发酵液中分离出的，能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老 的一类活性多糖( 朱建华等，2 0 0 5 ) 。药用真菌多糖是一种能够增强人体 免疫功能的生物活性物质，在国际上被成为生物反应调节) 菁u ( b i o l o g i e a l r e s p o n s em o d i f i e r ，b r m ) 。 2 0 世纪7 0 年代以来，随着免疫物质、生物膜以及多种生物活性物质 的研究进展表明，糖类不仅是所有生命有机体的重要能量来源以及维持生 命所必须的结构材料( 周世文等，1 9 9 4 ) ，更重要的是它参与了生命科学 中细胞的各种活动，如参与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间 物质的运输、癌症的诊断与治疗，细胞的分裂和分化、细胞的生长和衰老 等。由于食药用真菌多糖及其复合物的多种多样生物活性功能以及在功能 食品和临床上的广泛使用，使其成为近年生命科学、生物学、医药和食品 科学等研究领域的热点之一( 张彦民等，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 真菌多糖的提取 提取多糖时一般先根据原料的差别及对多糖品质要求的不同而采用 不同的方法。常用的提取方法有热水浸提法、碱提法、酸提法及酶法等， 其中，热水浸提法由于具有多糖溶出率较高、有机溶剂使用量少、对多糖 活性破坏小、操作简便和节约等优点，成为最为常见的使用方法( 王斌， 2 0 0 5 ) 。近年来，微波和超声波法亦用于多糖的提取。 1 1 3 真菌多糖的分离纯化 6 o p l k 山东农业大学硕士学位论文 真菌多糖的分离纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖，方法有很 多，目前实验室中对多糖进行分级时，常将粗多糖经色谱柱洗脱，按洗脱 曲线的不同峰收集不同的组分，从而得到各个均一多糖成分( 蔡孟深等， 2 0 0 7 ) 。 1 3 1 1 分级沉淀法：利用不同分子大小和溶解度不同而分离，常用的有 季铵盐沉淀法和有机溶剂沉淀法。季铵盐沉淀法：季铵盐及其氢氧化物 是一类乳化剂，可与酸性糖形成不容性沉淀，常用于酸性多糖的分离。常 用的季铵盐是十六烷基三甲基胺溴化物( c t a b ) 及其氢氧化物( c t a - o h ) 和十六烷基吡啶氢氧化物( c p o h ) 。有机溶剂沉淀法：适合于分离各 种溶解度相差较大的多糖。根据各种多糖在不同浓度乙醇或丙酮等有机溶 剂中溶解度不同进行分离，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉 淀后，直到测得的物理常数恒定( 最常用的是比旋光度测定或电泳检查) 。 1 3 1 2 色谱分离法：离子交换色谱：根据糖类在纸色谱上具有很好分 离效果这一事实，将纤维素改性，使离子交换和纤维色谱结合起来制成一 系列离子交换纤维素，用于多糖的分离效果良好。常用的阳离子交换纤维 素有c m c e l l u l o s e 、p c e l l u l o s e 、s e c e l l u l o s e 、s m c e l l u l o s e ；阴离子交换 纤维素有d e a e c e l l u l o s e 、t e a e c e l l u l o s e 等。其中，阳离子交换纤维素 特别适用于分离酸性、中性和黏性多糖。纤维素柱色谱：纤维素柱色谱 对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又有分离色谱的性质，所用洗脱剂是 水和不同浓度乙醇的水溶液，洗出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出 柱，水溶性差的最后出柱。凝胶柱色谱：将多糖按分子大小和形状不同 分离出来。常用的有葡聚糖凝胶( s e p h a d e xg ) 、琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e b i o 。b e la ) 、聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e lp ) 等。制备性区域电泳及透析、 超滤、超速离心等。 1 1 4 真菌多糖的纯度测定 多糖的纯度是指一定分子量范围的均一组分，代表相似链长的平均分 布。将多糖各组分分离后还要测定所得各组分是否是均一或纯多糖。方法 有功能团分析、比旋光度、纸色谱、高效液相色谱、高压电泳、超滤离心 分析法、纤维素柱色谱法、毛细管气相层析、h p l c 等。