（生理学专业论文）南方鲇延脑神经细胞培养及其生理研究.pdf

中山大学坝+ 学位论文 南方鲇延脑神经细胞培养及其生理研究 号业：生理学 硕士乍：张碧任 指导老师：龙天澄副教授 摘要 延腩是味感觉1 入的中继站，其。p 而叶和迷走叶是味并：琏本r r 枢，延蝻神绛 细胞膜的特一陀，尼其是跨膜信号转导有天的离r 通道的特r 阻决定着延脑味觉初级 叶 椒对味觉信号的接受和处理。南力鲇( s i l u r u sm e r i d i o n a t i sc h e n l 生活在浑浊的水 1 不境一 ，强大的味觉感觉在摄食中起了灭键的作用，所以味觉系统比较发达。由 i ：缺乏埘南方鲇味觉干j j 级中根这系统的j 解，t 今味觉中秆旧拧。，摄食行为的 火系仍小清楚。我们首先探索南方鲇延脯神经细胞的分离祭什、建、- ：分离的实用 力；，、，川j i 展了神经细胞离体培养研究；由j 一膜上的乜；，( ? 力足信i ：传导的基础， 我仃1 采州了膜片钳技术进行了南方鲇延脑神经绌胞表达离了通道和电，+ - 理特征研 究，为进一步卉清摄食行为与味觉中枢活动的关系打r 基础。 奉研究的1 二曼结果如卜： 1 、首次建辽起南方鲇延脑神经细胞的分离的实用力 上。根据细j 包的形状、胞 体的大小，南方鲇延腑神绎细胞i 叮分为三种类刑：劂形神经细胞、椭同形 神经绌胞和锥形神经细j 】包。 2 、探索南方鲇延脑神经细胞离体培养的条件，研究发现：南方鲇延腩神经 细胞和：18 2 8 之间均能生长，但n ：2 4 。c 2 8 之叫细胞生长最好， ： 2 时细胞生长迅速但萎缩迹象出现得也1 l 。培养液的d h 存6 q 80 的范吲内刈南方鲇延脑神经细胞的体外培养影响斤1 i 显若。在这一范围内 细胞牛长i r 常，最适p h 为7 2 7 4 。不i 叫血清对神经细胞并没何显著 的影响。鱼血清加迸 胎牛血清芡叫作用的 卉养液略好f 其他m 清，但并 没有显著差异。le i b o v i z 、sl - 1 5 培养基采用了与众小刊的b s s 作基础， 它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，所 中i i i 大学碗i 一学位论文 以额外添加2 m m o l l 谷氨酰股、1 0 m m o l l 葡萄糖、2 巯基乙醇时，埘冲 经绌胞的生长行没有明显的作心。 3 、首次利用膜片钳技术对急性分离的南方鲇延脑神经细胞进行了钊f 通道的 电生理特征研究。住细胞吸附模式、左极化i u 以激活一个电导为2 4 p s 的 钾离子甲通道；单通道电流幅度、j 放时间、丌放概率均受膜电位摔制， 通道丌放时叫分布直方图可用双指数拟合，尢时叫依赖件失活，表明此通 道iu 能为延迟整流霉ok 通道。在全细忸电门j 钳模式下，南方鲇延腑神纤 细胞表达4a p 敏感钾通道。钾通逝电流在4 0 m y 左右被激活。快钾通道 电流对4a p 敏感，f 日4 - a p 小能完全断快纠通道电流；慢钟通通电流刈 t e a c 1 不敏感。 关键词：南方鲇，延脯，急性分离，离休培养，膜j i 钳技术 中山大学硕士学位论文 t h ep r i m a r yc u l t u r ea n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s o ft h ep r i m a r y g u s t a t o r yc e n t e ro fc a t f i s h ，s i l u r u s m e r i d i o n a l i sc h e n a b s t r a c t m a j o r ：p h y s i o l o g y a u t h o r ：z h a n gb i y u s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f l o n gt i a n c h e n g t h em e d u l l ao b l o n g a t ai sa na f f e r e n tr e l a ys t a t i o no ft a s t es e n s et h ef a c i a ll o b e a n dv a g a ll o b ea r et h eg u s t a l o r yc e n t e r t h ec h a r a c t e r i s t i c so f m e d u l l ao b l o n g a l an e u r o n m e m b r a n e ，e s p e c i a l l yt h ec h a r a c t e r i s t i c so fi o nc h a n n e l sr e l a t e dt os i g n a lt r a n s d u c t i o n ， d e t e r m i n et h eg u s t a t o r yc e n t e rh o wt od e a lw i t ht h es i g n a l s c a t f i s hh a v eah i g h l