（环境科学专业论文）氰戊菊酯的手性拆分及其对映体的水生毒理学研究.pdf

2 0 0 6 年浙江大学坝一h 学位论文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，d a p h n i am a g n aa n db r a c h y d a n i or e r i ow e r et e s to r g a n i s m s ，a n da s e r i e so ft o x i c i t yt e s tw e r ee s t a b l i s h e d am e t h o df o rc h i r a ls e p a r a t i o no ff o u r f e n v a l e r a t ee n a n t i o m e r sw a sd e v e l o p e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h et h e s i sa i m st oe v a l u a t ea c u t et o x i c i t yo ff e n v a l e r a t ea n di t sf o u re n a n t i o m e r st o d a p h n i am a g n aa n db r a c h y d a n i or e r i o ，a n da l s op r o v i d e st h ee v a l u a t i o ns t a n d a r df o r e n v i r o n m e n t a lo r g a n i s m s am e t h o df o rc h i r a ls e p a r a t i o no ff o u rf e n v a l e r a t ee n a n t i o n l e r sw a sd e v e l o p e db y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yo n t h ec h i r a l s t a t i o n a r yo fc e l l u l o s e d e r i v a t i v e ( c h i r a l c e lo j h ) t h eg o o dr e s o l u t i o nw a so b t a i n e dw i t ham o b i l e p h a s eo fn h e x a n e 1 ，2 - d i c h j o r o e t h a n e e t h a n oj ( 9 2 6 2 ，v v v ) a taf l o wr a t eo f 06 m l m i n u n d e r4 0 。c 。t h er e s o l u t i o n sw i t ho v e r2 0f o ra l lc o n t i n u o u sp e a k sw e r es h o w n a tt h em o b i l ep h a s ec o n d i t i o n s t h ep e a ks e q u e n c eo ft w op a i r so fe n a n t i o m e r s ， ( r ，r ) - a n d ( s ，s ) 一i s o m e r w e r ei d e n t i f i e d b y ( s ，s ) - i s o m e rs a m p l e a n dc d c h r o m a t o g r a p h y a n dt h ef o u rp e a k sw a sc a l l e df n l 、f n 2 、f n 3a n df n 4 t h ee f f e c t s o fa d d e da m o u n t so fe t h a n o li nt h em o b i l ep h a s ea n dc o l u m nt e m p e r a t u r ew e r e s t u d i e d t h et e s te v a l u a t e s2 4 h - e c s oa n d4 8 h - l c s oo ff e n v a l e r a t ea n di t sf o u re n a n t i o m e r s f o rdm a g n ar a c f n 、f ni 、f n 2 、f n 3 、f n 42 4 h - e c 5 0v a l u e sf o rd m a g n ai nt h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s w e r e0 4 i 岭，l 、o8 6 9 9 l 、2 48 4 i i t g l 、9 5 3 9 9 la n d0 , 4 9 9 9 l t h et o x i c i t yo r