（食品科学专业论文）大豆蛋白的酶法水解及产物抗氧化活性的研究.pdf

撼要 摘要 有资料显示人类许多慢性疾病及袋老现教均和人体内的自由撼水平失衡有 哭，过爨熬鑫出麓黠嘏钵产生裁铯牲羧痿，当这弹臻伤苓能及辩骖复共且羧累到 一定程度时往往导致疾病的出现。外源性抗氧化剂可以帮助人们维持体内自由基 豹乎鸳。遴过对其毒菝瓴豫性豹天然食物避纾戮究、簿选帮敬牲有磁能开发出非 常有效的抗氧化药物和保健食鼯。近年来的研究发现大豆蛋融水解物具有很高的 抗氧化潺憋，虫予大豆产量大、玲接低廉，自古以来就是人类豹重要食物，因此 研究开发抗氧化大豆肽具有重要的社会意义和经济价值。本研究针对大豆瑕白的 酶农织务重要参数，大戴肽的分子量分蠢、大越鹱的抗氧化姓进行了一系列的分 析研究，以期能发现影响大豆胶抗氧傀性的熏要因素，为生产抗氧化大豆欣产品 提供理论指导和工艺参数。 采用单因素实验盼方法分涮研究了a l c a l a s e ，p r o t a m c x 和木瓜蛋自酶对大 殿蛋白的酶水螂过程，得出了备酶水解大豆蛋白的较佳条件，并对铮酶较馈条件 下水解浚随对闯躺变仡送行了数学模拟，为准确控锚大豆蛋舀的永解度提供了依 据。求出了各酶水解大驻蛋白的k m 值。 采穗多酶分步承解静方式辩大豆礞自进行深度承解研究，结栗鼹示：多酶分 步水解能显著提高大豆缀白的水解度，且最终大豆蛋肉的总水解度姆酶加入顺序 帮瓣第一种酶静灭活每香无臻驻关系。采嗣f l a v o u r z y m e 黯天豆蛋巍麓承辩物进 彳亍继续水解时，水解物p h 无明显变化，但体系中氨旗氮含凝却随水解时间逐渐 壤瓣，藏辩窳鳃携懿苦噱持续下簿。 研究了不同酶水解大豆蛋囱时氨慕氮含墩、三氯五酸中可溶性氮含量、大豆 黢懿苦睬疆承熬发熬交纯怒嫠，结果袭骥：薅装承熬辩阉夔延长，承解废逐濒壤 大，总的变化趋势是氨耀氮含髓、三氯乙酸中可溶性氮含量、大豆肽的苦味随水 鳞潜蠲蘸长悉壤嬲；在本磐瘦攘裁揍况下各酶零舞镶巾氨基氮含量扶裹裂低浆矮 序依次是木瓜蛋白酶、p r o t a m e x 、a l c a l a s e ；a l c a l a s e 和木瓜蛋白酶水解液具有 较强豹蛰昧，恧鼠 圭l 予a l c a l a s # 豹瘩鼹速度纛承织效攀远寒予本双骚塞酶，在承 解时问相同时a l c a l a s e 水解液的苦味高于木瓜蛋白酶。 采用亚浊酸一骧鬣羧肄方法和邻笨三黔方法分别测定了单酶水殡反应秘多 酶分步水解反应制备的大豆蛋白水解液的抗驻油酸过氧化能力和清除自幽基能 力。综合涎实验靛结果。大豆蛋织水解物的抗氧他牲撼水缎度麴变化有如下娥律： 对同一种酶( 内切酶) 来说，随着水解时间的延长，水解度逐渐增大，水解物苦味 增强、水鳃物的抗氧化性也相皮增强；不同酶之间比较，在水解度一定时，通常 华南理工大学工学博士学位论文 苦味较强的水解物具有较强的抗氧化性。在所研究的单酶水解物中a l c a l a s e 对大 豆蛋白水解5 小时的水解产物具有最强的抗氧化活性。 采用木瓜蛋白酶、p r o t a m e x 以及f l a v o u r z y m e 对a l c a l a s e 水解大豆蛋白5 小 时的水解产物继续水解，结果显示，木瓜蛋白酶能够提高该水解物的抗氧化活性， 而p r o t a m c x 以及f l a v o u r z y m e 反而降低了该水解物的抗氧化活性。 为探讨大豆分离蛋白的水解物的分子量分布对抗氧化性的影响，采用 s e p h a d e xg 一2 5 凝胶过滤层析对大豆分离蛋白的水解物进行分离，发现大豆蛋 白的酶水解是不均匀的，虽经长时间水解，大豆蛋白中约有4 0 左右的组分只 发生轻微的水解作用，分子量仍然在5 0 0 0 d a 以上。大豆肽的分子量分布和酶的 种类、水解度有很大关系。值得注意的是具有良好抗氧化活性的水解物在分子量 1 0 0 0 2 0 0 0 d a 范围内大豆肽的含量均较高。 采用s e p h a d e xg 一2 5 凝胶过滤层析将a l c a l a s e 对大豆蛋白水解5 小时的水 解产物分成分子量大于2 0 0 0 d a 和分子量小于2 0 0 0 d a 两个部分，采用亚油酸一 硫氰酸钾方法、邻苯三酚方法以及人红细胞氧化溶血实验分别研究两部分的抗氧 化活力，结果显示分子量小于2 0 0 0 d a 的大豆肽是水解物中主要的抗氧化成分。 采用高效凝胶过滤色谱和基体辅助激光解吸质谱对具有抗氧化活性的大豆 肽进行进一步分离、分析，了解具有抗氧化活性的大豆肽的分子量分布范围。确 认具有抗氧化活性的大豆肽的主要分布在分子量1 1 0 0 d a 左右。 最后对大豆肽的抗氧化机理进行了探讨，结论如下，分子量2 0 0 0 d a 以下的 大豆肽具有较强的抗氧化活性，因此在进行酶水解时应尽可能提高水解度，提高 小肽含量：同时尽可能采用作用位点是疏水性氨基酸残基的蛋白酶，提高氨基酸 侧链的相对疏水度。 