其中，色谱法和 电泳法常用，并需用三种以上的纯度鉴定方法证明才能保证为纯品。 7 羊肚菌胞外多糖与胞内硒多糖抗氧化活性研究 纸层析法的结果呈现一集中斑点，可认为是均一组分；高压电泳法是 依据多糖分子在电场中的移动速度取决于其所带电荷的多少及分子的形 状、大小，均一组分多糖电泳后染色呈单一色斑或单一峰；凝胶柱层析时， 若流出曲线为单一对称峰，则为单一组分；采用高压液相法，用凝胶柱检 测多糖时，若形成对称的单一峰则组分被视为单一组分。 1 1 5 真菌多糖的结构鉴定 多糖的结构分类可分为一级、二级、三级和四级。其中，二三四级结 构统称为多糖的高级结构，其与多糖的活性关系更加密切。多糖的一级结 构( 吴东儒，1 9 8 7 ；张惟杰，1 9 9 9 ) 是指糖基的组成、糖基排列顺序、相 邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。 真菌多糖的一级结构主链是均多糖，主要有两种：( 1 ) 葡聚糖( g l u e a n ) 1 3 1 ， 3 糖苷键连接为主，并兼有少量p 1 ，4 或其它糖苷键，香菇多糖、茯苓 多糖、裂褶菌多糖、云芝多糖等都属于这种连接：( 2 ) 甘露聚糖( m a n n a n ) 主要由g t 糖苷键连接的主链，如：冬虫夏草多糖0 【1 ，2 糖苷键连接，银耳 多糖和黑木耳多糖是a 1 ，3 糖苷键连接，灵芝多糖是由0 【1 ，4 糖苷键连 接。就其一级结构而言，多糖中单糖的组成、糖苷键的类型以及一些官能 团对其生物活性都有影响，一般而言，多糖主键上p 1 ，3 糖苷键是其活 性的结构前提( 朱建华等，2 0 0 5 ) 。 1 1 6 真菌多糖的生物学功能 1 1 6 1 抗肿瘤活性 自从5 0 年代发现酵母多糖具有抗肿瘤作用以来，已分离出了许多具有 抗肿瘤活性的多糖具有抗肿瘤活性的多糖，主要有两类：一类多糖具有细 胞毒性，可以直接杀死肿瘤细胞，如香菇多糖、银耳多糖、芸芝多糖等； 另一类多糖则作为生物免疫反应调节剂通过增强机体的免疫功能而间接 抑制或杀死肿瘤细胞，如能够诱导细胞分化、刺激造血、抗转移( k i m u r a e ta 1 ，2 0 0 6 ) 、抗新生血管生成( c h a n ge ta 1 2 0 0 2 ) 和诱导n o 产生( l e e e ta 1 ，2 0 0 6 ) 的多糖。具有抗肿瘤活性的多糖大多是通过这种途径起作用 的，也就是常说的宿主介导抗肿瘤活性。 1 1 6 2 降血糖、降血压、降血脂作用 多糖是有1 0 个以上单糖缩合去水，以糖苷键形式结合形成的多聚糖。 o p k i k 山东农业大学硕士学位论文 它与单糖、寡糖的性质不同，不但不会使血糖升高，而且能降低血糖。有 望成为一类新的降血糖药物( k i t oe ta 1 ，1 9 9 4 ) 。食药用真菌多糖能有效 增强冠状动脉机能、扩大冠体流量，增强心肌供氧能力，降低血脂，预防 动脉硬化，改善血液循环。研究发现，竹荪多糖、双孢菇中的酪氨酸酶能 有效降低血压；虫草多糖对心律失常有疗效；姬松茸多糖能降低血脂、提 高耐缺氧能力( 曾凯宏等，2 0 0 1 ；朱建燕等，2 0 0 2 ) 。目前发现具有降血 糖作用的多糖很多，如从植物羽叶白头树中获得的多糖( s h i r w a i k a re ta 1 ， 2 0 0 6 ) ；。从小豆中获得的多糖( i t o he ta 1 ，2 0 0 4 ) ：从高等真菌中获得的多糖 ( k i h oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 等。 1 1 6 3 抗炎作用 自从发现寡糖特别是果聚寡糖具有抗炎作用后，人们又发现多糖也具 抗炎作用( l i n d s a ye ta 1 ，2 0 0 6 ；a k i n d e l ee ta 1 ，2 0 0 7 ：g t t z m a ne ta 1 ，2 0 0 3 ： 王蓉等，2 0 0 1 ) 。这些多糖能选择性地粘附病原体，阻断微生物病原体对 靶细胞的吸附( l e ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 从而具消炎和抗感染作用。 1 1 6 4 抗氧化作用 抗氧化作用机理：自由基是带有不配对电子的原子、原子团或分子。 超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、羟基自由基( o h ) 、多种有机氧自由基( r o 、r o o ) 、 单线态氧( 1 0 2 ) 、无机和有机过氧化物( h 2 0 2 、r o o h ) 等含氧自由基称为活 性氧或氧自由基( 钦传光等，2 0 0 1 ) 。