y s e n s i t i v e ，l a r g eg u s t a t o r ys e n s et h a tp l a y sac r i t i c a lr o l ei nt h es e a r c hf o rf o o di nm u d d y w a t e r s d u et ot h el i m i t e dk n o w l e d g eo nt h i ss y s t e m ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt a s t e c e n t e ra n df e e d i n gb e h a v i o ri ss t i l lu n k n o w n t h ea u t h o rs t u d i e dt h ea c u t e l yd i s s o c i a t e d c o n d i t i o no fm e d u l l ao b l o n g a t a ，a n dc a r r i e do u tt h ep r i m a r yc u l t u r eo fn e u r o n s ；t h e e l e c t r i c a la c t i v i t yo fn e u r o n sm e m b r a n ei st h eb a s i so fc o m m u n i c a t i o n p a t c hc l a m p r e c o r d i n gt e c h n i q u ew a su s e dt os t u d yt h ep r o p e r t i e so ft h ev o l t a g e g a t e di o nc h a n n e l s e x p r e s s e db yt h ea c u t ed i s s o c i a t e dn e u r o n s t h i sr e s e a r c hp r o v i d e db a s i sf o rf u r t h e r s t u d yo ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt a s t ec e n t e ra n df e e d i n gb e h a v i o r t h ef o l l o w i n g r e s u l t sm a i no b t a i n e dj nt h i sw o r ka r es u m m a r i z e db e l o w ： 1 am e t h o df o r d i s s o c i a t i n gm e d u l l ao b l o n g a t a n e u r o n so fc a t f i s h ，s i l u r u s m e r i d i o n a l i sc h e nw a sf o rt h ef i r s tl i m ee s t a b l i s h e d 。t h r e et y p e so fn e l l r o n sw e r e d i s t i n g u i s h e do nt h eb a s i so fs i z ea n df o r mo fs o m a ，s u c ha s “r o u n dn e u r o n s ”，“o v a l n e u r o n s ”，a n d “p y r a m i d a ln e u r o n s ” 1 1 中山人学硕上学位论文 2 c o m p a r i s o no fas e r i e so fc u l t u r i n gc o n d i t i o n sw a sd o n e t h er e s u l t ss h o w e d t h a it h eb e s tt e m p e r a t u r ew a sb e t w e e nt w e n t yf o u ra n dt w e n t ye i g h tc e l s i u sd e g r e e ；t h e b e s t p hw a sb e t w e e n7 2 a n d7 4 ：t h es e r u m sh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ；a n dt h e a d d i t i v eh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 3 t h e p a t c hc l a m pt e c h n i q u e w a sf i r s tu s e dt o s t u d y t h e p r o p e r t i e s o ft h e v o l t a g e g a t e di o nc h a n n e l se x p r e s s e db