d e rw a sr a c - f n f n 4 f n l f n 3 f n 2r a c f n 、f n i 、f n 2 、f n 3 、 f n 44 8 h l c s 0v a l u e sf o rdm a g n ai nt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r eo 2 8 p g l 、 0 , 2 5 9 9 l 、1 7 7 7 1 a g l 、71 4 t x g la n d0 1 8 9 9 l t h et o x i c i t yo r d e rw a sf n 4 f n l r a c f n f n 3 f n 2 t h e yw e r ea l lh i g ht o x i c a n t o nt h eb a s i so fc l a s s i f i c a t i o n s t a n d a r do ft o x i c i t y t h ed i f f e r e n c e so ft o x i c i t yo nt h ef i v ep e s t i c i d ew e r el a r g e ，f n 2 w a s6 0t i m e sm o r et h a nf n 4a c c o r d i n gt ot h e2 4 h e c s o e v e nm o r e ，f n 2w a s1 0 0 t i m e sm o r et h a nf n 4 a c c o r d i n g t ot h e4 8 h l c s o t h et e s te v a l u a t e s9 6h o u r sa c u t et o x i c i t yo ff e n v a l e r a t ea n di t sf o u r e n a n t i o m e r sf o rb r a c h y d a n i or e r i o a c c o r d i n gt ot h er e s u l t s ，l c s 0o ff n 2w a st h e 4 2 0 0 6 年浙江入学顺卜学位论义 h i g h e s t ，t h e l o w e s tw a sf n 4 f n 22 4 h - l c s ow a s2 3 9 9 0 p g l f n 42 4 h l c s ow a s 14 4 6 j x g l ，t h ed i f f e r e n c ew a s17t i m e s f n 24 8 h l c 5 0w a s2 21 31 肛g l f n 4 4 8 h l c 5 0w a s9 9 5 i _ t g l ，a n dt h ed i f f e r e n c ew a s2 2t i m e s f n 27 2 h - l c 5 0w a s 2 0 97 2 g l f n 47 2 h - l c 5 0w a s5 3 6 9 9 l ，t h ed i f f e r e n c ew a s4 0t i m e s ，f n 2 9 6 h l c 5 0w a s19 3 1 9 9 l f n 49 6 h - l c 5 0w a s3 4 8 9 9 l ，t h ed i f f e r e n c ew a s5 5t i m e s a c c o r d i n gt ot h er e s u l t s ，t h et o x i c i t yo r d e ro ft h ef i v ep e s t i c i d ew a sf n 4 m e - f n f n l f n 3 f n 2 k e y w o r d s ：d a p h n i am a g n a ；b r a c h y d a n i or e r i o ；f e n v a l e r a t e ；e n a n t i o m e r s ；c h i r a l s e p a r a t i o n ；t o x i c i t yt e s t ；d i f f e r e n c eo f t o x i c i t y 2 0 0 6 年浙江人学删= 1 学位论文 第一章文献综述 1 手性拟除虫菊酯类农药的环境毒理学研究进展 手性是个几何学的概念，可以定义为“任何一个不能与其镜像完全重叠的 几何构型或者群都可以说其具有手性( 见图1 1 ) 。由于手性化合物对映体的 生理、毒理与生化的差异性，手性农药在环境中的对映体选择性行为己愈来愈引 起人们的关注。 图卜1 左右手镜面对称 关于手一肚农药对映体之川1 3 不同生物活性的研究工作已经开展了很多，但是对 于- l ：污染物的刈映体选择性毒性的研究却非常之少。大多数农药具有致癌作用和 毒性，它们可能破坏某个特定的身体器官比如肝脏、肾和骨髓等，而且还会改变 酶的活性i 。此外，对映体选择性可能极大的影响手性农药在非耙标环境中的生 态毒理效应。