它是人体内的正常代谢产物，在正常 情况下，人体内的自由基处于动态平衡中，但是一旦该平衡被打破就会对 机体造成损害，从而引发一系列相关疾病( m a r x ，1 9 8 7 ) 。随着自由基生 物学和医学研究的日趋深入和发展，活性氧自由基的致病作用机制研究正 引起人们的巨大关注。为防止或减轻脂质过氧化物的形成，需要合适的抗 氧化剂。由于化学合成制品大多有毒副作用，因此从天然植物中寻找低毒 或无毒的抗氧化有效成分，其意义是重大的。有关衰老的机制存在多种学 说，其中自由基学说是公认的学说之一。氧在代谢过程中可以产生多种性 质活泼的自由基，这些自由基使生物膜的多元不饱和脂肪酸发生脂质过氧 化，生成脂质过氧化物( l p o ) ，l p o 可分解产生丙二醛( m d a ) ，m d a 是一 种有害物质，它可引起多种生化毒性反应，形成老年斑、脂褐素等异常代 谢产物，造成机体衰老和多种疾病。人体内存在抗氧化系统，超氧化物歧 9 羊肚菌胞外多糖与胞内硒多糖抗氧化活性研究 化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 和谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 均能消除 体内自由基，减少其对机体的损伤。 多糖是自然界含量最丰富的物质之一，也是与人类生活紧密相关的一 类生物高分子。近年来多糖抗氧化的研究报道越来越多( 李志孝等，2 0 0 0 ； l ie ta l ，1 9 9 3 ) 。关于多糖抗氧化的作用机理可能有以下两类：( 1 ) 多糖分子 间接作用于自由基。具体又可以分为两种：一是多糖分子直接作用于抗氧 化酶。通过提高体内原有抗氧化酶如：s o d 、c a t 、g s h p x 等的活性，间 接发挥抗氧化作用。二是多糖分子络合产生活性氧所必需的金属离子。多 糖结构中的醇羟基可以与产生o h 等自由基所必需的金属离子( 女1 1 f e 2 + 、 c u 2 + 等) 络合，使羟基自由基的产生受到抑制，进而影响脂质过氧化的启 动，最终抑制活性氧的产生( v o l p ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 。( 2 ) 多糖分子直接作用于 自由基。对于脂质过氧化而言，多糖分子可以直接捕获脂质过氧化链式反 应中产生的活性氧，阻断或减缓脂质过氧化的进行；对于o h 而言，多糖 碳氢链上的氢原子可以与其结合成水，达到清除o h 的目的，而多糖的碳 原子则因此成为碳自由基，并进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对 机体无害的产物；对于超氧阴离子自由基而言，多糖可与其发生氧化反应， 达到清除的目的( 张静丽等，2 0 0 4 ) 。 抗氧化作用检测指标：红细胞是血液的主要细胞成分，在机体内主要 起着运送0 2 和c 0 2 的作用。研究表明；红细胞具有识别、黏附、浓缩、杀 伤异己、清除免疫复合物的能力，参与机体的免疫调控( 刘景田等，1 9 9 5 ) 。 在许多疾病发生机理中，红细胞免疫缺陷占有很重要的地位。而在多种病 理生理状态下，红细胞会发生脂质过氧化，引起抗氧化酶系诸如s o d 、 g s h p x 等和脂质过氧化物，如m d a 的变化( 黄益民等，1 9 9 7 ) ，从而影 响红细胞生理功能的发挥。 目前对多糖的抗氧化活性的研究，常采用体外或体内模型，以超氧化 歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽氧化酶( g s h p x ) 等体内抗氧 化酶的活性，丙二醛( m d a ) 、过氧化脂质( l p o ) 等体内氧化反应产物的含 量，以及清除自由基的效率等项目为检测指标，从离体或整体水平上来衡 量多糖抗氧化作用的大小。 谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) l o o p 山东农业大学硕士学位论文 1 9 5 7 年m i l l s 等首先发现谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) ，1 9 7 3 年 r o t r u c k 等证明g s h p x 为含硒酶。g s h p x 是机体内广泛存在的一种重要的 催化过氧化氢分解的酶。它能特异催化还原型g s h p x 对过氧化氢的还 原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。g s h p x 的活性中 心是硒半胱氨