医学课题开题ppt课件

1 1 开题报告 中性粒细胞诱捕网在支气管肺发育不良的作用及胞外组蛋白拮抗剂对其保护机制探讨 目录 研究背景研究内容研究方案预期结果 研究背景 支气管肺发育不良 BPD 是早产儿尤其是极低出生体重儿最常见的并发症 严重影响其生长发育及生存质量 支气管肺发育不良 BPD 的最新定义 1 任何氧依赖 21 超过28天的新生儿 病理特征 肺泡数量减少 体积增大 肺血管形态改变 微血管发育不良 呼吸道平滑肌轻度增厚 肺纤维化少见 2010年NICHD发布的报告显示 2003 2007年美国20个中心出生体重在401 1500g和胎龄在22 28周的早产儿68 患有BPD 2 轻度27 中度23 重度18 一项中国10个新生儿重症监护室的调查显示 12351个 37周早产儿中1 26 发生BPD 胎龄 28周的早产儿BPD的发生率为19 3 3 发病率高 美国 中国 死亡率高 呼吸系统 循环系统 神经系统都有影响 生长发育受限 预后差 早产和宫内发育迟缓遗传易感性机械通气高浓度氧营养动脉导管开放 PDA 及室间隔缺损 VSD 感染 发病机制和高危因素 BPD患儿气管抽吸液中众多炎性标志物证实炎症反应是BPD发生启动的一个中心环节 Landry等 4 在对1192例早产儿的回顾性分析中发现 新生儿肺炎 脓毒症与BPD密切相关 OR1 9 95 CI 1 1 3 2 OR1 9 95 CI 1 1 3 2 新生儿肺炎 脓毒症 BPD 感染因素 在高氧致肺损伤模型中均存在大量中性粒细胞 PMN 浸润及中性粒细胞诱捕网 NETs 过度形成 并通过释放大量细胞因子 蛋白酶等破坏肺泡上皮细胞及内皮细胞 最终引起肺损伤 通过减少PMN及NETs形成可改善肺损伤程度 高氧致肺损伤模型 中性粒细胞 PMN 中性粒细胞诱捕网 NETs 肺损伤 NETs是由PMN释放到胞外的包含有DNA 组蛋白 髓过氧化物酶 中性粒细胞弹性蛋白酶 组织蛋白酶G的网状结构 Brinkmann等 5 发现 NETs能杀灭病原微生物 而Saffarzadeh等 8 证实组蛋白是NETs发挥作用的关键物质 PMN NETS NDA 组蛋白 髓过氧化物酶 中性粒细胞弹性蛋白酶 组织蛋白酶G 捕获并杀灭病原菌 机体局部出现高浓度NETs NETs相关效应分子将会导致组织损伤 器官功能失调或衰竭 Saffarzadeh 8 等研究发现NETs可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡 其细胞毒性呈剂量依赖性 给予外源性组蛋白 可致肺损伤 肺水肿 肺泡间隔增宽 中性粒细胞浸润 肺出血 11 而肝肾等器官损伤不明显 10 PMN NETS过度 动脉粥样硬化 自身免疫性疾病 血管炎 血栓以及肿瘤性 脓毒症 囊性肺纤维化 哮喘 慢性阻塞性肺疾病 急性肺损伤 ALI 急性呼吸窘迫综合征 ARDS 肺气肿 输血相关性急性肺损伤 可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡 抗组蛋白抗体可结合血液中循环组蛋白肝素 硫酸乙酰肝素可结合循环组蛋白 12 肝素因为高度硫酸化而富含负电荷 组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸 肝素特异性低但高亲和力的静电相互作用可能导致肝素对组蛋白的中和作用 抗组蛋白抗体 肝素 组蛋白减少 改善NETs引起的细胞毒性 髓过氧化物酶抑制剂 组蛋白 是真核生物细胞中染色质的结构蛋白 H1 H2A H2B H3 H4 由细胞凋亡或坏死时染色质发生降解 释放到外周血中产生 由PMN释放NETs产生 组蛋白引起细胞毒性的作用机制 补体激活细胞外组蛋白的完全释放需C5aR和C5L2受体的参与导致C5a受体破坏作用通过钙离子内流引发了细胞毒性诱导髓过氧化物酶 MPO 高氧致BPD发病机制中有PMN过度浸润及NETs的过度形成NETs通过胞外组蛋白 髓过氧化物酶等破坏肺泡上皮细胞及血管内皮细胞 使肺发育受阻 最终导致BPD发生 本课题拟通过检测高氧致BPD模型中NETs及胞外组蛋白含量进一步明确其发病机制 并通过胞外组蛋白拮抗剂 抗组蛋白抗体 肝素 阻断胞外组蛋白来破坏NETs结构 从而干扰其对肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的破坏作用 最终改善BPD 为BPD发病机制及临床治疗提供一定的理论依据 实验构想 高氧致BPD模型 