yt h ea c u t e l yd i s s o c i a t e dn e u r o n so fm e d u l l a o b l o n g a l a n e u r o n so f c a t f i s h ，s i h 0 1 t t s m e r i d i o n a l i sc h e n i nc e l l a t t a c hm o d e ， d e p o l a r i z a t i o nc o u l da c t i v eas i n g l ek + c h a n n e lc u r r e n t sw h i c hc o n d u c t a n c ew a s2 4 p s ： 7 l h ec u r r e n t sa m p l i t u d e ，t h em e a no p e nt i m ea n dt h eo p e np r o b a b i l i t yw e r ed e p e n d e n to f n t c n l b r a n e p o t e n t i a l ，t h eo p e n t i m ed i s t r i b u t i o n h i s t o g r a m s w e r ef i t t e d b y t w o e x p o n e n t i a lc o m p o n e n t s ，a n dt h ec h a n n e la c t i v i t yw a sn o ti n a c t i v a t e dd u r i n g3 0 s p e r i o d t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es i n g l ec h a n n e lw a sad e l a y e dr e c t i f i e r ( 1 k ) u n d e r v o l t a g ec l a m p ，4 - a p s e n s i t i v ec u r r e n ta n dt e a c i - i ns e n s i t i v ec u r r e n tw e r ee x p r e s s e d t h eo u t w a r dk + c u r r e n tw a sa c t i v a t e da t 一4 0 m v k e yw o r d s ：s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ，m e d u l l ao b l o n g a t a ，a c u t e l yd i s s o c i a t e dn e u r o n s p r i m a r yc u l t u r e ，p a t c h - c l a m p i v ! i ! l 叁兰堡生兰垡堕茎一 缩略词 ( a b b r e v i a t i o n ) 人【：脑脊液( a r t i f i c i a lc e r e b r o s p i n s ls o l u t i o n ) 4 一氨基吡啶( 4 一a n a i o p y r i d i n e ) _ 尺( d a y ) 己版四乙酸( e t l l y l e n ed i a l n i n et e t r aa c c t i ca c i d ) 乙崞肚乙酸酯( ec h y i e n eg l y c o lb i s ( 2 一a m i n o e t h y le t h e r ) t e t r a a c e l i ca c i d ) 胶质纤维酸性蚩l q ( g l i a lf i b r i t l a r ya c i d i cp r o t e i n ) 小时( h o u r ) 4 y ：垒乙暴哌嗪乙磺酸( n 2 h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n ：2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d ) 瞬时钾r 乜流“a p i do u t w a r dp o t a s s i u mcl n l _ c n t s ) 延迟整流州剀通道电流( d e l a yr e c t i f y i n gp o t a s s i u m c ur r e n t s ) 磷峻缓冲盐液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) d 多聚赖氨酸( p o l y d l y s i n ) l - g 聚赖氨酸( p o l y l - l y s i n ) l 1 5 培养基n e i b o w i t zc u l t u r em e d i u m ) 分 中( m i n u t e ) 毫摩尔( m i l l i m o l e ) 四甲基偶氮唑盐( 3 - ( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 一2 一y l - ) - 2 ，5 一d l p h e n y lt e t r a z o l i u mb r o m i d e ) 神经微丝蛋1 刍( n e u r o f i l a m e n t ) 氯化四乙铵( t e t r a e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e ) 河豚毒素( t e t r a d o t o x i n ) 微丁f ( m i c r o l i t r e ) 微米( m i c r o m e t e r ) 微摩( m i c r o m o l e ) v 【 一 。 一 一 一。 一 h k 峨 吼 眦 ! 耋 心 州 岍 忡 一 似 川 肿州 中山人学硕上学位论文 第1 章引言 1 1 神经细胞培养的研究概况 神经细胞的原代培养是近几十年才建立和发展的一种实验技术。用体外培养 小同脑组织的神经细胞进行实验，可排除整体动物或脑片模型造成的实验误差， 虹清楚地了解药物对神经细胞的损伤或保护作用，同时原代培养又比那业住休外 多次4 代的神经细胞株更能代表体内的神经细胞的【卜常发育状念。因此神经细胞 原代培养已经成为研究神经细胞形态和功能、生长和发育、损伤和再牛及缺血等 生理、病理变化及其影响冈素的重要方法之一( 薛庆善，冯武鸣，1 9 9 6 ) 。 1 9 5 6 年，n a k a i ( 1 9 5 6 ) 首创了神经组织的分离细胞培养方法。【1i u 神经培养系 统人部分是以脊椎动物作为模式动物，如人鼠、小鼠、家鸡和爪蟾等( s o r e ns l a n d e r s e n 一2 0 0 2 ) = = b a r b a r ak a r t e ne ta 1 ( 2 0 0 5 ) 用大鼠的交感神锋几1 j 小鼠的交 感神纤亿技大鼠的视网膜神经节细胞芪培养来研究脂质的代谢和嶙运。以鱼为实 验模犁柬进行神经细胞培养的报导较少，大部分足以鱼的胚胎和幼伍乃材料进行 培养的，而且能够成功培养神经元的更是鲜为少见。t o c h e ra n dw i l s o n ( 1 9 9 0 ) 首次 从虹鳟龟( r a i n b o w t r o u t ) 分离和培养了星形胶质细胞；另外只有j e s e r i c ha n d r a u e n 【1 9 9 0 ) 及s i v r o ne ta 1 ( 1 9 9 2 ，1 9 9 3 ) 也曾报道过从孵化的硬骨鱼大黾分离和培养 胶质细胞的相关研究；f r o i d oe ta 1 ( 2 0 0 2 ) 用虹鳟鱼幼鱼鱼脑进行细胞培养，培 养了星形胶质细胞，而神经儿很难存活。为了解决上述问题，本研究以成年的南 力鲇( s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ) 的初级味觉中枢神经细胞为实验材料，致力于摸 索出鱼类中枢神经细胞培养的一系列条件，以期建立一种培养鱼类神经细胞的方 法 1 2 中枢神经系统离子通道研究概述 神经细胞培养提供了实验的材料，然而继续进行神经细胞的生理特性研究 中山大学硕士学忙沦文 我们斋要了解从细胞水平及生理特性方血研究神经钏胞的片浊。 1 2 1 神经细胞膜的特性 神纤细胞是神经系统的基本结构和功能千f t ，是形态各异、功能复杂、所含 化学物质繁多的特化细胞。神经细胞膜内和膜外有电位差，膜外为正，膜内为负， 称为膜电位。 神经细胞膜的静态特性：神经细胞膜姓角仃信号传导过程中不发_ i 变化慨挣 态( 被动) 电学特性( 韩济生，1 9 9 9 ) 。这些恒定的特一i + k 受非门控离子通道的电导、 膜l 巳容和胞浆的电导等三因素的制约。神经细胞膜j 以等效成由电池、电阻、导 体、电容和电流发生器组成的电路。神经绌胞膜内外离子的不均匀分，币是膜电动 势的来源，脂质双层中的离子通道对荷电离了f 内进膜运动具有十l t ；q 选择性： 于离子在脂质双层中溶解度低，脂质双层本身儿乎足个完美的绝缘体。然而由 j 自成tj 一万个非门控离子通道镶嵌存膜内，即使住静息状态下，离了电不断地 漏进或漏山，致使静息状态卜膜电导( 膜电阻旧例数) 比纯脂质双层的电导要大 口j 见，儿乎无全绝缘的脂质舣层被数以1 - 川h j j ll ! 导通路一非fj 控通道所垃j l ! 。 非门挎通道与膜上fj 控性离子通道的”关调i ，膜【包导的大小；神经细胞膜的脂质 删层段其两侧的电解质构成膜电容器。神绎元的导体为其膜西侧的细胞内外液， 绝缘体为膜本身，特别是膜的脂质双层，二者形成相当典型的平行板电容器。膜 电容与膜电阻形成以阻容偶联为特征的等效电路，能够延缓神经信号的传导时程； 神经元膜的n a + 一k + 泵起到电流发生器的作用。静息时，n a + 、k + 总是分别通过各 白的被动通道稳定地流入膜内和流出膜外，如果没有一种相反的过程r 以抗衡， n a + 、k + 将分别存细胞内外侧堆积，最终导致e n 。