由于对映体的选择性生物降解特定的对映体可在地面水生生态系 统这样的非耙标环境中得到富集。通过非手性分析得到的农药浓度所指示的可能 与实际的生态毒理学效应并不相符。而且从经济和效率的目的出发，即使使用对 映体纯的农药也不定能产生预期的环境效益。因此在研究时必须弄清它们对非 耙标生物毒性以及在敏感生态系统中生物降解或生物累积过程中的对映体选择 性。随着人类对环境污染物认识的不断深入，在对映体水平上研究农药的环境毒 理学将会成为必然。 除虫菊酯是一类源于植物的天然产品，它们含有多个手性中一心并且作为光学 活性杀虫剂来使用。最初的拟除虫菊酯通常是由诸如菊酸和除虫菊酯醇酮等的天 然产品制备而得的。但是近来一些新品种拟除虫菊酯的制备没有利用原始的天然 产品，但是它们是刑映体纯的。通过这些过程得到的对映体纯异构体还可能发展 为商品化农药。 2 0 0 6 年浙江人掌硕十学位论义 表1 - l 对保留有菊酸部分的拟除虫菊酯的立体异构体生物活性进行了比较。 在由异构菊酸构成的酯中，包含( 1 r ) 一( + ) 一酸部分的相对于( s ) 一( 一) 一酸酯显示出了较 高的杀虫活性d 1 。菊酸的( 1 r ) 异构体本来就是天然除虫菊酯的一部分，因此在发 展起来的商品化产品中保留( 1 r ) 一菊酸结构并不奇怪。尽管( r ) 异构体具有较 大的杀虫作用，但是( 1 r ) 和( 1s ) 一( t r a n s 和c i s ) 异构体对哺乳动物的毒性差异 非常小【”。 表1 - 1 部分菊酸酯的结构和生物活性 家蛳蟑螂小鼠急性 结构( 1 r ) 一c i s - 异构体k t t 。l 眈。( o r a l ) l d ( s )( ug 个) ( m g k g ) 史b 誊i r ) - 篙( + ) c i s n s 了蔫巍 史l 蒜1 r ) - 嚣( + ) c i s ：1 2 。_ ；1 0 0 0 碘弧| i | ；t r ) - ( + ) c i s ；4 3 i 6 ； 过d p 警( 1 r ) - 嚣( + ) c i s 1 i 0 焉 2 5 0 0 k t 吲半数击削时间；l d 叫半敛歹e 浓度。 用各种环丙烷或非环丙烷的衍生物来修饰拟除虫菊酯的酸部分，在很多情况 下合成酸部分仍然含有一个或多个手性碳。尤其是保留有0 r ) 一构型的c 3 修饰菊 酸类似物( 表1 2 ) ，它们不仅具有较高的杀虫活性，而且对哺乳动物的毒性也较 低1 5 - 6 j 。 拟除虫菊酯中的有效酸是苯基羧酸，这些酸含有一个手性碳而且在很多情况 下都接有一个异丙基。氰戊菊酯f 7 - 8 1 和氟氰戊菊酯就是含有这种酸的例子( 表 2 0 0 6 年浙江大学倾卜学位论文 1 3 ) 。氟胺氰菊酯( d 一缬氨酸衍生物) 【9 也与这类化合物比较接近。这一类化合 物中最具杀虫活性的异构体都具有与菊酸的( 1r ) 构型相符合的绝对构型。尽管 在这些活性3 - 甲基丁酸衍生物的设计中一c 是( s ) 的，但是这些衍生物的立体化 学环境与( 1 r ) 一菊烷的是非常相似的( 表1 3 ) 。 表1 2c 3 - 修饰菊酸酯的结构和生物活性 家 蝇小鼠急性 结构 l 矾。( n g 个) l d * ( m g k g ) ( 局部)o r a li v o 妻飞v 。 吨b v 0 ：漤p | ”跫p 手性农药对映体之间生物活性的差异可能是由作用部位固有的活性差异引 起的；也可能是由代谢性解毒速率的差异引起的，就像其它一些过程那样活性异 构体在靶标位置的浓度降低了。尽管些合成农药对映体单体和对映体纯异构体 现在已经市场化了( 如菊酯类杀虫剂，苯氧丙酸类除草剂和三唑类杀菌剂) ，但 是有手性机磷农药的对映体纯异构体还没有面市。 手性和前手性农药的单个对映体纯异构体对靶标和非靶标生物的毒性和代 谢机制还有待进一步的研究。当某个对映体纯异构体对环境以及人体健康构成了 威胁，那么就算它具有很好的生物活性也不能使用：而对于那些不具生物活性的 对映体纯异构体，就算它没有造成任何风险，从经济和环境保护的角度出发也不 能使用。 2 0 0 6 年浙江大学顺一i 学位论文 表1 3 一取代3 甲基丁酸酯和相关除虫菊酯 f e n v a l e la t e ( _ 5 【傥菊酯) ( 2 s osc i s )f 1 u v a li n a t e ( 氟胺锇菊酯) ( 2 s ) 一。奴o 卑拶 c 1 n c d 7 h n c f e n c v c a t e 一一炽iq 。o 呱舒p。y 一 2 拟除虫菊酯类农药对动物的神经毒作用研究概况 拟除虫菊酯类农药属于神经毒物，是7 0 年代迅速发展起来的新型农药，具 有选择性毒性、哺乳动物体内代谢和排泄迅速、环境中残留较少等特点。但这类 农药的多数品利是高亲脂性化合物，对水生生物毒性较大。 溴氰菊酯致大鼠脑电方面发现脑电图呈现先兴奋后抑制的变化特征，而且染 毒程度与脑电节律变化的速度、程度密切相关。采用大脑皮层贴敷及脑内核团微 量注射方法，探查神经毒作用靶点，发现它的毒作用主要在中枢神经系统，对中 枢多部位神经元有影响，尤以大脑皮层为著，提示溴氰菊酯对脊髓前角神经元的 影响是产生神经运动症状的原因 1 1 1 2 on a r a h a s h i 报道氰戊菊酯对通道门控时效 关系，即对快、中、慢神经元钠通道的影响【“”，他还对拟除虫菊酯同种异构 体在神经元上的结合位点及其效应进行了比较，但对拟除虫菊酯作用钠通道的机 理仍未阐明，有待进一步研究。 