关键词：大豆蛋白；酶水解；多酶水解；抗氧化；清除自由基 i i a b s t r a c t p r e v i o u sd a t as h o w e dt h a tm a n yc h r o n i cd i s e a s e sa n ds e n i l ep h e n o m e n o no fh u m a n b e i n gw e r ea l l r e l e v a n tt ot a d i c a ll e v e lu n b a l a n c ei nt h eb o d y e x c e s s i v et a d i c a l sc a u s e o x i d a t i o nd a m a g ei nt h eb o d y i ft h ed a m a g ec o u l dn o tb er e p a i r e dt i m e l ya n db cc o l l e c t e dt o s o m ed e g r e e ，i tw o u l dr e s u l ti ns o m ed i s e a s e s b i o - a n t i o x i d a n tc a nh e l pp e o p l eh o l dr a d i c a l b a l a n c ei nt h eb o d y , i ti sp o s s i b l et od e v e l o pp o t e n ta n t i o x i d a n td r u g sa n df u n c t i o n a lf o o d s t h r o u g hs t u d y i n ga n dm o d i f y i n g s o m en a t u r a lf o o d s h a v i n g a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y d u et oh i g h o u t p u ta n dl o w c o s to fs o y ，i th a sb e e no n eo ft h ei m p o r t a n tf o o d s h e n c e ，t h e r ei si m p o r t a n t s o c i a ls i g n i f i c a n c ea n de c o n o m i cv a l u et os t u d ya n d d e v e l o ps o yp e p t i d e sw i t ha n t i o x i d a t i v e a c t i v i t y i n t h i sr e s e a r c he a c hi m p o r t a n tp a r a m e t e ro fe n z y m eh y d r o l y s i so fs o yp r o t e i n ， m e l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o na n da n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs o yp e p t i d e sw e r ea n a l y z e d t h e a i mw a st of i n di m p o r t a n tf a c t o r sa f f e c t i n ga n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs o yp e p t i d e sa n dt oo f f e r t h e o r e t i c a lg u i d a n c ea n dt c c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r sf o rt h ep r o d u c t i o no fa n t i o x i d a t i v es o y p e p t i d e s s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tw a sa d o p t e dt oh y d r o l y z i n gs o yp r o t e i nb ya l c a l a s e ，p r o t a m e x a n dp a p a i n b o t t e rc o n d i t i o n so fs o yp r o t e i nh y d r o l y z e db ye a c he n z y m ew e r eo b t a i n e d u n d e rt h e s ec o n d i t i o n st h eh y d r o l y s i sc u r v e sf o re a c he n z y m ew a ss i m u l a t e db ym a t h e m a t i c a l a n a l y s i s ，i ti su s e f u lf o rc o n t r o l l i n ga c c u r a t e l yt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i “d h ) o fs o yp r o t e i n f u r t h e r m