（材料学专业论文）定位硫酸酯化壳聚糖与蛋白质相互作用研究.pdf

中文摘要 蛋白质的分离纯化不仅是蛋白质分子结构、组成、物理化学性质和生物活性 研究中一项基础性工作，在实际应用中也有重要的意义。为了实现蛋白质的高效 分离纯化，提高分离纯化过程中所用分离介质针对目标蛋白质的特异性结合活性 至关重要。为了实现这一目的，研究蛋白质及其配体的分子识别机制至关重要。 糖胺聚糖与蛋白质问的相互作用在生命活动中有着极为重要的意义。一般认 为糖胺聚糖和糖胺聚糖结合蛋白依靠静电相互作用进行选择性识别与结合，但也 有研究表明静电相互作用可能不是介导两者特异性识别的唯一因素，两者的相互 作用可能会受到糖胺聚糖分子链上某些特殊基团的调控。因此，本课题以官能化 位点为切入点，选用一种跟糖胺聚糖结构相似性程度最高的天然多糖壳聚糖 为研究对象，对其进行选择性硫酸酯化，合成各种具有不同硫酸酯化位点的壳聚 糖硫酸酯作为糖胺聚糖类似物，通过研究由改变官能化位点所带来的结构差异对 糖胺聚糖蛋白质体系相互作用的影响来考察特殊基团在两者特异性识别中的作 用。 我们成功合成了7 种定位硫酸酯化壳聚糖并通过红外光谱、元素分析和1 3 c 核磁共振谱表征确认了其结构。蛋白质结合实验表明不同定位硫酸酯化壳聚糖以 及肝素的溶菌酶结合活性存在较大差异。当溶菌酶过量时，硫酸酯化多糖的酯化 度越高，其溶菌酶结合活性反而越低，说明静电相互作用并不是影响壳聚糖硫酸 酯和溶菌酶结合的唯一因素。虽然多糖蛋白投料比会影响两者的结合，但6 o 硫酸酯化壳聚糖( 6 s ) 在较宽的投料比范围内表现出最高的溶菌酶结合活性。进 一步研究发现硫酸酯化多糖与溶菌酶的初始结合以及结合效率与表面净电荷的 多少密切相关，但结构性差异对两者之间的后续结合有更大的影响。c 6 s 0 3 在 两者的相互作用中发挥了重要作用，可能是溶菌酶结合的活性位点，因而6 s 表 现出较高的溶菌酶特异性结合活性。c 3 s 0 3 的引入能促进壳聚糖硫酸酯与牛血 清白蛋白的结合，但会干扰壳聚糖硫酸酯与溶菌酶的结合。此外，总体负电荷负 载量较高的壳聚糖硫酸酯可以结合更多的y 一球蛋白。 在此基础上我们通过n 甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺在甲基丙烯酰基异硫氰 酸酯改性聚氨酯表面的接枝聚合在聚氨酯表面引入n 羟基琥珀酰亚胺酯基团， 以其为后续反应活性位点完成了壳聚糖硫酸酯在聚氨酯表面的接枝，制备出了以 定位硫酸酯化壳聚糖为配体的微型目标蛋白质选择性分离介质。蛋白质吸附实验 结果表明壳聚糖硫酸酯改性聚氨酯表面能够从人血清白蛋白溶菌酶等量混合溶 液中选择性吸附溶菌酶，而且2 s 改性聚氨酯表现出针对溶菌酶最好的选择性分 离效果。 关键词：定位硫酸酯化，蛋白质结合，相互作用机制 a b s t r a c t p r o t e i ns e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o ni sn o to n l yt h eb a s i so fp r o t e i nr e s e a r c h ，b u t a l s oo fg r e a ti m p o r t a n c ei np r a c t i c a la p p l i c a t i o n s i no r d e rt oa c h i e v ee f f i c i e n tp r o t e i n s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n , i ti si m p o r t a n tt oi m p r o v et h es p e c i f i cb i n d i n ga c t i v i t yo f t h es e p a r a t i o nm e d i u mt oat a r g e tp r o t e i n t h e r e f o r e ，s t u d y i n gm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n m e c h a n i s mb e t w e e np r o t e i na n di t sl i g a n di sv e r yi m p o r t a n t t h ei n t e r a c t i o no fg l y c o s a m i n o g l y c a n ( g a g ) a n dp r o t e i ni sc r i t i c a li nb i o l o g i c a l a c t i v i t i e s i ti sg e n e r a l l yb e l i e v e dt h a tt h er e c o g n i t i o no fg a ga n dg a g b i n d i n g p r o t e i nd e p e n d so ne l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s s o m er e s e a r c h e s ，h o w e v e r ，i n d i c a t e d t h a te l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n