拟除虫菊酯类农药绝大多数属于高亲脂性杀虫剂，在水中能直接进入鱼鳃和 血液中”】，而鱼类对它们转化能力和排泄能力较低【1 6 】，因此它们对水生生物的 毒性比较强。拟除虫菊酯类农药多通过贝类预期的个例反应来抑制贝类的生长或 者通过破坏细胞膜上的离子通道来干扰水生动物的正常生理生化过程。带有。一 氰基的拟除虫菊酯能使钠通道开放，从而使钠离子流动加快，使神经传递和肌肉 收缩加速f 。氰戊菊酯和胺菊酯严重降低紫贻贝的摄取、呼吸等生理功能，使 其生长率发生改变。它可以改变鱼鳃结构，改变神经膜的离子可渗透性而扰乱神 2 0 0 6 年浙江人学顺1 。学位论义 经传导，改变渗透膜的平衡( 作用于n a + 、k + 通道) 。甲氰菊酯对鱼类的作用机 制与鱼体离子平衡和渗透压调节的失控、a t p 酶的抑制和鳃组织病理学损伤密切 相关。陈碧娟等人认为贻贝对除虫菊酯类农药有隔离反应( 闭壳现象) ，从而降 低贻贝的摄食、呼吸等生理功能降低其生长率。溴氰菊酯可引起鱼体生长 碱缓，体重减轻，并可见肝肿大及肝脏、中枢神经和周围神经的病理损害。溴氰 菊酯有一定的致突变性，一定剂量下可引起骨髓嗜多然红细胞微核率和睾丸精母 细胞染色体畸变率增加【l 。甲氰菊酯可导致鱼鳃组织鳃小叶增生膨大、邻近鳃 小叶末端膨大、粘液分泌增加和上皮细胞坏死脱落等症状【2 ，同时也影响了鳃 组织的呼吸、分泌、排泄等功能，提示对鳃组织的损伤破坏是甲氰菊酯对鱼类高 度的重要原因之一。 拟除虫菊酯类农药对神经组织些代谢酶有明显影响，如对单胺氧化酶、羧 酸酯酶、混合功能氧化酶，n a + 一k + a t p a s e 、c a 2 十一m 9 2 + a t p a s e 等均有影响。 n a + k + a t p a s e 在神经细胞中是一种膜结合的酶蛋白，在n a 十、k + 和m 9 2 + 存在是 水解a t p ，提供主动运输n a + 和k + 所需的能量，拟除虫菊酯能明显抑制神经组 织中该酶的活性，在7 0 m g k g 剂量能显著降低大鼠脑组织中该酶的活性，体外试 验中可见抑制胞内c a 2 + 和n 矿的主动运输，使胞内相应离子浓度升高而影响神 经兴奋性。围产期大鼠经口染毒出生后及哺乳期幼鼠脑组织中n a + 一k + - a t p a s e 活 性明显降低【2 1 - 2 2 。 拟除虫菊酯类农药对神经递质有明显的影响。牛玉杰【23 j 等利用p t - h p l c 测 定不同脑的g l u 和a s p 的含量，结果发现溴氰菊酯和氯菊酯可以明显提高大鼠 脑组织皮层，海马及小脑中g l u 和a s p 的含量，尼莫地平能有效地阻断溴氰菊 酯和氧菊酯升高g l u 和a s p 的作用，l 硝基精氨酸能完全阻断溴氰菊酯的作用， 但只能部分阻断氯菊酯的作用，提示c a ”和n o 在溴氰菊酯和氯菊酯升高c l u 和 a s p 的机理中起着十分重要的作用，两种类型的拟除虫菊酯的作用机理存在着差 异。谢卓丘发现溴氰菊酯可引起大鼠骨髓中天门冬氨酸( a s p ) ，谷氨酸( g l u ) 和o 氨基丁酸( g a b a ) 含量增加。 有研究表明拟除虫菊酯的神经毒作用是通过鸟核苷酸调节蛋白( g 蛋白) 来 实现的，低剂量拟除虫菊酯对通道作用不明显，当与作用于g 蛋白的化合物一 起时，拟除虫菊酯的作用显著增强。e n a n e 等研究了i i 型拟除虫菊酯对大鼠大脑 2 0 0 6 年浙江大学硕士学位论文 突触与神经递质释放有关的蛋白磷酸化的影响，发现低剂量时直接刺激蛋白激酶 c 磷酸肌醇活化途径，导致自由钙、i p 3 胞内浓度增高，特别引起注意的是诱发 二个酸性蛋白8 7 、4 8 k d 和一个碱性蛋白3 8 k d 磷酸化增强，认为与实验有关的 钙敏感蛋白是拟除虫菊酯的主要作用部位口”。 拟除虫菊酯类农药对对神经信号转导过程也有较大的影响。殷若元等 ”1 采 用h p l c ，h p t l c 及同位素示踪技术，观察拟除虫菊酯和马拉硫磷对脑细胞中 肌醇磷酸酯代谢的影响，结果发现氰戊菊酯( f e n ) 和四甲菊酯( t e t ) 可是磷酯 酰肌醇二磷酸( p i p 2 ) 降低，对p 1 p 2 的磷酯酶c 呈明显的激活效应，f e n 和t e t 引起肌醇磷酸酯升高。认为拟除虫菊酯的兴奋性毒性与受体磷酯酰肌醇毒性的 变化密切相关。赵西龙2 7 1 观察溴氰菊酯对n o s 在大鼠大脑特定脑区中分布的影 响。结果显示，溴氰菊酯可使大鼠大脑皮层，海马和小脑等部位的n o s 阳性神 经元数目明显增多，呈染色阳性的单个阳性神经元活性增强，神经纤维染色加重， 并且连接成网。提示溴氰菊酯的神经毒作用可能是通过观酸过量释放，诱发中枢 神经系统n o s 活性的升高有关。赵西龙以f u r a 一2 a m 为c a 2 + 荧光探剂，用 a r c m 。m i c 荧光显微阳离子测定系统，观察溴氰菊酯对单个神经元游离钙水平 影响的动态变化，并分析其可能的作用机理。