o r ct h ev a l u eo fk i no fs o yp r o t e i nh y d r o l y s i sb ye a c he n z y m ew a sc a l c u l a t e d r e s p e c t i v e l y d e e ph y d r o l y s i sr e s e a r c hw a so p e r a t e d i ns t e pm u l t i e n z y m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e h y d r o l y s i si ns t e pm u l t i - e n z y m e c o u l di n c r e a s ed ho fs o yp r o t e i ns i g n i f i c a n t l y , a n dt h a tt h e r e w a sn o to b v i o u sr e l a t i o nb e t w e e nf i n a it o t a ld ho fs o yp r o t e i na n dt h eo r d e ro fa d d i n g e n z y m e s o rw h e t h e rt h ef i r s te n z y m eh a db e e ni n a c t i v a t e d w h e nt h es o yp r o t e i nh y d r o l y s a t e c o n t i n u e dt ob eh y d r o l y z e db yf l a v o u r z y m e t h eh y d r o l y s a t ep hv a l u eh a dn os i g n i f i c a n t v a r i a t i o n b u tt h ec o n c e n t r a t i o no fa m i n o n i t r o g e ni n c r e a s e dg r a d u a l l ya n da tt h es a l l l et i m e t h eb i t t e r n e s so ft h eh y d r o l y s a t ed e c r e a s e d w h e n h y d r o l y z i n gs o yp r o t e i nb y d i f f e r e n te n z y m e s ，v a r i a t i o nc u r v eo ft h ec o n c e n t r a t i o n o f a m i n o n i t r o g e n ，s o l u b l en i t r o g e nc o n t e n ti nt r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) ，t h e b i t t e r n e s so f s o yp e p t i d e s w i t hd hw e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t e ds h o w e dt h a td hi n c r e a s e dw i t h h y d r o l y s i st i m ep r o l o n g e d a n dt h et o t a lv a r i a t i o n 缸己n dw a st h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fa m i n o n i t r o g e n ，s o l u b l en i t r o g e nc o n t e n t i nt c a , t h eb i h e m e s so fs o yp e p t i d e si n c r e a s e dw i t h h y d r o l y s i s t i m e p r o l o n g e d u n d e rt h e s a m ed h ，t h ec o n c e n t r a t i o no fa m i n o n i t r o g e n i n c r e a s e dg r a d u a l l yi ns e q u e n c eo f a l c a l a s e ，p r o t a m e x ，p a p a i n 1 n h c h y d r o l y s a t ep r e p a r e db y p a p a i na n da i c a l a s eh a ds t r o n g e rb i t t e m e s st h a nh y d r o l y s a t eb yp r o t a m e x i na d d i t i o n ， b e c a u s eh y d r o l y s i sr a t ea n de f f i