和e k 均为零+ 为防止这种情况发 牛，n a + 一k + 泵需不停地活动，手动、及叫、并准确地与n a + 、k + 离子被动通量相 平衡，使通过n a + 、k + 通道运动的n a + 电流和k + 电流分别与由n a + 一k + 泵驱动的 n a + 电流和k + 电流大小相等，方向相反。静息膜电化就是由k + 以及部分n a + 通过 各自非fj 控通道的被动扩散和n a + 一k + 泵的 动活动共同作用、精确平衡米保持 稳定和恒定。 神经细胞膜的动态特性：神经细胞膜活动或兴奋的最具特征的标志是动作电 位。典喇的动作电位的产生决定于电压门控的n a + 、k + 通道先后丌放。当去极化 中山人学硕_ i 学位论殳 使足够的n a + 通道升放时，n a + 进入细胞并使膜进一步玄极化，肩动锋电f t 再生1 陀 增长。接着去极化使n a + 通道失活并使更多的k + 通道丌放刚，膜复极化，锋电位 终止。n a + 、k + 通道是i 巳压门捧通道中机能最重要的通道，其机能特性jj 通道蛋 白质的分子构造相关。n a + 通道介导可兴奋细胞信息的快速转移，k + 通道加快复 极化，缩短动作电位的时稃。n a + 、k + 通道分子内的特化区域参与门摔和药理学调 制。电生理学方法和分子生物学力法的结合已经揭示出，n a + 、k + 通道n 螺旋的 s 。区富含j f 电倚，起电j f 、感受器的作用，对电场或去极化敏感，触发通道的激洱 过程；n a + 通道a 螺旋功能区1 1 1 、之间胞内襻的“饺链盖”样动作和k + 通道的n 、 c 术端利p 区的“球与链”运动分别主要触发两揣的失活过程。揭示f | | 经目l m 世 膜动态特性的分子皋础的研究还在目益深化。 神经兀存没有信息输入，也没有信息输出时，处于静息状态，此叫的膜 h 何 称为静息电位。正常白，j 静，亩、屯化约一7 0 m v 。神经元的膜电位从静息r 乜_ 伸同l r 偏移 时称神经二处于兴奋状态：膜电位从静息电位向负偏移时称神经元处于抑制状念。 在任一时刻，神经元总是处丁i 一述3 种状态之 1 2 2 用于神经系统研究的主要电生理学方法 一般认为电，卜珲学发源丁1 7 9 1 年。它基本 ：足随着电学仪器的进步而，履肥的。 本世纪4 0 年代以来，英幽剑桥大学h o d g k i n 学派利用微电极技术而且选用理想的 实验标本枪乌贼的巨辅突，建市了动作电位的钠学说，恻明了神经冲动的f e 导理 论。约存同时期，f o r b e s 、r e n s h a w 等运用微电极开始了研究中枢神经系统神经 元活动的r 作。h o d g k i n 等人为精确测量神经活动中的离子运动，发展了电门：钳 ( v o l t a g ec l a m p ) 技术，在此摹础上，n e h e r 和s a k r n a n n 又发展了膜片钳( p a t c h c l a m p ) 技术，为从分了水平了解牛物膜离子通道的丌、关动力学与通透性和选 择性提供了直接手段。神经科学的发展始终是和电生理技术的发展紧密联系在一 起的。 细胞外址录( e x t r a c e l l u l a rr c c o r d i n g ) ：细胞外记录足把引导电极安放住神经组 织的表面或附近引导神经组织的电活动。由于活动部位的神经元产生去极化，木 活动的部位处于f 常极化状态，在容积导体中的两部位问电位不同，吨流从一点 流向另外一点。放置于细胞表面的电极就会记录出两者之间所产，卜的电位筹。细 3 中山人学硕l 学位论文 胞外微电撇记录的方便之处任于电极小捅入细胞。用于细胞外记求的叱撇缘j 坡 璃微电极外，金属微电极也比较合适。细胞外记录所记录纠的电位比细胞内址求 的要小的多，这是j 信号受低电阻的细胞外液通路分流所致：”外细胞外i 已求 的波形会凼记录细胞的不同部位而有所小同，所以刈地外记录电1 寸的分析再点放 住放电频率和潜伏期，而不去比较放电的幅度。 细胞内已录( i n t r a c e l l u l a rs i n g l eu n i tr e c o r d i n g ) ：记录膜电位，需存膜的两侧 各胃个电极形成一个环路，冈此一个电极要插入细胞内。这种址j j t 方法韵；为钏 胞内m 录法。细胞内记录法可以准确地测量膜电位的绝对值。细胞内记录技术的 f u 世，使人仃j 舒以研，t 个别单一的神经细胞的机能活动、伸经儿f 膜的尘物物州特 性以及有父个别神经儿在神经元叫路叶1 的位置和作用。通过i _ 录单个细胞在仃为 活动或环境影响卜的细胞内反应，不难分析其机能活动及其与行为和j = 小境变化的 关系；通过记录个别神经元在细胞内刺激作用f 所j 。，卜的细胞内反府，可以细致 地l ，解到神经元膜的被动特性利主动反应，如膜的静息电位和动作电位；企细胞 内记求的基础上向细胞内注入示踪剂，不但可以清楚地观察到有灭神经i 的细微 结构，m u f 以将神经无的结构和机能联系起来。 电爪钳技术( v o l t a g ec l a m p ) ：离子通道是细胞膜的结构之 ，它的活动足细 胞各种，l 理 舌劫的基础。山于离子通道的活动形成在膜两侧的电子分伽态势，这 种态势和侄小同状态f 的动态变化是神经细胞兴奋性、电信号的产生以及几乎全 部电活动的原冈。离子流过通道形成的离子流是形成动作电位的基础。