sm a yn o tb et h eo n l yf a c t o r , a n dt h er e c o g n i t i o nm a yb e r e g u l a t e db ys o m es u b s t i t u e n t sd i s t r i b u t e do ng a g m o l e c u l a rc h a i n s t h e r e f o r e ，w e c h o s ec h i t o s a n ，am o l e c u l eb e a r i n gh i g hs t r u c t u r a ls i m i l a r i t yw i t hg a g ，a ss t a r t i n g m a t e r i a lt os y n t h e s i z er e g i o s e l e c t i v es u l f a t e dc h i t o s a n sa n di n v e s t i g a t e dt h ei n f l u e n c e s o fm o d i f i c a t i o ns i t e so nt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e ng a ga n dg a g - b i n d i n gp r o t e i n 7d i f f e r e n tr e g i o s e l e c t i v ec h i t o s a ns u l f a t e sw e r es y n t h e s i z e da n dt h e i rs t r u c t u r e s w e r ec o n f i r m e db yf t i r ，e l e m e n t a la n a l y s i sa n d cn m r p r o t e i nb i n d i n gt e s t i n d i c a t e st h a tt h el y s o z y m eb i n d i n ga c t i v i t i e so fr e g i o s e l e c t i v ec h i t o s a ns u l f a t e sa r e d i f f e r e n t w h e ne x c e s s i v el y s o z y m e sw e r eu s e d ，t h el y s o z y m eb i n d i n ga c t i v i t i e so f s u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sa r en e g a t i v e l yr e l a t e dw i t ht h e i rd e g r e e so fs u l f a t i o n , i n d i c a t i n ge l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n sa r en o tt h eo n l yd e t e r m i n a n ti n t h e i rb i n d i n g a l t h o u g ht h eq u a n t i t yr a t i oo fs u l f a t e dp o l y s a c c h a f i d e sa n dl y s o z y m eh a si m p a c to n t h e i rb i n d i n g , 6 - 0 s u l f a t e dc h i t o s a ne x h i b i t st h eh i g h e s tl y s o z y m eb i n d i n ga c t i v i t yi n aw i d er a n g eo fq u a n t i t yr a t i o f u r t h e rr e s e a r c h e sd e m o n s t r a t et h a tt h ei n i t i a lb i n d i n g b e h a v i o ra n db i n d i n ge f f i c i e n c ya r eb o t hc l o s e l yr e l a t e dt ot h es u r f a c en e tc h a r g e so f s u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e s b u ts t r u c t u r a ld i f f e r e n c e sh a v eg r e a t e ri m p a c t so nt h e i r f o l l o w i n gb i n d i n g c 6 8 0 3p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc h i t o s a n s u l f a t e sa n dl y s o z y m e ，a n di tm