结果显示，神经元静息期胞内 c a 2 + 约为01 9 m o l l ，给与溴氰菊酯( 1 0 9 m o l l ) 可使神经元胞内【c a 2 + 明显增高。 胞内【c a 2 + 的升高时有胞外c a 2 + 内流引起，而与胞内c a 2 + 库释放无关。加入n m d a 受体通道阻断剂a p5 可明显降低溴氰菊酯引起的胞外c 矿+ 内流，而电压依赖性 l 型c a 2 + 通道阻断剂v e r a p a m i l 对溴氰菊酯升钙效应影响较小。提示溴氰菊酯主 要通过影响神经元胞膜上兴奋性谷氨酸n m d a 型受体，使该受体离子通道开放， 胞外c a ”大量内流，引n c a ”1 的增加。 近年来，国外已建立了决定神经毒性的体外实验方法。它可分别对中枢神经 系统的髓质，灰质：对中枢神经系统特殊细胞核和脑的细胞群：对周围神经轴突 及细胞体的损伤进行研究，还可研究中枢神经系统与周围神经系统的连接功能性 或结构性的变化。但体外实验并不能完全替代体内试验，因为神经细胞在标准的 培养状态下仅执行这部分神经生理学工作，有许多物质引起神经毒性只能在工作 着的神经系统中爿能表现出来【2 。 2 0 0 6 年浙江人学坝卜学位论文 3 大型蚤概述及其在农药毒理学上的应用 31 大型蚤概述 大型蚤( d a p h n i am a g n as t f a u s ) 生活于自然水域，属于浮游甲壳类动物， 是世界种。它具有生活周期短、繁殖快、经济、方便易得、对毒物敏感、易于在 实验室培养等优点，加上它们在水域生态系统中的重要性，因而得到众多国家的 应用，已成为一种标准试验生物广泛地用于水生生物毒理试验。大型蚤毒理试验 不仅可以评价工业废水、农药、化学毒品和水中沉积物对水环境的污染，为制定 各种水质标准提供科学依据：而且可以做为监测手段控制水环境的污染。 大型蚤是国际公认的标准试验生物，自从美国环保局( e p a ) 在19 7 8 年将 大型蚤定为毒性试验的必测项目，建立了大型蚤的毒性试验的标准方法 3 0 1 后， 日本和许多欧洲国家也相继成立了自己的标准方法，我国p 】于1 9 9 1 年成立了自 己的大型蚤急性毒性测定方法。 大型蚤是一组器官俱全的透明体，解剖镜下可直接观察到中毒症状。试验蚤 可以从其他实验室已有的纯培养中挑取、引种，也可以从野外采集，野外采集的 蚤要经分离、纯化。通常情况下大型蚤采取单性孤雌生殖方式，当培养液中大型 蚤的密度太大的时候会造成大型蚤停止孤雌生殖而进行有性生殖。蚤类喜食藻 类、细菌、酵母及有机碎屑等，我国国标方法推荐用实验室培养的栅藻作为大型 蚤的饵料川。 3 11 大型蚤分类学 大型蚤分类学如下：大型水蚤系浮游生物( p l a n k t o n ) 一浮游动物 ( z o o p l a n k t o n ) 一节肢动物门( a r t h r o p o d a ) _ 甲壳动物纲( c r u s f a c e a ) 一鳃足 亚纲( b r a n c h i o p o d a ) 一双甲目( d i p l o s t r a c a ) 一枝角亚目( c j a d o c e r a ) _ 具枝 角亚目( b s u b o r d e re u c l a d o c e r a ) 一盘肠蚤总科( s u p e r f a m i l yc h y d o r o i d e ) 一蚤 科( f a m i l yd a p h n i i d a e ) 一蚤属( d a p h n i a ) _ 栉蚤亚属( c t e n o d a p h n i a ) _ 大 型蚤( 种) t d a p h n i a m a g n as u a u s ) 3 2 1 。 3 12 大型蚤的结构 大型蚤是一种浮游动物枝角类生物，身体短小，左右侧扁从侧面看略呈长 圆形，分为雌性与雄性，雌体2 2 6 0 毫米。体色淡红或黄色，随外界条件的不 同而变化。大型蚤的结构见图1 ，2 。 2 0 0 6 年浙江人学坝十学位论文 大型蚤体壳壳面由菱形花纹，后端由较短的壳刺。头部宽而低头顶圆钝，无 盔。吻部稍凸出，壳弧发达。复眼不大，位于头顶，单眼小，位于第一触角的正 上方。躯干部由胸部与腹部合成，胸部有附肢而腹部无。有腹突，后腹部大，向 后逐渐收削。肛门位于后腹部，有尾爪，尾爪上有栉刺，尾刚毛长在肛门后，第 一触角在头部，短而粗，第二触角很大，能运动，分节，又叫大触角，分内肢外 肢，上面长满了游泳刚毛。雄体小，体长1 7 5 25 0 毫米，前腹角圆而凸出，壳 刺很短，头部向下弯曲复眼特大，吻钝。第一触角很长且粗，有根刚毛，第 一胸肢有一个钩及一个长鞭毛。腹突不明显。后腹部在肛门开口处有肛刺十个左 右，末背角呈大的侧突。输精管开孔于侧突之间【3 ”。 