c i e n c yo fa i c a l a s ei sf a rh i g l l e rt h a nt h o s eo f p a p a i n ，u n d e rt h e s a m ch y d r o l y s i st i m et h eb i t t e r n e s so fa i c a l a s eh y d r o l y s a t ew a sh i g h e rt h a nt h a to fp a p a i n h y d r o l y s a t e a n t i l i n o l e i ca c i dp e r o x i d a t i o nc a p a c i t ya n dr a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t yo fs o yp r o t e i n h y d r o l y s a t e o b t a i n e d b ys i n 窑l ce n z y m e r e a c t i o na n d s t e pm u l t i e n z y m e r e a c t i o nw e r e d e t e r m i n e du s i n gl i n o l e i ca c i d - k s c nm e t h o da n dp y r o g a l l o lm e t h o d c o m p r e h e n s i v er e s u l t s m 华舞淫e 大学l ：学簿一 学位论文 o ft w o e x p e r i m e n t s i n d i c a t e dt h a ta n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo f s o yp r o t e i nh y d r o l y s a t ev a r i e dw i t h d hi nf o l l o w i n gl a w s f o rt h es a m ee n z y m e ( e n d o p e p t i d a s e s ) 。t h ed hi n c r e a s e da n dt h e b i t t e r n e s sa n da n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo ft h eh y d r o l y s a t ew e r ee n h a n c e dw i t hh y d r o l y s i st i m e p r o l o n g e d ；f o rt h es a m ed h ，t h eh y d r o l y s a t ep r e p a r e db y a l c a l a s ea n dp a p a i nh a ds t r o n g e r b i t t e m e s sa n dt h e i ra n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yw e r ea l s oh i 曲e rt h a nt h a to fp r o t a m e x o fa l l h y d r o l y s a t eo b t a i n e db ys i n g l ee n z y m e t h es o yp r o t e i nh y d r o l y s a t ep r e p a r e db ya l c a l a s ef o r 5 hh a dt h eh i g h e s ta n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y t h es o yp r o t e i nh y d r o l y s a t ep r e p a r e db ya l c a l a s ef o r5 hc o n t i n u e dt ob eh y d r o l y z e db y p a p a i n p r o t a m e xa n df i a v o u r z y m e 弧er e s u l t si n d i c a t e dt h a ti t sa n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yc o u l d b ei m p r o v e d b yp a p a i na n d b er e d u c e db y p r o t a m e x a n df l a v o u r z y m e 。 