a yb et h ea c t i v es i t e so fl y s o z y m eb i n d i n g a sar e s u l t ， 6 sd i s p l a y st h eh i g h e s ts p e c i f i cl y s o z y m eb i n d i n ga c t i v i t y t h ei n t r o d u c t i o no fc 3 5 0 3 c o u l df a c i l i t a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc h i t o s a ns u l f a t e sa n dh u m a ns e r u ma l b u m i n b u tm a yi n t e r f e r el y s o z y m eb i n d i n g m o r e o v e r , c h i t o s a ns u l f a t e sw i t hh i g h e rd e g r e e o fs u l f a t i o nc a l lb i n dm o r e ) , - g l o b u l i n h i no r d e rt op r e p a r em i c r o s e p a r a t i o nm e d i aw i t h c h i t o s a ns u l f a t e sa sl i g a n dt o s e p a r a t et a r g e tp r o t e i n , n - h y d r o x y s u c c i n i m i d ee s t e rg r o u p sw e r ei n t r o d u c e di n t o p o l y u r e t h a n e s u r f a c ev i ag r a f tp o l y m e r i z a t i o no fn - a c r y l o x y s u c c i n i m i d eo n t o m e t h a c r y l o y li s o t h i o c y a n a t em o d i f i e dp o l y u r e t h a n es u r f a c ea n du s e da l sa c t i v es i t e s f o rs u b s e q u e n ti m m o b i l i z a t i o no fc h i t o s a ns u l f a t e s t h ep r o t e i na d s o r p t i o ne x p e r i m e n t w a sc a r r i e do u ta n dt h er e s u l t si n d i c a t et h a tc h i t o s a ns u l f a t e sm o d i f i e dp o l y u r e t h a n e s c o u l dp r e f e r e n t i a l l ya d s o r bl y s o z y m ei n s t e a do fh u m a ns e r u ma l b u m i nf r o me q u a l m i x t u r eo fl y s o z y m ea n dh u m a ns e r u ma l b u m i n 2 sm o d i f i e dp o l y u r e t h a n ee x h i b i t s t h eh i g h e s te f f i c i e n c yo fs e l e c t i v es e p a r a t i o no nl y s o z y m e k e yw o r d s ：r e g i o s e l e c t i v es u l f a t i o n ，p r o t e i nb i n d i n g ，i n t e r a c t i o nm e c h a n i s m i i i 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 武汉理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 签名：主：篡竺日期：乎竺五丝；， 学位论文使用授权书 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的 全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有 关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息 服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生( 签名) ：f 衣知 导o i l i ( 签名) ：卜争欠日期。衫2 武汉理工人学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 蛋白质的结构与功能 蛋白质( p r o t e i n ) 是生物体内最重要的一类生物大分子。