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嗜热真菌的分离鉴定及其固态发酵产木聚糖酶的初步研究 摘要 嗜热真菌( t h e r m o p h i l i cf u n g i ) 是自然界中一类能够在极端高温条件 下生长存活的特殊真菌类群，其最低生长温度为2 0 或2 0 以上，最高 生长温度为5 0 或5 0 以上。嗜热真菌在高温条件下具有独特的生存适 应能力，并且还可产生嗜热酶等特殊的代谢产物，因此它已经成为研究 热稳定酶和生物进化的重要微生物来源。 2 0 0 7 年5 月 - 2 0 0 8 年4 月作者从广西南宁市及周边地区的食用菌 发酵料、堆肥、土壤等采集样品1 0 0 余份，分离到嗜热真菌2 0 株，通 过形态学比较研究并结合分子分析方法，鉴定出嗜热真菌4 种，即杜邦 青霉p e n i c i l l i u md u p o n t i i 、疏棉状嗜热丝孢菌t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s 、 嗜热子囊菌t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s 、嗜热革节孢s c y t a l i d i u m t h e r m o p h i l u m 。此外，还分离到耐热真菌1 种，鉴定为不规则头梗霉 c e p h a l i o p h o r ai r r e g u l a r i s ，为中国新记录种。这些研究结果新增了嗜热真 菌在广西的分布记载，丰富了我国嗜热真菌的菌种资源库。 对分离获得的嗜热真菌进行木聚糖酶活性测试，发现嗜热子囊菌产木聚 糖酶活力最强。以本地廉价的农业纤维废弃物为主要原料，对嗜热子囊 菌进行固态发酵生产木聚糖酶的研究，分别采用单因素及正交试验法， 对产酶条件进行优化。结果发现，产酶最佳的培养基为麸皮3 0 ，玉米芯 3 5 ，高粱秆3 5 ；培养基初始p h 为6 ，含水量为7 5 ，发酵温度为5 0 。c ， 培养时间为6 天，木聚糖酶活力最高可达至f j l 5 9 5 i i u g 干基碳源。与此同时， 对该菌所产木聚糖酶的酶学性质也进行研究，发现该酶的最适反应温度 为7 0 。c ，在7 0 。c 保温1 小时后残余酶活力还在8 7 以上，耐热性能优良； 最适p h 值为4 5 左右，木聚糖酶在p h 4 0 6 0 条件下保温1 小时依然保留9 0 左右的酶活力，属于偏酸性酶。 本研究主要研究是对广西地区的嗜热真菌资源调查及分类研究，并对 获得的嗜热真菌进行木聚糖酶活性比较得到一株产木聚糖酶活性高的菌 株，在此基础上，以该菌株为试验菌株，以广西农业纤维废弃物为主要 原料，进行固态发酵产木聚糖酶的研究，为该类废弃物的开发利用提供 基础资料，因而具有重要的意义。 关键词：嗜热真菌分类嗜热子囊菌固态发酵木聚糖酶 s t u d yo ni s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n o ft h e r m o p h i l i cf u n g ia n dt h e i rx y l a n a s e p r o d u c t i o nu n d e rs o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n a b s t r a c t t h e r m o p h i l i cf u n g ia r et h o s et h a th a v eag r o w t ht e m p e r a t u r em i n i m u m a to ra b o v e2 0 0 ca n dag r o w t ht e m p e r a t u r em a x i m u ma to ra b o v e5 0 0 c t h e r m o p h i l i cf u n g is u r v i v e a n dg r o wu n d e rh i g ht e m p e r a t u r ec o n d i t i o n ， p r o d u c i n gs p e c i a lm e t a b o l i z a t i o ns u c ha st h e r m o z y m e s ，s o m eo f w h i c hh a v e b e e ns e l e c t e da sm o d e l sf o rs t u d y i n gb i o l o g i c a le v o l u t i o na n dt h e r m o s t a b l e e n z y m e s f r o mm a yo f2 0 0 7t oa p r i lo f2 0 0 8 ，a b o u t10 0s a m p le so fc o m p o s t ， m u s h r o o mr e s i d u e sm a t e r i a la n ds o i lw e r ec o l l e c t e df r o mn a n n i n go f g u a n g x i ，2 0s t r a i n so ft h e r m o p h i l i cf u n g iw e r ei s o l a t e df r o mt h e s es a m p l e s f o u rs p e c i e so ft h e r m o r p h i l i cf u n g iw e r ei d e n t i f i e d ，a m o n go ft h e m ，i n c l u d i n g p e n i c i l l i u md u p o n t i i ，t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s ，t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s a n ds c y t a l i d i u mt h e r m o p h i l u m o n et h e r m o t o l a r e n tf u n g u sw a sa l s oi s o l a t e d a n di d e n t i f i e d ，t h a ti sc e p h a l i o p h o r ai r r e g u l a r i s ，w h i c hn