i no f d e rt od i s c u s st h ee f f e c to fm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fs o y p r o t e i nh y d r o l y s a t e o na n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y , t h eh y d r o l y s a t ew a ss e p a r a t e db ys e p h a d e xg - 2 5g e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y 1 麓cr e s u l t ss h o w e d t h a te n z y m e h y d r o l y s i so fs o yp r o t e i nw a su n e q u a l a n d i ns p i t eo fl o n gt i m eh y d r o l y s i s ，t h e r ew a sa b o u t4 0p e r c e n to fs o y p r o t e i nw h i c hw a so n l y h y d r o l y z e ds l i g h t l ya n d t h em o l e c u l a rw e i g h tw a ss t i l la b o v e5 o d a t h em o l e c u l a rw e i g h t d i s t r i b u t i o no fs o y p c p t i d e s w a sr e l e v a n tt o e n z y m e a n dd h i ti sn o t a b l et h a tt h e c o n c e n t r a t i o no fs o yp e p t i d e sa r o u n d1 0 0 0 - 2 0 0 0 d ai sh i g h e ri nt h eh y d r o l y s a t ew i t hw e l l a n t i o x i d a t i v e a c t i v i t y u s i n gs e p h a d e xg - 2 5g e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yt h es o y p r o t e i nh y d r o l y s a t ep r e p a r e d b y a l c a l a s ef o r5 hw a s s e p a r a t e d i n t ot w o p a r t s ，i e m o l e c u l a rw e i g h tl a r g e rt h a n2 0 0 0 d a a n d l o w e rt h a n2 0 d a t h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo ft h et w op a i t sw e r es t u d i e du s i n gl i n o l e i c a c i d - k s c n p y r o g a l l o le x p e r i m e n ta n do x i d a t i v eh a e m o l y s i se x p e r i m e n t o fh u m a nr e db l o o d c e l l 。蜀陋r e s u l t si n d i c a t e dt h a ts o yp e p t i d e so fm o l e c u l a r w e i g h tl o w e r t h a n2 9 d aw e r et h e m a i na n t i o x i d a t i o n p a r t 弧es o yp e p t i d e so fm o l e c u l a rw e i g h tl o w e rt h a n2 0 0 0 d aw e r ef u r t h e rs e p a r a t e db y l l i 馥- p e r f o r m a n c eg e lc h r o m a t o g r a p h y a n dw e r ed e t e r m i n e d b y m a l d i - t o fm a s s s p e c t r o m e t r i cm e t h o d 。t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a t t h em o l e c u l a rw e i f l a to ft h i s p a r t w a s m a i n l y a r o u n d1 1 0 0 d a f i n a l l yt h ea n t i o x i d a t i o nm e c h a n i s mo fs o yp e p t i d e sw a s d i s c u s s e d t h ec o n c l u s i o nw a s t h a ts o yp e p t i d e so fm o l e c u l a rw e i g h tl o w e rt h