除了水，蛋白质是 生物体内含量最丰富的物质，约占细胞干重的5 0 以上，是细胞原生质的主要 成分，与核酸一起构成了生命体的物质基础。随着生命科学相关研究的逐步深入， 人们认识到发育、生长、分化和繁殖等诸多生命活动都有蛋白质参与且受到蛋白 质的调控，甚至生物的各种性状也是体内各种蛋白质相互作用的综合表现。归纳 起来，蛋白质的主要生物学功能有：催化( 酶) 、调节( 激素等各类调控蛋白) 、 转运( 如运输氧气的血红蛋白、控制物质进出细胞的膜转运蛋白等) 、贮存( 作 为碳源，氮源) 、运动( 如肌动蛋白，肌球蛋白，微管蛋白等) 、结构组分( 如伍 一角蛋白、胶原蛋白等) 、支架作用( 识别并结合其它蛋白，参与细胞信号转导) 、 防御和进攻( 如抗体、抗冻蛋白等) 等等。 蛋白质之所以具有如此多样化的功能，与蛋白质中千差万别的氨基酸排列顺 序密切相关。虽然蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接而成的长链分子，然而天 然蛋白质分子并不是随机走向的松散多肽链，每一种蛋白质都具有自己特殊的三 维空间结构。蛋白质结构具有不同的组织层次：一级结构，指多肽链的氨基酸排 列顺序；二级结构，指多肽链依靠氢键形成的a 一螺旋和b 一折叠；三级结构， 指多肽链借助各种次价键弯曲、折叠成具有特定走向的构象；四级结构是指蛋白 质中各亚基之间的空间方位和结合方式，各个亚基又有自己特定的三级结构。蛋 白质特殊的空间结构是由其一级结构决定的【l 】。 1 2 蛋白质的分离与纯化 正因为蛋白质在生命活动中占有极其重要的地位，研究蛋白质不仅可以加深 对生命规律的认识，还对工业生产、医学实践起着重要的指导作用，具有重大的 理论与实践意义。而蛋白质的分离( s e p a r a t i o n ) 和纯化( p u r i f i c a t i o n ) 则是蛋白 质研究中必不可少的环节。蛋白质的分离纯化不仅是蛋白质分子结构、组成、物 理化学性质和生物活性研究中一项基础性工作，在实际应用中也有重要的意义。 蛋白质分离与纯化的总体目标是增加制品的纯度或比活，通过除去不需要的和变 性失活的蛋白质以增加单位重量蛋白质中目标蛋白质的含量或生物活性并希望 目标蛋白质的产量达到最大值。蛋白质的分离和纯化的一般程序大致可分为材料 的选择、组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液、蛋白质初步提纯、选择一种或几种 合适的方法除去杂蛋白直至完全纯化、目标蛋白的鉴定几步。现有的蛋白质分离 武汉理r 大学硕士学位论文 纯化方法大多是借助蛋白质的各类物理化学性质( 分子量、溶解度、电荷、吸附 性质、与配体的亲和力等) 的差异来完成目标蛋白的分离与纯化【2 训，现分述如 下： 1 2 1 基于分子量不同的分离纯化 1 2 1 1 透析与超滤 透析是利用透析袋分离蛋白质的方法，可选择具有不同截留分子量的透析袋 分离分子量不同的蛋白质。超滤法是利用高压力或离心力，迫使水和分子量较小 的蛋白质分子通过超滤膜，而大于超滤膜截留分子量的蛋白质留在膜上，从而达 到分离和浓缩蛋白质的目的。超滤法操作简便、迅速、温和，不受处理样品量大 小的限制( 从几毫升到几百升) ，而且可以同时完成分级、浓缩、除盐以及纯化 操作，但其分辨率较低。 1 2 1 2 凝胶过滤层析 也称分子排阻层析或凝胶渗透层析，这是根据分子量大小分离蛋白质混合物 最有效的方法之一，其原理同凝胶渗透色谱。凝胶过滤层析最大的不足是整个过 程中样品不断地在稀释，为了保持一定的分辨率又不能过度提高上样量，因此， 进行凝胶过滤层析的样品浓度越大越好。此外，凝胶过滤层析还有一些局限性， 如操作p h 要在6 8 之间、分离能力仅限于分子大小、样品粘度有一定限制等。 但由于其具有设备简单，操作简便，使用后无需再生处理等优点，凝胶过滤层析 在生物大分子的分离、除盐以及分子量的测定上仍得到了广泛地应用。目前最常 用的凝胶层析介质有交联葡聚糖，聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶以及某些大孔径、 流速好且质地比较坚硬的介质( 如s e p h a e r y l 、u l t r a g e l 、t r i s a c r y l 等) 。 1 2 1 3 密度梯度( 区带) 离心 蛋白质沉降速率取决于其分子大小和密度。蛋白质颗粒在具有密度梯度的介 质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋 白质颗粒沉降到与自身密度相等的梯度密度介质层时，即停止不前，最后各种蛋 白质在离心管中被分离成各自独立的区带，分区的蛋白质经管底穿刺放出分部收 集后即可进行样品分析。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。 2 武汉理j = 人学硕士学位论文 1 2 2 基于溶解度不同的分离纯化 1 2 2 1 盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在盐浓度较低时，随着盐浓度升 高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，不同蛋白质的溶解 度出现不同程度的下降并先后析出，这种现象称盐析。