1 心脏 2 眼睛 3 腮 4 第二触角 5 肌肉 6 消化道 7 ，壳腺 8 卵巢 9 胸部 1 0 卵 1 1 孵育囊 1 2 尾爪 1 3 肛门 图1 2 大犁蚤 f i g 1 2 d a p h n i am a g n as t r a u s 3 2 大型蚤毒理试验在农药上的应用 3 2 1 大型蚤毒理学研究进展 1 4 后腹部 1 5 尾刺 1 6 肛刺 1 7 大脑穹隆 1 8 食道神经 1 9 第一触角 2 0 头部 2 1 囊 2 0 0 6 年浙江大学硕十学位论文 大型蚤的应用起始于1 9 2 8 年，美国科学家a i m ov i e h o e v e r 3 3 1 首先把水蚤试 验技术应用在药理毒理学研究上，通过一系列的试验发现药物对水蚤的生理作用 与对人类的生理作用一致，确认水蚤类是一种很好的实验生物。首次将水蚤类毒 性实验应用在防止工业废水污染工作上的是英国的学者a n d e r s o n 州( 1 9 4 4 年) ， 他认为水蚤类比鱼类更为敏感，先后报道了有关工业废水中2 5 种毒物的毒性试 验。 2 0 世纪5 0 6 0 年代，人们主要是研究一些毒物对大型蚤生存的影响，到了 2 0 世纪7 0 年代，随着大型蚤毒理试验的发展，一些学者开始重视大型蚤的慢性 毒性试验研究。2 0 世纪8 0 年代以来大型蚤毒理试验得到很大重视和发展，大型 蚤的繁殖、生长等幔性毒性试验开展起来，许多学者还进行了大型蚤的富集及代 谢试验。到了2 0 世纪9 0 年代，水蚤的毒理试验得到了更广泛的开展研究。在大 型蚤的急慢性毒性上，大型蚤的生物测试技术己广泛的用于各种新有机物和对环 境和人体有生理影响的物质的测试，如对甘菊蓝( a z u l e n e ) 和长叶烯( 1 0 n g i f o l e n e ) 3 5 1 、植物生长调节剂【”1 、邻苯二甲酸酯增塑剂【3 7 j 、莠去津( a t r a z i n e ) 3 8 1 、烷烃 酚类【3 9 1 、麝香二甲苯衍生物等对大型蚤的急毒性实验，并把这些毒性实验应 用于工农业和生活污水处理上，如：v i l l e g a s n a v a r r o 和s a n t i a g o 等人研究用大 型蚤测试处理过的工业废水和未经处理的医院排水的l c 5 0 ，并对其毒性进行对 比。 到了2 1 世纪，研究学者们对大型蚤的毒性试验更向纵、深方向发展了。除 了急慢性、蓄积、联合、生长繁殖和应用方面等试验，深入研究了在各种不同条 件下毒物对大型蚤在分子水平上的毒害，如：b o r g e r a a s t 4 2 1 研究了不同的氧浓度 和温度下u v - b 对大型蚤致死率和抗氧化剂酵素活性的影响，g a i n u t d i n o v 4 3 1 研究 了高温环境下大型蚤和暗白色线蚓的化学感官信息的遗传密，d e c o e n 【4 4j 研究了 在汞和高丙林六六六的亚致死浓度下大型蚤中碳水化合物的改变等等。科学家们 还进一步研究了大型蚤的趋光性试验和q s a r 法研究毒物结构活性。如： h u o b i n e n 【4 5 1 等研究的随u v - b 辐射增加惹烯对大型蚤的光诱导毒性。 在这一阶段，研究学者们运用了各种不同的分析方法来测定大型蚤生物试 验。如：a r a k i l 4 6 1 用4 一甲基一氢基氢化物( t m a h ) 存在下的热解一g c m s 法 分析大型蚤对工厂废水中的三氯甲基邻苯二酚的生物蓄积，此方法简单、快速、 2 0 0 6 年浙江_ 人学倾i 学位论文 时间短，因此可以用于评价工厂废水的毒性物质的生物蓄积效应；d e nb e s t e n 【4 7 i 研究用中性红残留试验( 测溶酶体的稳定性) 和成彗星状谱带分析( 测d n a 的 完整性) 的相互关系为指标，测定毒物对大型蚤生命活动的影响，这个实验结果 为将来用中性红残留实验和成彗星状谱带分析方法来早期预测毒物对蚤类影响 做了基础研究，等等，这些都为今后的试验提供了多方面的测试方法。 g u i l h e r m i n o 通过对大型蚤急性毒性试验，找出毒物对蚤和哺乳动物( 鼠) 毒性相关性，可作为哺乳动物毒性实验前的预先审查，对减少实验动物数量有重 要意义。 3 2 2 大型蚤毒理试验在农药上的应用 由于新农药的不断出现，污染了环境，因此国内外运用大型蚤对农药进行毒 性研究的报道很多。目前用于农药上的大型蚤毒理试验方法有：急性毒性试验、 慢性毒性试验、富集试验、行为试验和酶活性试验。m j 1 l a r m e l 【4 9 】研究了农 药t e t r a d i f o n 对大型蚤的母代及其子代( 第一胎和第三胎) 的慢性毒性影响，结 果表明予代不但没有对农药产生适应性，而且受到药的影响更大，这可能是农药 通过母代的富集作用转移到子代并对子代产生更大的影响。ms a n c h e z 【5 0 】研究了 受农药二嗪农( d i a x i n o n ) 污染的母代及其在没有农药的环境中的子代( 第一胎 和第三胎) 的恢复试验，发现子代在没有继续污染的情况下其繁蜻和生长都能有 所恢复并且第三胎的恢复情况要比第一胎的恢复情况好。 但是现实环境中并不是只存在农药，可能会有好几种农药一起存在，也可能 是农药和其它有毒或无毒的物质并存，这些物质相互之间会发生联合作用，使得 原来农药的毒性加强、降低或无变化，因此用大型蚤的毒理试验来研究这些多种 物质并存的毒性情况显得更具有现实意义。最近，随着手性农药的开发和发展， 应用大型蚤来区别各种手性农药同分异构体之间的不同毒性也正在悄然兴起。 