a n2 0 0 0 d ah a dh i g h e ra n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y t h e r e f o r ei ti sn e c e s s a r yt oi n c r e a s ed h t h e r e b yi n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no f s m a l lp e p t i d e s a n dt ou s et h ep r o t e a s e sw h o s ec l e a v a g es i t e sa r eh y d r o p h o b i ca m i n oa c i dr e s i d u e st h e r e b y e n h a n c cr e l a t i v eh y d r o p h o b i c d e g r e eo fa m i n o a c i ds i d ec h a i n k e y w o r d s s o yp r o t e i n ，e n z y m eh y d r o l y s i s ，m u l t i e n z y m eh y d r o l y s i s ，a n t i o x i d a t i o n ，r a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t y 学位论文原创性声明 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进 行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 关枣。辛日期：砣口哆年、月。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复i t i 4 手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保捌 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：关整率 导师签名：1 ， 趴 l | 日期：抄寥年杉月1 日 日期：少声，月r 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 生物抗氧化剂对人类健康的作用 大量的研究结果显示，人体内各器官、系统均会产生不同程度的自由基，但 在体内同时存在有消除氧自由基的防御系统，即由一些酶和非酶物质组成的抗氧 化系统。抗氧化酶有超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶f c a t ) 和谷胱甘肽过氧 化酶( g s h - p x ) 等。s o d 能使超氧自由基歧化为氧气和过氧化氢；c a t 可使过氧 化氢分解成为水和氧气；g s h p x 可使还原型的谷胱甘肽转变为氧化型的谷胱 甘肽，从而消除细胞中的有机或无机的过氧化物。非酶抗氧化剂有维生素e 、维 生素c 、b 胡罗卜素、谷胱甘肽等，它们也具有清除自由基的功能。这些抗氧 化剂在体内构成一个完整的系统，分别对从氧化过程的开始到最后生成过氧化氢 这一自由基连锁反应的不同环节起作用，使体内自由基形成和消除处于一种动态 平衡中。由于这时自由基与自由基防御系统处于动态平衡中，自由基并不会对机 体造成严重的损害。但是当机体剧烈运动后，或处于环境毒物影响下时，自由基 往往生成过多，或当机体处于生病、衰老、饮食不当情况下机体消除自由基能力 降低，这两种情况都会打破机体的自由基与抗氧化剂之间的平衡。自由基过量导 致细胞和功能的广泛性损害i t2 1 ，所以要通过适当补充外源性抗氧化剂来提高机 体抗氧化水平，抵御自由基的损害。 1 1 1 生物抗氧化剂分类和作用 在自由基生物学中的抗氧化剂常指化学与生物化学上具有抗氧化作用的 类化合物。包括内源性抗氧化剂和外源性抗氧化剂两大类。其中内源性抗氧化酶 类为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶及与这些 酶作用有关的其它酶，如谷胱甘肽转硫酶、谷胱甘肽还原酶等。这些酶的协同作 用有效的清除氧自由基及其衍生的活性产物。内源性非酶抗氧化剂是指生物体内 部产生的具有抗氧化功效的一类物质，包括金属硫蛋白、铜蓝蛋白、硒蛋白、谷 胱甘肽、新抗氧蛋白、胆红素、白蛋白及尿酸等。内源性非酶抗氧化剂和内源性 酶类抗氧化系统协同作用共同维护生物体内自由基的平衡。外源性抗氧化剂是指 生物体通过膳食、医药摄取的抗氧化剂。适当摄入外源性抗氧化剂可以降低体内 自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病1 4 。5 “7 】。常见的外源性抗氧 化剂包括以下几类。 华南理j ：人学i ：学博十学位论文 1 1 1 1 维生素类抗氧化剂 维生素类抗氧化剂主要是指维生素c 、维生素e 、b 胡萝b 素等。 1 维生素c 在参与生物体内氧化还原链的正常运转中起抗氧化作用，可保护 红细胞膜。清除生物体内活性氧。