将大量盐加到蛋白质溶液 中，高浓度的盐离子( 如硫酸铵的s 0 4 2 一和n i - h + ) 有很强的水化力，可夺取蛋白 质分子的水化层，使蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。由于各种蛋白质分子颗粒大小、 亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中 性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。此外，还可以通过改变p h 及温度来分离蛋 白质。 盐析法的优点是操作简便，中性盐对易变性的蛋白质有一定的保护作用。而 且盐析能够除去较多的杂质，有纯化作用。盐析还有浓缩蛋白质溶液的作用，有 利于后续纯化操作。缺点是分辨能力差，纯化倍数低。 蛋白质在盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析。 因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用凝胶过滤的办法除盐， 所用的时间比较短。 1 2 2 2 有机溶剂沉淀 往蛋白质溶液中添加甲醇、乙醇或丙酮等可与水混溶的有机溶剂，由于有机 溶剂介电常数较低，会降低溶液的介电常数，增强蛋白质分子之间的静电引力， 从而使分子聚集而沉淀。此外，有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水 化层，也促使蛋白质分子脱水而沉淀。一定温度、p h 值和离子强度下，引起蛋 白质沉淀的有机溶剂浓度不同，因此控制有机溶剂浓度就可分离纯化蛋白质。有 机溶剂存在下蛋白质较易变性，操作应在低温下进行。 有机溶剂沉淀法比盐析法分辨率高，使用恰当时提纯效果好，在蛋白质制剂 的生产中得到了广泛应用。 1 2 2 3 聚合物沉淀分级 水溶性中性高聚物也可以沉淀蛋白质，分子量高于4 0 0 0 的聚7 , - - 醇可以有 效地沉淀蛋白质。虽然聚乙二醇难以除去，但残余的少量聚乙二醇对蛋白质无害。 盐析、离子交换、亲和层析、凝胶过滤层析通常可在不除去聚乙二醇的情况下进 行。其它聚电解质( 如聚丙烯酸) 也可用于纯化蛋白质，而且特别适用于工业规 3 武汉理工人学硕士学位论文 模的应用。 1 2 3 基于电荷不同的分离纯化 1 2 3 1 电泳 电泳是一项分离可电离物质的重要技术。带电质点在电场中泳动的速度和方 向主要取决于它们所带电荷的性质、电荷的数目、颗粒大小及形状。由于各种蛋 白质的等电点不同，分子大小不同，在同一p h 值下具有不同的解离状态，因而 在电场中泳动的方向和速度也各不相同。这样就提供了蛋白质分离的依据。根据 操作方式的不同，蛋白质电泳可分为许多种不同的类型。其中最常用的是聚丙烯 酰胺凝胶电泳。 1 2 3 2 离子交换层析 离子交换层析以离子交换树脂为支持物。离子交换树脂是一类不溶于水、有 机溶剂、酸和碱的合成高分子材料。它上面共价结合着许多可电离为阴离子和阳 离子的基团，可与周围溶液中其它带相反电荷的蛋白质结合。分段洗脱或梯度洗 脱过程中无结合力或结合力弱的蛋白质首先被洗脱下来，结合力强的蛋白质最后 被洗脱下来，这样就实现了蛋白质的分级分离。常用的离子交换剂有阳离子交换 剂( 如羧甲基纤维素和琼脂糖) 和阴离子交换剂( 二乙氨基乙基纤维素和琼脂糖) 。 1 2 4 基于吸附性质不同的分离纯化( 吸附层析) 某些固体物质具有吸附能力，能通过范德华力、氢键、疏水相互作用等非离 子相互作用将其它种类的分子吸附在自己的表面，这类物质称为吸附剂。吸附层 析利用待纯化分子和杂质分子与吸附剂之间吸附能力和解吸性质不同达到分离 目的。如羟基磷灰石层析、疏水相互作用层析( 利用蛋白质分子表面的疏水侧链 与层析基质上的非极性基团之间的相互作用来分离纯化蛋白质) 、金属离子螯合 层析、染料配体亲和层析等。 1 2 5 基于配体特异性亲和力的分离纯化( 亲和层析) 亲和层析( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) 是利用蛋白质分子针对其配体分子特有 的识别能力即生物学亲和力建立起来的一种有效的分离纯化方法。它通常只需要 经过一步处理就可以将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当 高，对于那些因物理性质差异小而难于分离纯化的蛋白尤其有效。亲和层析最初 4 武汉理_ 大学硕士学位论文 用于酶的纯化，现在已广泛应用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器 甚至完整细胞的分离纯化。亲和层析的基本原理是把待纯化目标蛋白的特异性配 体通过适当的化学反应共价连接到琼脂糖、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖凝胶等载体 表面的功能基团上，目标蛋白与载体问一般插入一段长度适当的间隔臂如氨基 己酸，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的空间位阻过大而妨 碍目标蛋白与配体的结合。当蛋白质混合物加到有亲和介质的层析柱时，目标蛋 白被吸附在含配体的凝胶表面上而其它杂蛋白则因没有针对该配体的特异性结 合部位而不被吸附，通过洗涤即可除去，被特异性结合的目标蛋白可用含游离配 体的溶液从柱上沈脱下来( 亲和洗脱) 。 