NETs 胞外组蛋白 抗组蛋白抗体 肝素 破坏 治疗BPD 研究内容 1 建立高氧致BPD模型 2 共聚焦成像技术识别NETs结构 3 检测胞外组蛋白水平 4 通过组蛋白拮抗剂 抗组蛋白抗体 肝素 破坏NETs结构 观察肺组织病理变化 研究方案 新生SD大鼠 空气组 BPD组 BPD 外源性组蛋白 BPD 抗组蛋白抗体 BPD 肝素组 4 7 14 21d评价指标 肺组织形态 NETs 细胞外组蛋白 机制探讨 治疗研究 空白对照组 外源性组蛋白 1 给予8 9周的Wister大鼠注入30mg kg 50mg kg 80mg kg牛胸腺组蛋白 2 24小时观察肺病理 提示肺损伤呈剂量依赖性 11 规格 浓度25ug ml 12 2 给予75mg kg 逐渐出现呼衰 心衰 2小时后死亡 10 剂量 抗组蛋白抗体 1 急性肺损伤模型中 小剂量 2 5 5mg kg 中和抗体保护作用不明显 大剂量中和抗体 10 20mg kg 可明显降低病死率 14 2 给予10mg kg 可纠正使用相同剂量外源性组蛋白后引起的肺损伤 10 肝素 硫酸乙酰肝素 10mg kg 保护作用 20mg kg 硫酸乙酰肝素保护作用 肝素加重肺损伤 13 人体组蛋白水平 正常中位数2 3ug ml 四分位数间距0 5 3 6 外伤性肺损伤中位数28 6ug ml 四分位数间距13 7 58 9ug ml 组蛋白大于50ug ml 损伤明显 10 鼠组蛋白水平 外伤性肺损伤后4小时可达到190ug ml 10 剂量 1实验动物 器材和试剂动物实验已得到温州医科大学动物管理和应用委员会的许可SD大鼠 雌性16只 体重220 240g 雄性8只 体重300 310g 购自温州医科大学动物实验中心氧箱 规格 24hHBO 2B型控氧仪 浙江建德梅域电化分析仪器厂 测氧装置 德国EnviteC Wismar 二氧化碳检测仪 电子天平 梅特勒 托利多仪器有限公司检测分度值0 001g 氧气 购买于欧源气体公司 刀片 组织剪 线剪 镊子 胶布 100ul胰岛素针 10ml注射器 冻存管 EP管 离心机 移液枪 酒精 4 多聚甲醛 水合氯醛 无水氯化钙外源性组蛋白 ug ml 抗组蛋白抗体 组蛋白检测试剂盒 ELISA法 蛋白定量试剂盒 硫酸乙酰肝素 材料与方法 2动物分组和模型制备配鼠 按雌雄比为2 1进行配种 即2只雌鼠与1只雄鼠共同放进一个鼠笼 通过阴道涂片找精子细胞作为雌鼠受孕成功的参考依据 及时清洁鼠笼 补充食物和水 雌鼠约孕3周生产 选取子鼠168只 体重6 8g进行实验分组 空气组 A组 BPD组 B组 BPD 外源性组蛋白组 C组 BPD 抗组蛋白抗体组 D组 BPD 肝素组 E组 空白对照组 F组 A B每组各设3小组 每小组12只 C D E F每组各设2小组 每小组12只 空气组 A组 置于空气中饲养BPD组 B组 置于氧箱 91 氧浓度 0 5 二氧化碳浓度 BPD 外源性组蛋白组 C组 处理方法同BPD组 于生后第四天内眦静脉注射外源性组蛋白BPD 抗组蛋白抗体组 D组 处理方法同BPD组 于生后第四天内眦静脉注射抗组蛋白抗体BPD 肝素组 E组 处理方法同BPD组 于生后第四天内眦静脉注射肝素空白对照组 F组 处理方法同BPD组 于生后第四天内眦静脉注射非特异性IgG氧箱内母鼠需每天更换代乳母鼠 防治母鼠氧中毒 A组 B组生后第4 7 10 14 21天 每次取6只鼠的血标本 肺标本 C D E F组第7 10 14 21天 每次取6只鼠血标本 肺标本 予4 水合氯醛腹腔注射麻醉 用100ul针颈静脉取血 5000r min离心10min 留取上清液 置于4 冰箱保存 取肺标本 3只10 多聚甲醛肺灌注后置于盛有多聚甲醛液的EP管内 置于4 冰箱保存 3只取肺取后于冻存管 置于 80 冰箱保存 标本留取及保存方法 动物一般状态 毛发颜色 呼吸 精神及反应 死亡及生长情况 死亡率 死亡时间 体重增长等 肺组织形态学观察不同组肺组织病理变化 取自小鼠左肺叶的组织浸泡在10 甲醛溶液中24h 用石蜡包埋 乙醇梯度脱水 切成4um的切片 采用HE染色后于光镜下观察肺组织形态 RAC 放射肺泡计数 自终末细支气管中心到最近的纤维隔或肺边缘作垂直线 该线上的肺泡个数 计划观察指标 共聚焦成像技术识别NETs结构 分别用中性粒细胞弹性蛋白酶抗体 DAPI及组蛋白H1抗体进行免疫组化染色 并采用共聚焦成像技术观察NETs结构 检测胞外组蛋白水平 以ELISA法检测SD大鼠外周血胞外组蛋白水平变化 主要是H3 