伍多数电 ，：碑实验中是以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电1 ：以 确定离子通道的状态。但在形成动作电化时所产生的离子流可影响膜电位，而膜 电f 讧的变化又会影响该离了的通透性的变化。冈而人为地使膜电位在一定时问内 维持在个尉定的水半，是解决这问题的办法。电压钳技术是通过插入细胞内 的一根微电极向细胞内补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流 这样即使膜通透性发：j 二改变时，也能控制膜电位数值不变。 为了了解不同离子在细胞活动过程中的跨膜流动规律，可在电压钳的条件卜， 通过细胞内记录技术，将预研究的单一离子流从其他离r 流中分离出来。 电压钳是一个负反馈系统。利用离子通道，f 关的电压依从性，电压钳址录采 用灵敏的负反馈的放人器，用胞内或轴突内注入电流的方法，人为地将一定空叫 4 中山人学硕上学位论文 的细胞膜的膜电位钳制在某水平并保持一段时问，即川选择性地激活某高子 通道活动，研究有关的某一跨膜离子流。在电位钳制期间，由于膜电位恒定不变， 从而消除了膜电容器充、放电引起的电容电流对跨膜离厂l b 流的污染；7 j 膜电位 恒定的条件下，i 1 ：入电流的大小，通过负反馈机韦i ，恰好等j j 跨膜离子流的电流 量，从而可据以测出有关离子流的方向、振幅和h , j 程，并以及囱关离了通道的肩 闭规律， 脱片钳技术( p a t c hc l a m pr e c o r d i n g t e c h n i q u e ) ： l ! i 、川技术是拧制吟膜 乜何求 研究离子通道的理想技术，但它还不能测定甲一离子通道电流。于电爪钳钳制 的膜【 l 积f 陡人，包含着人量随机丌放和父闭的通道，向且背景噪声大， t f f 掩r 精 了单通道的f 也流。尤其对体积小的细胞进行r 乜_ 肛针 实验，技术上有更大的困难。 1 9 7 6 印德国的n c h c r 和s a k m a n n 发展了膜片钳技术0 妙地解决了这叫题，为此 他们获得1 9 9 1 午诺儿尔生理学一医学奖。膜片$ h 技术的核一心是能够记录单离了 通道的电流u r 以卣接记录和分析单离子通道的离f 电流( 瞄i 军，2 0 0 1 ；康华光， 2 0 0 3 ) 。，膜片钳技术绎过与分子牛物学技术的结合以及州选用实验标本的扩大，它 l 被广泛j 越干jf q i 物科学领域，成为能够研究细胞膜巾l p 蛋i 赝分f 的助能状 态的唯电牛埋技术，迅可观察突触传递、分泌细胞的分泌 占动机制、利用碳纤 维电极占接记录分泌囊泡的分泌物等；利用它研究药物和毒物的作1 l j 机制也是对 临床工作非常有益的i 具。膜片钳的多种技术已应用到多种细胞和离子通道的研 究中。例如对1 3 4 1 爪蟾卵母细胞和能表达离子通道细胞的单通道分析，对探查离 子通道的分了基础特别重要。膜片钳技术在深入揭示中枢神经系统的复杂相互作 用中已经硅示出它的独特作用。关于膜片钳技术的原理和应用将在后面的章节中 加以洋细介绍。 1 2 3 离子通道研究概况 离子通道( i o nc h a n n e l s ) 是细胞膜的结构之一，它的活动是神经、肌肉和其 它组织细胞膜兴奋性的基础。离了通道的重要功能之一是产生生物电，存此基础 上彳进步派生出递质释放、信息传递、腺体分泌、肌肉舒缩、细胞分裂、生殖， i - 乃至学习和记忆等重要生理功能( 李国彰，2 0 0 3 ) 。 离子通道是一类镶嵌于膜上的人分子蚩白质。在一定条件下，这类蛋白质分 中山大学硕士学位论丈 子构掣的改变可以构成通过无机离子的# l f l i l ，称为离r f 通道f 弓原野，工建红， 2 0 0 3 ；郑新民，2 0 0 3 ) 。离子通道的是本特性足对离r 的特异性和对调节的易感眭： 拍者使不州的离厂通过不同通道跨膜流动，后凿使通道接受小同刺激的渊节，使 信号的传送具有高度的灵活性。有。些高f 通道总是处r 外放状态，允许离了随 叫出入，不受有关外界信号的控制。这些通道属丁被动的非门控性离了通道。但 人多数离了通道大部分时间内是关闭的，只足存r 乜压、化学( 以至机械性) 信号 刺激下，4 处丁丌放状态，这种现象称j = f = j ；。g a t i n g ) 这些通道属j ：主动的门拧 i 生通道。通道蚩门构象变化是门控的基础。离子通道的| ：放引起的细胞内外离子 的流动足细胞兴奋的基础，在细胞的刺激一分泌揣戕过柙中发挥着重要作用。， f 1n c h c r 和s a k m a n n 建立膜片 ；| 技术以柬，对离f 通道的研究已经积累了大 星的资料。已住动物、植物和微生物的备种细胞中发现了近百利i 离子通道。按离 f 通道的滤过器的离了选择性将它们分为阳离子通道和阴离了通道，并且两类通 道都允们：水分子通过。目前常用的是根据感受点所接受的动l 到的性质，刚闸门的 调控方式进行分类。列膜电位变化敏感，因膜电f t 变化 j 盯或关闭称电j f i 门控性 通道( v n l t a g e g a t e dc h a n n e l ) 。电j 且门控h 通j 邑义称为电爪依赖。