1 3 分子识别 生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系。生命复杂而高度组织化 的形式取决于生物分子彼此识别和相互作用的能力，结构互补性则是生物分子间 识别的手段。如果一种分子的结构与另一种分子的结构是互补的，例如，某种酶 和它的专一性底物分子，那么这两种分子之间的相互作用就能准确实现。生物体 中从大分子水平到细胞水平的生物系统都是经由基于结构互补性的特殊的分子 识别机制运转的。生物分子识别则是通过各类在生理条件下可逆的弱相互作用 ( 氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用等) 实现的。这种相互作用由结构互 补分子间的特殊识别发动，并最终导致特定生理活性的产生。 在生物体内种类繁多的分子识别中，糖与蛋白质的识别占有很重要的地位。 作为自然界中含量最丰富、分布最广泛的有机分子，糖类除了参与构成生物体， 为生物体供能或作为生物体代谢的中间产物外，还作为细胞识别的信号分子参与 生命活动。而糖类的这一功能大多通过与蛋白质的相互作用来实现，这种相互作 用在生命活动中有着极为重要的意义，是细胞进行物质转运、新陈代谢和信息传 递的生理基础，在细胞黏附、接触抑制、免疫保护、代谢调控、受精机制、形态 发生、发育、癌变、衰老等诸多生理和病理过程中扮演了重要角色。 1 4 糖胺聚糖 糖胺聚糖( 糖胺聚糖( g l u c o s a m i n o g l y c a n s ，g a g s ) 是一种由重复糖单元组 成的多糖链，二糖单位中一个是氨基葡萄糖，另一个是糖醛酸( 硫酸角质素除外) 。 二糖单位中至少有一个单糖残基带有羧基或硫酸基，因此糖胺聚糖是聚阴离子高 分子，呈酸性。生物体内比较重要的糖胺聚糖有肝素( h e p a r i n ) 、硫酸类肝素 ( h e p a r a ns u l f a t e ，h s ) 、硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，c s ) 、硫酸角质素( k e r a t a n s u l f a t e ，k s ) 、硫酸皮肤素( d e r m a t i ns u l f a t e ，d s ) 、透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ，h a ) 等。 5 武汉理工大学硕士学位论文 糖胺聚糖可通过共价键与核心蛋白结合，称为蛋白聚糖( p r o t e o g l y c a n ) 。糖胺聚 糖作为蛋白聚糖的糖链成分，是细胞外组织基质、细胞表面和细胞膜基底层的主 要组成成分。除此之外，糖胺聚糖也是细胞与细胞、细胞与基质之间的重要介质， 具有多种重要的生物学功能【5 制。 经文献报道过的能与糖胺聚糖相结合的蛋白质超过1 0 0 种。表1 列举了其中 一小部分。 表1 g a g 一结合蛋白及其生物活性举例【7 】 从表l 可以看出，糖胺聚糖与蛋白质的相互作用，对止血、脂质转运和吸收、 细胞生长和迁移以及发育都产生了意义深远的生理效应。蛋白质与糖胺聚糖的结 合可引起：在合成位点固定蛋白质；调节酶的活性；将配体结合到相应受体并引 发下一步信号转导；防止配体产生降解；富集并储存配体。已报道过的糖胺聚糖 结合蛋白都与肝素和硫酸类肝素，或透明质酸相互作用；也有少数的糖胺聚糖结 合蛋白以相似的亲和力与硫酸软骨素或硫酸角质素相互作用【7 1 。 6 武汉理= 大学硕士学位论文 1 5 壳聚糖概述 甲壳素( c h i t i n ) 又名甲壳质，几丁质，化学名称为( 1 _ 4 ) 2 一乙酰氨基2 脱 氧d d 葡聚糖。广泛存在于甲壳动物虾和蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌( 酵母、 霉菌) 的细胞壁和植物( 如蘑菇) 的细胞壁中。估计自然界每年生物合成的甲壳 素将近1 0 0 亿吨，是产量仅次于纤维素的天然高分子化合物，同时也是地球上除 蛋白质外数量最大的含氮天然有机化合物。壳聚糖( c h i t o s a n ) ，化学名称为 ( 1 4 ) 2 氨基2 脱氧b d 葡聚糖，是甲壳素在强碱性条件下部分脱乙酰化后形 成的一种衍生物，又称为脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素、甲壳胺、聚氨基葡萄糖 等。脱乙酰度不同的壳聚糖，分子链中存在含量不同的2 乙酰基葡萄糖和2 氨 基葡萄糖两种结构单元。一般而言，n 乙酰基脱去5 5 以上的甲壳素就可称之 为壳聚糖。甲壳素和壳聚糖的结构式为如图1 所示。 h h hh e d 1 , 图1 甲壳素( 上) 和壳聚糖( 下) 结构示意图 壳聚糖是白色或淡黄色片状固体。壳聚糖不溶于水、乙醇和丙酮等常见有机 溶剂，能溶于无机酸和水杨酸、酒石酸及抗坏血酸等有机酸，也能溶于许多稀酸 溶液中。在酸性介质中，壳聚糖的分子中的- n h 2 被质子化为n h 3 + ，产生酸性溶 解。壳聚糖的溶解性与脱乙酰度密切相关：脱乙酰度在6 0 以下的壳聚糖只有部 分离析溶解于稀醋酸溶液中；脱乙酰度为6 0 8 0 的壳聚糖呈絮凝悬浮于稀醋 酸溶液中；脱乙酰化度为8 0 以上则以油状清澈地溶于稀醋酸溶液中【8 】。