j u i - h u n gy e n s q 研究了( 十) 一对溴磷、( 一) 一对溴磷和外消旋的对溴磷对大型蚤的 2 4 h l c 5 0 ，结果表明( ) 一对溴磷的l c 5 0 明显高于另外两种，因此( 一) 一对溴磷对 大型蚤的毒性低。 4 斑马鱼概述及其在毒理学上的应用 4 1 斑马鱼概述 斑马鱼，名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼( b r a c h y d a n i or e r i o ) ，属于真骨鱼 2 0 0 6 年浙江人学坝= l 学位论文 总目，鲤科原产于印度、孟加拉国。斑马鱼起源于印度的克罗曼德尔海岸，生 活在急流中。斑马鱼体长很少超过4 5 r a m ，在银白色的鱼体上有7 - 9 条深蓝色水 平条纹。这些条纹延伸至尾鳍和臀鳍。背部呈橄榄绿色，雄性较雌性少，带有金 黄色光泽。雌性更偏呈银白色，产卵前腹部特别膨胀。在实验室里，斑马鱼被广 泛应用于标准毒理学试验。它具有繁殖快、方便易得、价格低廉、对毒物敏感、 易于在实验室培养等优点。斑马鱼毒理试验不仅可以评价工业废水、农药、化学 毒品对水环境的污染，为制定各种水质标准提供科学依据；而且可以做为监测手 段控制水环境的污染。 4 1 1 斑马鱼饲养特点 斑马鱼性情温和，小巧玲珑，几乎终日在水族箱中不停地游动。易饲养，可 与其他品种鱼混养。饲养水温2 0 2 5 ，在水温1 5 - - 4 0 。c 时仍能生存，对水质 的要求不高。r 常饲养时，在水族箱底部放些鹅卵石，使水质清澈。 4 12 斑马鱼繁殖特点 斑马鱼雄鱼体狭长，活泼好动，体色较深：雌鱼腹部膨大，活动摇摇摆摆， 体色较淡。较易繁殖，喜在水族箱底部产卵，一般可选6 月龄的亲鱼。在2 5 厘 米2 5 厘米2 5 厘米的方形缸底铺一层尼龙网板，或销些鹅卵石，当鱼卵产出 后即落入网板下面或散落在小卵石的空隙中。 选取2 3 对亲鱼，同时放入繁殖缸中，一般在黎明到第二天上午1 0 时左右 产卵结束，将亲鱼捞出。其9 口无粘性，直接落入缸底，到晚上1 0 时左右，没有 受精的鱼卵发白，可用吸管吸出。繁殖水温2 4 。c 时，受精卵经4 5 天孵化完； 水温2 8 。c 时，受精卵经3 6 小时孵出仔鱼。雌鱼每次产卵3 0 0 余枚，最多可达上 千枚。水温2 5 。c 时，当鱼苗能自由游动时即可开食，此时投喂原生动物或小鱼 虫。其繁殖力很强，是初学饲养热带鱼的首选品种。 4 2 斑马鱼毒理学研究概况 目前国际通用的急性毒性实验标准用鱼是斑马鱼，国内常用于毒性测试的鱼 还有青、草、鲢、鳙四大家鱼以及鳟鱼、金鱼、呆头鱼。丁中海等”2 】研究了吡 虫啉、三哗磷、哒螨灵对斑马鱼的急性毒性试验，三种农药对斑马鱼的9 6 h - l c s o 分别为2 8 1 3 7m g l 、8 3 7m g l 、1 1 6 6 斗g l 。根据急性试验结果，测定了三种农 药对斑马鱼的生物浓缩系数，评价了三种农药的慢性毒性机理。赵庆华i 5 3 j 等用 2 0 0 6 年浙江大学坝十学位论文 斑马鱼对2 2 个厂家2 7 个废水样进行急性毒性试验，比较了各个工业废水毒性大 小发现化学工业 化学纤维业 炼焦煤炭制品加工业 造纸纸制品加工业 饮 料制造业废水的毒性。孙晓怡1 5 4 j 等运用斑马鱼急性毒性方法对抚顺重点工业污 染源2 1 个排放口水样的毒性进行检测，用k 2 c r o 。做参比毒物，使此法测得的急 性毒性值定量化。但是传统鱼类毒性测定方法的指标过于简单，因而其应用范围 受到很大限制。朱琳 5 5 1 等提出的斑马鱼胚胎发育技术具有材料方便易得、操作 简单、可重复性及可靠性较高等优点，而且与传统的鱼类急性实验相比，具有成 本低、影响因素少、灵敏度更高等方面的优势，与成鱼实验相比，有更广阔的发 展空间。 o e c d 在1 9 9 8 年将斑马鱼胚胎技术列入测定单一化学品毒性的标准方法之 一，并制定了详细的操作指南( o e c dt g 2 1 2 ) f s 6 】。此后，该项技术广泛应用于 环境科学研究，尤其用于对生态环境乃至人类安全影响深远的化学物质的毒性和 致畸性”1 的测定。近1 0 年来，各国的研究人员采用斑马鱼胚胎技术测定并积累 了各类有机农药的胚胎毒性数据 5 8 59 1 ，见表1 _ 4 。 表1 4 有机农药的斑马鱼胚胎毒性试验结果 t a b l ei 一4b r a c h y d a n i or e r i oe m b r y ot o x i c i t yt e s tr e s u l t so fo r g a n i cp e s t i c i d e 有机农药( o r g a n i cp e s t i c i d e ) 4 8 h l c s o ( g m o l l ) 莠去滓( a t r a z i n e ) 马拉硫磷( m a l a t h i o n ) 胺甲萘( c a r b a r y l ) 尿素( u r e a ) 林丹( l i n d a n e ) 三苯基锡醋酸j 1 目( t p t a ) 1 6 9 1 6 2 0 3 5 0 4 2 0 8 l c lo o ( 4 8 h ) = 0 18 k m o l l 2 0 0 6 年浙江大学硕十学位论文 第二章氰戊菊酯的高效液相色谱手性拆分 1 引言 氰戊菊酯( f e n v a l e r a t e ) 是- - 4 十高活性的广谱杀虫剂，具触杀和胃毒作用。 