在生物体内氧化还原链中抗坏血酸不断被氧化 成脱氢抗坏血酸a ，再被还原成还原型a h 2 ，在其自动氧化过程中突出的化学性 质就是同时具有氧化和还原性质，故在维生素e 的再生和还原过程中，维生素c 起着重要的桥梁作用。维生素c 是人类身体必须的最重要维生素，人体没有制 造维生素c 的能力，维生素c 对身体胶原的形成是不可缺少的。维生素c 在身 体内形成一种重要的抗组织胺作用，减轻过敏症状特别是流鼻涕和咳嗽，缩短感 冒的病程。维生素c 能减轻由于吸入组织胺所诱发的呼吸道狭窄，保护和减轻 肺棉屑沉着病的症状，对纺织工人起到保护作用。维生素c 有助于降低胆固醇 水平，延缓动脉硬化的发生，防止血栓形成，使冠心病的症状减轻，防止心绞痛 和发生心梗。维生素c 能阻断身体内形成的某些致癌物质，有防治癌瘤的效应i s 9 i 。 2 维生素e 又称d 一生育酚，是最重要的抗氧化剂之一，在人体内不能自动 合成，是一种有效的自由基清除剂。维生素e 具有油溶特性，能插入到不饱和 脂肪酸存在的生物膜中。主要通过还原l 而中断不饱和脂肪酸过氧化在膜脂双 层内传播，防止活性氧对不饱和脂肪酸的氧化。从而保护生物体的细胞质、溶酶 体、线粒体、核d n a 免遭氧化损伤| 1 1 1 。维生素e 广泛分布于高等植物、藻类、 苔藓类中。 3 维生素a 包括视黄醇、视黄醛和视黄酸酯。维生素a 是视觉、生殖、维 持细胞生长发育等正常功能所必须的，可调节铜蓝蛋白和血液中的铜，在体内视 黄醇、视黄醛和视黄酸的生理功能是作为维生素a 类营养物质，因此人们往往 忽视了它们的抗氧化特性，实际上维生素a 类物质能够抑制肝微粒体脂质过氧 化，并能抑制亚油酸的氧化1 1 2 1 。维生素a 不是通过清除引发脂质过氧化的自由 基来抑制脂质过氧化，而是与反应生成的有机过氧化物结合，从而阻断链式反应。 4 类胡萝h 素有6 0 0 多种，是胡萝卜素与时黄素的总称。叶黄素是带有羟基、 甲氧基或环氧化物结构的类胡萝h 素。类胡萝h 素的抗氧化作用主要表现为能淬 灭单线态氧，并能够清除自由基i t3 1 ，其机制是其分子中有8 个或更多的双键结构， 可从1 0 2 获得能量从而使1 0 2 转变为基态。在此过程中类胡萝b 素本身转变为激 发态，但它们激发其它分子的趋势是极小的。而且由于类胡萝h 素的激发态与基 态之间存在一些相近能级，有利于通过与溶媒分子的作用而将激发态能力转化为 热能。 2 第一章绪论 1 1 1 2 植物来源抗氧化剂 在自由基研究领域，植物类来源抗氧化剂以它独特的功效受到大家的关注。 就目前资料报道情况看，有消除自由基作用的植物已达5 0 多种。植物来源抗氧 化剂主要有黄酮类化合物、酚羟基化合物、皂甙类化合物、生物碱类化合物以及 植酸等。 1 黄酮类化合物，这类物质大都呈黄色和具有4 位羰基。黄酮类化合物广 泛分布于植物界，根据苷原的基本结构可以分为黄酮、黄酮素、黄烷酮、黄烷酮 醇、异黄酮、查耳酮、花色素等十多种类型，目前研究发现黄酮类化合物可引入 供电子基团，具有生成稳定自由基作用，可阻止自由基链式反应、抑制脂质过氧 化反应，其临床所表现出的各种生物效应均与其抗氧化活性有关1 1 4 1 。 2 酚羟基化合物关于酚羟基化合物清除自由基作用有大量报道，含酚羟基 化合物的儿茶索、槲皮素和卢丁等对大鼠还原型谷胱甘肽耗竭所致的肝脏脂质过 氧化物升高有抑制作用。存在明显的量效关系；香辛料，如迷迭香、丁香、生姜 等因含有迷迭香酚、丁香酚、生姜酚等多种酚羟基化合物，也有很强的抗氧化活 性。茶多酚是绿茶提取物的有效成分，约占绿茶干重的1 5 2 5 ，其中类儿茶 素含量最高。茶多酚是对人体无害的天然抗氧化剂，能抑制食品的自氧化，并能 抑制细菌繁殖，防止食品腐败变质，而且能抑制生物体膜脂质过氧化，具有保健 功效，但茶多酚对j 下常细胞有一定毒性，作为保健品的成分，应规定使用量”i 。 3 皂甙类化合物人参皂甙有清除0 2 一、o h 自由基，抑制脂质过氧化作用。 人参叶总皂甙、人参果总皂甙可减少老年大鼠脑、心肌中褐脂质的生成并提高血 液中c a t 活性。绞股蓝皂甙具有类人参皂甙作用，不仅可提高s o d 活性，而且 有降血脂、耐缺氧的作用。具有抗氧化活性的皂甙类还有三七皂甙、西洋参皂甙、 竹节参总皂甙、柴胡皂甙等“l 。 4 植酸是肌醇的六磷酸酯，在大多数谷类、坚果类、豆类等植物中的含量 约为1 5 。它的抗氧化性能不是来自它与活性氧的反应，而是因为它与金属 离子的螯合作用，尤其是植酸与铁离子的高度螯合作用。一分子的植酸可与四个 铁离子结合，因此植酸抑制由f e - - 抗坏血酸系统催化的脂质过氧化反应。另外 植酸还可催化f e 2 + 氧化为f e “，由于植酸的存在，f e 2 + 与f e 3 + 的循环被打断，从 而可以有效抑制f c 2 + 介导下脂质过氧化反应。植酸的抗氧化作用可应用于预防结 肠癌的发生。据流行病学调查摄取植酸量高的人比摄取纤维素高的人还不易得结 肠癌l i o l 。 1 1 1 3 微量元素类抗氧化剂 人体必需的微量元素如锌、铁、铜、锰、硒、碘等是构成机体生命活动重要 华南理j 人学j 学博十学位论文 酶类和蛋白质的重要成份。