壳聚糖 的化学结构与纤维素相似，但其化学性质更为活泼，可在较温和的条件下发生酰 化、羟基化、氰化、醚化、烷基化、酯化、酰亚胺化、叠氮化、成盐、螯合、水 解、氧化、卤化、接枝与交联等反应【9 加】。除抗菌【1 1 。1 2 】、抗病掣13 1 、吸附金属离 子【1 4 郴】、免疫调节【1 6 】、酶固定化【1 7 1 及药物释放【1 8 1 等活性外，壳聚糖及其衍生物 还表现出抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、降胆固醇、降血脂、促伤口愈合等 多种独特的生物活性和功能【1 9 2 2 】，从而在农业、食品、化工、环境保护、医学等 7 武汉理工大学硕十学位论文 诸多领域中得到了广泛的运用 2 3 - 2 4 】。 1 6 壳聚糖用于蛋白质分离纯化 1 6 1 基于壳聚糖的亲和沉淀 亲和沉淀是通过目标分子与亲和配体的特异性结合作用以及沉淀分离原理 实现目标分子分离纯化的技术【2 5 。2 6 1 。该技术的关键在于结构异质性双功能亲和沉 淀剂的使用。该亲和沉淀剂包括两种组分，一种是针对目标分子具有选择性结合 活性的亲和配体，另一种组分则是在物理条件( 如p h 值、温度和离子强度等) 改变时发生可逆性沉淀一溶解转变的水溶性聚合物。亲和沉淀中亲和配体的使用 效率较高，且分离操作在水相中完成，能够大规模、快速、特异性地分离纯化目 标分子。亲和沉淀一般在分离过程的初期采用，这样有利于减少分离步骤、提高 分离效率并降低成本。壳聚糖在p h 2 ) 的2 3 6 s 产物。 2 2 实验药品与仪器 2 2 1 实验原料与试剂 2 1 武汉理。r 大学硕士学位论文 2 2 2 相关试剂的预处理 试剂名称预处理方法 n ，n 二甲基甲酰胺 吡啶 7 3 2 阳离子交换树脂 无水硫酸镁浸泡过夜，减压蒸馏 钠存在下加热回流2 h ，减压蒸馏 清水浮选，除去细小颗粒；乙醇浸泡，抽干；5 0 。c 热 水浸泡2 h ，洗涤，抽干；2 m o l l 盐酸浸泡2 h ，水洗 至中性，抽干；2 m o l l 氢氧化钠溶液浸泡2 h ，水洗 至中性，抽干，备用。 注：其它试剂不经处理直接使用 2 2 3 实验仪器 仪器名称生产厂家 j m 2 0 2 t 电子天平 8 5 2 型恒温磁力搅拌器 d f 10 1s 智能集热式恒温加热磁力搅拌器 m i l l i qb i o c e l 超纯水仪 s h z d ( i i i ) 循环水式真空泵 r e 5 2 型旋转蒸发仪 1 0 1 2 a 型电热鼓风干燥箱 d z 1 b c 型真空干燥箱 t g 1 6 台式高速冷冻离心机 l g j 1 0 冷冻干燥机 n e x u s 傅立叶变换红外光谱仪 v a r i oe l i i ic h n s o 元素分析仪 a v a n c ed r x 5 0 0 核磁共振波谱仪 余姚纪铭称重校验设备有限公司 巩义予华仪器有限责任公司 上海东玺制冷仪器设备有限公司 m i l l i p o r e ( 美国) 巩义予华仪器有限责任公司 上海亚荣生化仪器厂 天津市泰斯特仪器有限责任公司 天津市泰斯特仪器有限责任公司 湘仪离心机仪器有限公司 湘仪离心机仪器有限公司 t h e r m o ( 美国) e l e m e n t a l ( 德国) b r u k e ro p t i c s ( 德围) 注：其它常用仪器未列出 2 3 壳聚糖的定位硫酸酯化 2 3 12 n 一硫酸酯化壳聚糖( 2 s ) 的合成【8 l 】 将1 0 0 9 壳聚糖分散于1 5 0 m l 去离子水中，n k 3 。3 0 9n a 2 c 0 3 y f l l5 7 1 9s 0 3 吡 啶后在6 5 。c 下反应1 2 h ，冷却后转入透析袋中，先后用流水、去离子水充分透析， 武汉理t 大学硕+ 学位论文 透析液旋蒸浓缩后真空冷冻干燥即得目标产物( 图8 ) 。 n h c o c h 3 n a 2 c 0 3s 0 3 - p y r i d i n eh 2 0 图8 2 s 硫酸酯化壳聚糖的制备原理 2 3 2 6 。0 一硫酸酯化壳聚糖( 6 s ) 的合成( 混酸途径) 8 7 】 将1 0 0 9 壳聚糖加入在4 冰箱中预冷的4 0 m l 9 5 黼2 0 m l 9 8 氯磺酸 的混合溶液中，室温下反应l h 后出料，用2 5 0 m l 冷乙醚沉淀，过滤，沉淀用乙 醚洗涤后加适量水溶解，用o 5 m o l l n a h c 0 3 溶液中和，转入透析袋中，先后用 流水、去离子水充分透析，透析液旋蒸浓缩后真空冷冻干燥即得目标产物( 图9 ) 。 n h c o c h 3 o 1 3 c i s 0 3 h h 2 s 0 4 n h 2 图9 6 s 硫酸酯化壳聚糖的制备原理( 混酸途径) 武汉理r 大学硕士学位论文 2 3 3 2 n6o 硫酸酯化壳聚糖( 2 6 s ) 的合成【8 2 】 将0 2 5 96 s 溶于1 5 0 m l 去离子水中，加入0 3 5 9n a e c 0 3 和7 9 6 m gs o a 吡啶。 在n 2 氛中于6 5 。c 下搅拌反应1 8 h ，转入透析袋中，先后用流水、去离子水充分 透析，透析液旋蒸浓缩后真空冷冻干燥即得目标产物( 图1 0 ) 。 n h c o c h 3 o 1 3 p h = 9 一1 0 n h c o c h 3 o 1 3 n h 2 n a 2 c 0 3s o a - p y r i d i n eh 2 0 n h s 0 3 h 图1 0 2 6 s 硫酸酯化壳聚糖的制备原理 f o r ，o 8 7 2 3 4 3 ，6 。