对鳞翅目幼虫和对有机氯、有机磷已具抗性的害虫有较高的肪效。氰戊菊酯有2 个手性中心，4 个对映异构体。它们之间的药效己被证明存在差异，商品化的高 效氰戊菊酯( e s f e n v a l e r a t e ) ，也即( s , s ) 异构体是4 个异构体中最高效的，杀 虫活性比氰戊菊酯高出约4 倍。近年研究表明手性农药的环境行为及其安全性 都具有对映体选择性1 6 06 ”，l i u l 6 2 等发现氯菊酯和氟氯菊酯对水生生物的毒性存 在着显著的对映体选择性，因此有必要先研究氰戊菊酯的手性拆分方法。 手性拆分法主要包括直接结晶拆分法【6 3 、化学拆分法【6 4 1 、生物拆分法和 色谱法。色谱法主要可分为高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 、毛细管电 泳( c e ) 、超临界流体色谱法( s f c ) 、纸色谱( p c ) 和薄层色谱( t l c ) 、毛细 管电色谱法( c e c ) 和高效膜色谱等。本实验使用高效液相色谱法( h p l c ) ，在 纤维素衍生物手性固定相( c h i r a l c e lo j h ) 柱上用非极性流动相直接拆分氰 戊菊酯，目前以纤维素类手性固定相的应用范围非常广【6 6 1 ，但其分离结果不仅 取决于基团间的手性相互作用，还受到固定相空间结构的影响，非手性相互作用 也很复杂【6 76 8 1 。结果得到完全分离的4 个异构体的色谱峰，并详细考察了不同 流动相条件对分离结果的影响。 2 实验部分 2 1 仪器、试剂与样品 l c 一2 0 0 0 高效液相色谱系统( 日本j a s c o 公司) ，配备p u 2 0 8 9 四元梯度 泵，a s 2 0 5 5 自动进样器，c o 2 0 6 5 柱温控制系统，c d 2 0 9 5 圆二色检测器， l c n e ti i a d c 数据采集。 f 己烷和乙醇( 色谱纯，美国t e d i a 公司) ：1 ，2 一二氯乙烷为国产分析纯。 外消旋体氰戊菊酯( 纯度 9 9 8 ) 和高效氰戊菊酯( 纯度 9 9 9 ) 均购于 s i g m a 公司，其化学结构式见图2 1 。 2 0 0 6 年浙江人学坝”l 学位论文 。l 噼一址 。，。，c h 、。， 幽2 1 氰戊菊酯的化：学结构式( + 为手性中心) f i g2 it h ec h e m i c a ls t r u c t u r e so ff e n v a l e r a t e ( + c h i r a lc c r t c r ) 22 色谱条件 正相手性色谱柱c h i r a l c e l o j h ( 2 5 c r n x 4 6 m m ( i d ) 系日本d a i c e l 化学 工业公司产品，粒径5 m m ：流动相流速0 6 m l m i n ；进样量2 0 0 m l ；圆二色检 测器的检测波长为2 3 0 n m 。 3结果与讨论 3 1 手性分离结果 在所用仪器条件下，使用c h i r a l c e lo j h 手性柱，在流动相比例为正己 烷：1 ，2 一二氯乙烷：乙醇= 9 2 ：6 ：2 ：柱温为4 0 的色谱条件下，拆分氰戊菊酯的4 个 异构体的典型分离谱图见图2 2 。 图2 - 2 氰戊菊酯及其高效( s ，s ) 一异构体的手性分离图谱( a 和a 为氰戊菊酯相对应的u v 和 c d 图谱：b 利b 为高效( s ，s ) 异构体相对应的u v 和c d 图谱) f i g 2 - 2h p l cc h r o m a t o g r a mo f e n a n t i o m e r so f f e n v a l e r a t ea n dc s f e n v a l e r a t e ( f i ga ，a ：u v 1 9 2 0 0 6 年浙江人学坝十学位论文 a n dc dc h r o m a t o g t a mo f f e n v a l e r a t e ；f i gb ，b ：u va n dc dc h r o m a t o g r a mo f e s f e n v a l e r a t e ) 32 峰的构型归属 由图a 我们通过各组分的含量可以基本判断出第一和第三个、第二和第四个 色谱峰互为两对对映异构体，再由图a 就更证实了这一判断，它们的c o t t o n 效应 分别互为等量反向。图b 、b 中高效( s ，s ) 异构体的出峰时间和负c o t t o n 效应与外 消旋氰戊菊酯图谱中的第四个色谱峰完全吻合，这样我们还可以认定第二个色谱 峰即( r ，r ) 异构体。但另外一对异构体暂时无法确定其构型归属。 3 3 流动相中乙醇含量对