H4变化 通过组蛋白拮抗剂 抗组蛋白抗体 肝素 破坏NET结构 观察肺组织病理变化 肺组织PCR WB 计划观察指标 采用SPSS统计软件分析 计量资料以x s表示 采用单因素方差分析 组间多重比较采用LSD t检验 P 0 05为差异有统计学意义 统计分析 实验室 设备 器材 试剂 动物准备充分91 氧浓度下BPD造模成功 稳定制取血 肺标本成功 可行性分析 32 国内外目前尚无NETs在高氧致BPD模型中的作用研究 同时亦无胞外组蛋白在BPD中的作用研究 通过研究 可以为防治BPD找到新的方法 为临床治疗BPD提供新的思路 特色与创新之处 血是否需非特异性的IgG抗体或生理盐水作为对照组 实验中外源性组蛋白 抗组蛋白抗体 肝素是否可以设置浓度梯度进行实验 除了测定血液中的组蛋白浓度 是否还需测定其它的一些指标 髓过氧化物酶 MPO IL 6 IL 8 血浆游离NDA cf DNA 空气组 高氧组已经做过实验 是否可以用之前实验的材料 目前可用的氧箱最多只能容纳4组 因此需高氧造模的子鼠需分批进行实验 组蛋白引起的急性肺损伤会导致凝血功能障碍 肺血栓 肺出血 而BPD不会 共聚焦技术还未掌握 存在的问题 预期结果 血组蛋白测定结果 同一日龄 BPD 外源性组蛋白组 BPD组 空气组 BPD 抗组蛋白抗体组 BPD组 BPD 肝素组 BPD组 BPD 抗组蛋白抗体组 BPD 肝素组 空气组对比 得出组蛋白对细胞及肺血管内皮的毒性作用作为BPD的发生发展中的因素抗组蛋白抗体 肝素的应用能够阻止BPD的发生发展 预期结果 36 年度计划 2015年7月 2015年9月完成空气组 高氧组标本获取 2015年10月 2015年12月完成实验组 对照组标本获取 2016年1月 2016年2月完成血浆组蛋白测定 肺组织病理切片 PCR WB 2016年3月 2016年6月数据整理分析 论文撰写 参考文献 1 JobeAH BancalariE Brenchopulmonarydysplasia J AmJRespirCritCareMed 2001 163 7 1723 1729 2 StollBJ HansonNI BellEF eta1 EuniceKennedyShriverNationalInstituteofChildHealthandHumanDevelopmentNeonatalResearchNetwork NeonataloutcomesofextremelypreterminfantsfromtheNICHDNeonatalResearchNetwork J Pediatrics 2010 126 3 443 456 3 早产儿支气管肺发育不良调查协作组 早产儿支气管肺发育不良发生率及高危因素的多中心回顾调查分析 J 中华儿科杂志 201l 49 9 655 662 4 LandryJS MenziesD Occurrenceandseverityofbrenchopulmonarydysplasiaandrespiratorydistresssyndromeafterapretermbirth J PaediatrChildHealth 201l 16 7 399 403 5 BrinkmannV ReichardU GoosmannC eta1 Neutrophilextraeellulartrapskillbacteria J Science 2004 303 5663 532 1535 6 vonKSckritz BlickwedeM Goldmann0 ThulinP eta1 Phagocytosis independentantimicrobialactivityofmastcellsbymeansofextracellulartrapformation J1 Blood 2008 111 6 3070 3080 7 KawasakiH 1wamuroS Potentialrolesofhistoriesinhostdefenseasantimicrobialagents Jj InfectDisordDrugTargets 2008 8 3 195 205 8 SaffarzadehM JuenemannC QueisserMA eta1 Neutrophilcxtraeellulartrapsdirectlyinduceepithelialandendothelialcelldeath 8predominantroleofhistones J PL