o 硫酸酯化壳聚糖( 3 6 si ) 的合成( 邻苯二甲酸酐途径) 【8 2 】 a 壳聚糖的活化：将5 0 0 9 壳聚糖( 3 1 o m m 0 1 ) 溶于5 0 0 m l1 ( v v ) 乙酸中， 加入1 0 ( w v ) n a o h 溶液使之沉淀析出，离心，沉淀水洗至中性后再用 无水乙醇、d m f 洗涤数次，分散于1 3 0 m l d m f 中。 b 2 位氨基保护：往壳聚糖的d m f 溶液中加入1 3 8 5 9 邻苯二甲酸酐( 9 3 1 m m 0 1 ) 和3 5 m l ( 6 4 1 r m n 0 1 ) 乙二醇，1 3 0 下n 2 气氛中反应2 h ，冷却后倾入冰水中， 离心沉淀，沉淀用水、无水乙醇洗涤后在索氏提取器中用无水乙醇抽提，6 0 下真空干燥得到2 n 邻苯二甲酰亚氨基壳聚糖。 c 硫酸酯化：将0 2 5 92 - n 邻苯二甲酰亚氨基壳聚糖( o 8 6 m m 0 1 ) 溶于5 0 m l d m f 中搅拌过夜，然后加入1 0 m l 溶有1 3 7 9s o y 吡啶( 8 5 8 m m 0 1 ) 的d m f ， 室温下搅拌过夜，反应结束后将体系倾入7 0 m l 冰水中，用2 m o l ln a o h 溶 液中和，用o 2 ( w v ) n a h c 0 3 溶液透析4 h 后再依次用流水、去离子水 透析，透析液旋蒸浓缩后真空冷冻干燥即得3 , 6 o 硫酸酯2 邻苯二甲酰亚氨 2 4 武汉理工人学硕十学位论文 基壳聚糖。 d 氨基脱保护：0 2 1 93 , 6 o 硫酸酯2 邻苯二甲酰亚氨基壳聚糖( o 4 6 m m 0 1 ) 溶于3 0 m l 蒸馏水中，加入1 1 3 m l 水合肼( 3 5 6 m m 0 1 ) ，7 0 下反应1 6 h 。 反应结束后加入5 0 m l 蒸馏水，旋蒸至近干。上述步骤重复2 次。所得溶液 用去离子水补至5 0 m l ，依次用流水、去离子水充分透析，透析液旋蒸浓缩 后真空冷冻干燥即得3 , 6 o 一硫酸酯化壳聚糖( 图1 1 ) 。 o h o h 孓令鼹n h 2 n h 。 d m f + h o c h 2 c h 2 0 h s 0 3 p y r i d i n e 图1 1 3 6 si 硫酸酯化壳聚糖的制备原理( 邻苯二甲酸酐途径) 2 3 5 3 ，6 o 硫酸酯化壳聚糖( 3 6 si i ) 的合成( 氯磺酸途径) 【8 9 】 a 硫酸酯化试剂的配制：往三口烧瓶中加入5 0 m l 干燥d m f ，体系置于冰浴中， 边搅拌边加入1 0 m l 氯磺酸，控制滴加速度使体系温度保持在5 以下。滴 加完毕后室温下继续搅拌一定时间得硫酸酯化试剂。 b 壳聚糖溶液的配制：将5 m l 二氯乙酸和5 0 m l 甲酰胺混合，加入4 0 0 9 壳聚 糖搅拌均匀，形成壳聚糖的有机溶液。 c 壳聚糖的硫酸酯化：往硫酸酯化试剂中加入壳聚糖溶液，5 0 下搅拌反应1 h 。 反应结束后加入少量去离子水，离心分离，所得上清液倾入4 0 0 m l 冷无水 乙醇中，抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤、去离子水溶解、饱和n a h c 0 3 溶液中 和后转入透析袋中，先后用流水、蒸馏水充分透析，透析液旋蒸浓缩后真空 冷冻干燥即得目标产物( 图1 2 ) 。 武汉理工大学硕士学位论文 n h c o c h 3 o 1 3 c 1 2 c h c o o h f o r m a m i d e n h c o c h 3 o 1 3 c 1 s 0 3 h d m f n h 2 n h 2 图1 2 3 6 si i 硫酸酯化壳聚糖的制备原理( 氯磺酸途径) 2 3 6 3 o 一硫酸酯化壳聚糖( 3 s ) 的合成 8 2 】 f、 o 1 | ，o 8 7 t o 甲 l o 8 7 0 4 5 93 6 s 溶于1 0 m l 去离子水中，用7 3 2 型苯乙烯系阳离子交换树脂处理， 体系用吡啶调p h 至6 ，冻干。冻干产物溶于3 6 m ln 甲基吡咯烷酮和4 m l 去离 子水的混合溶液中，9 0 下n 2 中反应2 4 h 。体系用4 0 m l 去离子水稀释，用 2 m o u l n a o h 溶液调p h 至9 ，先后用流水、蒸馏水充分透析，透析液旋蒸浓缩 后真空冷冻干燥即得目标产物( 图1 3 ) 。 n h c o c h 3 o 1 3 n h c o c h 3 o 1 3 n h 2 c h 3 i 心。 n h 2 图1 3 3 s 硫酸酯化壳聚糖的制备原理 2 6 f o 丫 l ，0 8 7 武汉理工大学硕士学位论文 2 3 7 2 n3o 一硫酸酯化壳聚糖( 2 3 s ) 的合成 将0 2 5 93 s 溶于1 5 0 m l 去离子水中，加入0 3 5 9 n a 2 c 0 3 和7 9 6 m gs 0 3 吡啶。 在n 2 氛中于6 5 。c 下搅拌反应1 8 h ，转入透析袋中，先后用流水、去离子水充分 透析，透析液旋蒸浓缩后真空冷冻干燥即得目标产物( 图1 4 ) 。 o 1 3 n h c o c h 3 p h = 9 1 0 n h c o c h 3 o 1 3 n h