1 ：通道 ( v o l t a g e d e p e n d e n tc h a n n e l ) ，广泛分佃f 拜炎兴台膜上，它们按最易通过的离f 命名，如：钠通道、铡通道等。纠一类为配体l 膜受体结介后打外的化学门控。阽 通道( c h e m i c a l g a t e dc h a n n e l ) 。化学门摔通道又称为递质敏感性通道 ( t r a n s i m i t t e r s e n s i t i v ec h a n n e l ) ，局限于突触厉膜歼坂递质命名，如：乙酰胆碱受 体通道、谷氨酸受体通道等。这种区分并非绝对，神经递质u 调制某些电压fj 控 性通道的活动，化学门控性通道也受膜电位的影响。 电压依赖性离子通道是神经元和其它可兴奋细胞赖以j “。t - 可传导电信号的结 构基f | f 。燎丁n a + 通道在动作电位传播中的重要作用，对n a + 通道所作的研究最多， 也最深入。但由于神经生物学家己汴意到信号整合和町塑性等更为复杂的过程， z 十k + 、c a h 通道重要性的评价已1 3 趋增多。k + 通道能控制兴奋性和电信号的形式； c a 二+ 通道能调节细胞内c a 2 + 水平，从面触发递质、激素的释放和调制其他细胞功 能。关于二钟通道的结构和类型、分布简述如下： 钾离子通道( p o t a s s i u mc h a n n e l s ) 是细胞内k + 外流引起外向电流或k + 内流目1 起内向电流的离了通道，而月也是f 1 前发现的亚犁最多、作用最复杂的类离子 中山大学硕士学位论文 通道。一般将k + 通道分为4 种基本类型：电压f j 控k + 通道t v o l t a g e g a t e dk + c h a n n e l ) ；钙激活k + 通道( c a l c i u ma c f i v i t a t e dk + c h a n n e l ) ：配体门控k + 通道 ( 1 i g a n d g a t e dk + c h a n n e l ) ：第一信使细胞内代谢物门摔k + 通道( s e c o n d m e s s e n g e i n t r a c e l l u l a rm e t a b o l i t e g a t e dc h a n n e l ) ，如a t p 敏感k + 通道( a t p s e n s i t i v e k + c h a n n e l s ) 。电压门控通道中研究最多的足延迟整流钾通道( d e l a y e dp o t a s s i u m c h a n n e l s ) 又称晚钾通道，早钾通道( e a r l yp o t a s s i u mc h a n n e l ) 又称快钾通道。晚 钾通道在去极化后驯( 膜电位3 0 m v ) 被激酒，穴酒1 f 常缓慢= 晚钟电流( i k ) 是动作电化后期膜复极化过捏中外向电流的主夏成分，故l k 的，煲化对动作电位f 向 形态有重要影响。早钾通道是一个由6 1 6 个氦基酸残基组成的多肽，有6 或7 个 跨膜区，类似n a + 通道4 个功能区r f l 的个。早钾通道存去极化早期( 膜 也f 讧比 6 0 m v 稍l j ) 被激活，并迅速失活。甲钾电流i 。主要调节静息膜必裔性，减慢去 极化速度，延缓动作电位，。，i - ，l , j - 使重复放电神经元呈现缓慢放r b s ；r z 象。山 一9 1 i 通道缺乏高亲和力的配体，日前 要根据离子选择性和季胺类药物阻滞钾通道的 动力学研究钾通道结构。常用的钾通道阻断剂为p u 乙胺和4 氨牿吡啶。p u 乙版 ( t e a ) 抑制各类兴奋膜的剀电流，作用迅速向n j 逆，但所需药物的浓度和给药 途径差别甚大。 钾通道有多种类犁，每种都有独特的电生理学和药理学特性。它们的共同之 处足把膜电位稳定存钾的甲衡电位。钾通道分布相当，“泛，在绝大多数细胞包括植 物甚下甲细胞的原核，卜物都有钾通道。可以说，可兴奋细胞的电牛理信号在很大程 度上是由细胞的小同钾通道决定的。电爪门控性钾通道是神经细胞膜兴奋性的重 要决定凼素( p o n g s ，1 9 9 9 ) 。电牛理研究晶示大多数哺乳动物的神经细胞表达多种 类型的电压门控钾离子通道，这些钾通道具有显著的时阳j 和电压依赖性 ( r u d y , 1 9 8 8 ；s t o h n ，1 9 9 9 ) 。然而鱼类神经细胞这方面的资料很少，所以我们进行 了南方鲇延脑神经细胞的钟通道的初步膜片钳研究，为填补鱼类神经细胞离子通 道的研究提供一些资料。 1 3 鱼类味觉相关的神经细胞功能研究 神经系统在鱼类的一切正常活动过程中起着协调与联络的主导作用及决定作 用，神经分m j 广，信息传递迅速。鱼类脐己分化为端脑、问脑、中脑、小脑、延 中山大学蛳 十学位论文 脑等。其中延脑是极为匹要的部分，包括了多方向的神经巾舨( 秉志，i k ：j ) 。延 脑的而叶和迷走叶足味觉中楸，具发达味蕾的鱼，如鲤鱼、鲇等，这两部分尤其 显著( 见图1 1 ) ( 赵磊等，2 0 0 5 ) 。 | 冬】1 1 南力鲇矩脑示意幽，a 为照片，r 为模式h 。 许多动物物种摊有精细的感觉系统，能够在寻找食物的叫候起到定位的作用。 