微量元素以其自身的电子传递性质在生物体氧化还原 过程中起抗氧化作用，例如硒代半胱氨酸是硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶的活性 中心；铜是c u s o d 、z n s o d ，铜蓝蛋白的组成部分，并和过氧化氢酶，g s h p x 的活性有关。锌也是c u s o d 、z n s o d 的必须成分，可通过其螯合作用 来维持生物膜的难常功能，生物体内缺乏锌可使脂质过氧化水平升高。生物体内 的微量元素的生理作用是相互联系的，例如，缺锌时铜含量升高，铜和锌的含量 一同下降时引起铁含量升高，过量铁引起的失衡可通过抗氧化剂来调节i2 0 。 1 1 1 4 蛋白质、多肽、氨基酸类抗氧化剂 这类抗氧化剂在体内可以消化吸收，兼具营养和保健特性，具有广阔的应用 前景。 1 1 2 蛋白质、肽类、氨基酸的抗氧化活性 1 1 2 1 蛋白质抗氧化活性 生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类，而且蛋白质具有优良 的乳化型特性，能够在油水界面起到介导作用，对于清除生物体内过量自由基， 抑制膜脂质过氧化具有重要意义。蛋白质水解成多肽后，具有抗氧化作用的基团 充分暴露出来，能够更好的发挥抗氧化作用，往往蛋白质的水解物的抗氧化活性 比相应的蛋白质抗氧化作用更强。研究发现酪蛋白可减缓猪油的氧化，铁蛋白或 铁传递蛋白能与铁结合，因而可防止铁离子引起的h o 的产生和脂类的过氧化。 胆红素是血红蛋白等含铁卟啉的化合物在体内的代谢产物，游离的胆红素具有毒 性作用，但与人血清蛋白结合后，其分子螯合成无毒的形式，并且在低氧浓度下， 胆红素一血清蛋白结合物( a l b b r ) 是一种生理抗氧化剂，可有效地清除过氧自 由基。蛋白质的抗氧化活性多与s h 含量，适量补充高蛋白饮食可以减轻受辐射 后大鼠的氮代谢异常。此外有试验证实：用含硒蛋白质饲喂老年小鼠和大鼠，能 使老年小鼠淋巴细胞增殖，提高n k 细胞活性、血清凝集素水平以及吞噬率和吞 噬指数。提高大鼠的血清g s h - - p x 活性，降低血清m d a 含量2 3 2 “。 1 1 2 2 肽的抗氧化活性 作为抗氧化剂，蛋白质类物质中最有前途的当属肽类。肽类不仅在油溶体系 中有良好的增效作用，如双肽对a ，6 生育酚有增效作用，而且在水溶体系、 乳化体系及干燥体系中也有较高的抗氧化活性，构成肽的氨基酸种类、数量及氨 基酸的排列顺序决定着肽的抗氧化能力。一般说来，肽类的抗氧化能力大于氨基 酸，分子量在25 00 3 000 d a 的肽类较理想，以a l a 为n 未端的双肽中， a l a t v r ，a l a h j s 及a l a t r v 的抗氧化力很强，其他双肽也都比构成它们的氨基 4 第一章绪论 酸的抗氧化能力强。谷胱甘肽( g s h ) 是一种由甘氨酸、半胱氨酸和y 一谷氨酰 基组成的含巯基多肽类抗氧化剂，可清除自由基，其氧化态和还原态的比值 ( g s s g g s h ) 能够反映生物体内的氧化还原水平。谷胱甘肽在抗坏血酸和维生 素e 组成的氧化还原链中可使脱氢抗坏血酸在抗坏血酸还原酶作用下还原成抗 坏血酸，维持细胞内的自稳态，在生物体氧化还原链中和维持生物体内氧化还原 反应的平衡起着关键性作用，因此谷胱甘肤是一种高效的抗氧化剂，在人体内含 量高时人就健康和精力充沛，含量低时则患病与衰老的机率增高。通过重新补充 谷胱甘肽就可延缓衰老的进程。谷胱甘肽的主要功能是保护红细胞免受外源性或 内源性氧化剂的损害，除去氧化剂( 如0 2 一) 的毒性1 2 s 1 。史英钦等研究了丙氨酰 一谷氨酰胺= 肽对烧伤大鼠血清内谷胱甘肽浓度及抗氧化作用的影响，发现丙氨 酰一谷氨酰胺二肽能够增加烧伤大鼠血液内谷胱甘肽和s o d 浓度，减少血清黄 嘌岭氧化酶的浓度1 2 6 l 。林宏伟采用化疗联合谷胱甘肽治疗恶性肿瘤患者5 5 例， 旨在探讨g s h 对化疗药物所致肝功能损害的保护作用，试验结果表明，化疗期 问并用g s h 可预防并减少化疗药物对肝脏的损害，加速肝功能恢复，保证治疗 如期进行，使化疗收到满意疗效；并可改善患者化疗期间的生活质量，无副作用， 值得推广应用l2 7 】。肌肽( c a r n o s i n e ) 是由丙胺酸和组氨酸两种氨基酸形成的二 肽，它是一种得自骨骼肌的二肽，可防止肌肉受到铁离子催化的氧化作用，对于 含有2 的盐并且于1 5 贮存的生牛肉，添加1 5 的肌肤，其效果比添加1 5 三聚磷酸钠、a 生育酚和2 0 0 p p m b h t 的效果还要好i ：。j 。侯传记探讨肌肽对实 验性脑缺血再灌注的神经保护作用以及肌肽对缺血再灌注损伤后脑组织氧自由 基含量、脂质过氧化物生成量和细胞丢失的作用。结果显示使用肌肽的治疗组的 氧自由基和脂质过氧化物的生成量均显著低于对照组( p 一c h r - c o o 一+ + n h 3 一c h r ”- 第二章人豆蛋白的单酶水解研究 ( 3 ) 氨基的滴定 + n h 3 一c h r ”+ o h 一；2 2 兰2n h 2 一c h r ”+ h 2 0 根据上述反应，采用在水解液中加入碱来保持水解液的p h 不变，通过记录 消耗的碱量，可以知道蛋白质的肽键断裂的情况，从而可以计算出蛋白质的水解 度，此即水解度的p h s t a t 测定方法。采用p h - - s t a t 测定方法的优点是可以连 续测定大豆分离蛋白的水解度，精细