例如，电鱼用电感受器米侦测和定位食物( b u l l o c k ，1 9 8 2 ) 。鲇科鱼类( l 汗浊的 水环境中，它的非常敏感义夫的味觉感觉在：找食物中起了关键的作崩( - c k ， 1 9 0 j 、1 9 0 4 1 9 0 5 ：r 。1 r 【i 。h 、hp t l l ，1 9 6 7 ：al c m a ，1 9 7 1 ：c a p r i oe tr 1 】，1 9 9 3 v a l e n t i n c i ca n dc a p rl 一) t 9 9 ： ) ，鲇科值类几外的味觉感受器剥氨基酸似敏感 ( c 挂p i ，1 9 7 5 ，1 9 7 8 ) ，这此味觉感受器投射到延脑的初级味觉核的露时( f in g ， 1 9 7 6 ：m a r u ia n d c a p r i01 9 8 2 h a y ；i r n aa n dc a p r i o ，1 9 8 9 ) 。 味觉产牛离个歼神经的传导近年来d a y i d 等研究证实，口腔的味觉刺激通过 味觉细胞顶端微绒毛上的膜受体和离了通道的相互作用，导致化学信号( 神经递质) 释放，外周味觉神经元接受信号并向大脑传送，“乍味觉( 杨建民，2 0 0 4 ) 。 目前，味觉系统的研究，主要集中住外部感受器及其受体的研究。例如，龙 天澄( 1 9 9 4 ) 研究胡子鲒触须味觉的行为和电牛理测试，革胡子鲇触须和 - i 腔黏 膜上味觉器官。a v e n e ia n dl i n d e m a n n 等人进行了两栖类味觉感受器细胞的膜片 钳研究( a v e n e ta n dl i n d e m a n n ，1 9 8 7 a ；b g i a n ia n dr o p e r ，1 9 9 3 ；b i g i a n ie la 1 ，1 9 9 6 ； f u j i y a m ae la 1 ，1 9 9 4 ；k i n n a m o na n dr o p e r ，1 9 8 7 ，1 9 8 8 a ；m c p h e e t e r se ta 1 ，1 9 9 4 ； m i y a m o l oe la 1 ，1 9 9 1 ；s u g i m o l oa n dt e e t e r ，1 9 9 0 ) ：t e c l e r 等人进行了鲇科鱼类的 u 束觉感受细胞的膜片钳研究( t e c t e re t a l ，1 9 9 3 ；m i y a m o t o ，s a t o ，a n dt e e t e r ，1 9 9 8 ) 。 还有就是从解剐学和电生理学l 一束研究外部味觉系统与巾枢的投射问题f h e r r i c k ， 1 9 0 5 ；f i n g e r ，1 9 7 8 ；m o r i t aa n df i n g e r , 1 9 8 5 ) 。 中山人学硕上学位论文 1 4 本研究的目的和意义 南力鲇( s i l u r u sm e r i d i o n l i sc h e n ) 属于鲇够目( s i l u r i f o r m e s ) 鲇科( s i l u r i d a e ) 鲇属( s i l u r u s ) ( 李明德，1 9 9 2 ) 。南方鲇的味觉系统比较发达，初级味觉巾椒主 要化于延脑的而叶和迷走叶。延脑是味感觉传入的中继站，延脑神经细胞膜的特 性，尤其是跨膜信号转导有关的离子通道的特阡决定管延脑感觉中枢对味觉信号 的接受和处碑。有天鱼类味觉体表感觉水平的研究l 二经”展了很多研究上作，但叶 椒神绎系统细胞的1 叶究较少。 为了进 步研究摄食行为与味觉中枢活动的天系，奉研究以南方鲇作实验剌 料，进行南力鲇延腑神经细胞的分离! ，原代培养，及其神经细胞膜上的电膻门控 性钾离子通道的研究，以期能对鱼类味觉的理沦年应用研究提供资料，为进、步 卉清摄食行为与味觉中枢活动的关系打下是础。 中山大学硕士学位论文 第2 章南方鲇延脑神经细胞的急性分离 2 1 材料 2 1 1 实验动物 实验删鱼为养殖的南力鲇，心j ：佛山l 丁】柯海水，。训究院f 内油场，体长约 1 5 2 0 c m ，暂养f 奇生虫所鱼池中。 2 1 2 实验仪器及设备 电f 天平( s a r t o r i u sb s 2 0 0 s ) p h s 一3 c 精密p h 计( h a n n ap h 2 11 ) 倒旨相差显微镜( k i c a 公刮) j 聚焦芡光显微镜( l e i c a 公司) 【) k8 d 型屯热恒温水楷( 上海精宏实验设备公司) 数码相机( n i k o nc o o l p i x 4 5 0 0 ) 2 1 3 实验试剂 链霉蛋i l i 酶f ( p r o n a s ee ，r o c h e 分装) 多聚一d 一赖氨酸( s i g m a ，p 1 0 2 4 ) 多聚甲醛( s i g m a ) t r i t o nx t 0 0 ( a m r e s c o 一0 6 9 4 ) 山羊向清( 博士德生物工程有限公司) 兔抗小鼠神经丝蛋门抗体( s i g m a ) f i t c 标记山羊抗兔免疫球蛋白( s a n t