e wr e c o r df o rt h ef i r s t t i m ei nc h i n a a m o n go ft h eo b t a i n e ds t r a i n s ，t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u sg x u 0 3w a s t h e b e s ts g a i np r o d u c i n gt h eh i g h e s tx y l a n a s ea c t i v i t y t h e r m o s t a b l ex y l a n a s e w a sp r o d u c e db yt h es t r a i ng x u 0 3u s i n gd i f f e r e n ta g r i c u l t u r a lw a s t e sa st h e s u b s t r a t ef o rs o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n si n g l ef a c t o re x p e d m e n tw a sp e r f o r m e d f i r s t l y , t h e no r t h o g o n a lt e s tm e t h o dw a su s e dt oe x p l o r et h e s ef a c t o r s i tw a s f o u n dt h a tt h eb e s te n z y m ep r o d u c t i o nm e d i u mi n c l u d i n g30 o fw h e a tb r a n ， 35 o fc o r nc o b ，35 o fs o r g h u mr e s i d u e ；m e d i u mi n i t i a lp ho f6 ，t h ei n i t i a l m o i s t u r ec o m e n to f7 5 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r eo f5 0 ，t h ec u l t u r et i m e w a s6d a y s ，x y l a n a s ea c t i v i t yu pt o15 9 5iu 儋d r yo fc a r b o ns o u r c e t h e p r o p e r t i e so fx y l a n a s ef r o mt h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u sw e r ea l s ob es t u d i e d ， t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a le n z y m er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s7 0 。c ， w i t he x c e l l e n tt h e r m o s t a b i l i t y , x y l a n a s er e t a i n s8 7 o fi n i t i a la c t i v i t ya f t e r i n c u b a t i o nf o r1ha t7 0 。c ；t h eo p t i m u mp hf o rx y l a n a s ea c t i v i t yw a s4 5 ， a n dt h ea c t i v i t yo fx y l a n a s er e t a i n i n ga b o u t9 0 o ft h ei n i t i a la c t i v i t ya f t e r i n c u b a t i o nf o r1hb e t w e e n4 0a n d6 0 ，w h i c ha r ea c i d i ce n z y m e s t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a st oi n v e s t i g a t ea n di d e n t i f yt h es p e c i e so f t h e r m o p h i l i cf u n g if r o mn a n n i n go fg u a n g x i ，d i f f e r e n ta g r o r e s i d u e sw e r e e v a l u a t e da ss u b s t r a t e si ns o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o nf o rx y l a n a s ep r o d u c t i o nb y t h e s e f u n g i ，w h i c hp r o v i d e d i n f o r m a t i o n r e g a r d i n gd e v e l o p m e n t a n d l 】t i1i z a t i o no ft h e s er e s i d t l e si nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：t h e r m o p h i l i cf u n g i ；t a x o n o m y ；t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s ； s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n ；x y l a n a s e i i 承诺书 广西大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下完成的，研究工作所取 得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已 经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究 工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：魏群 日期： 2 0 叩年占月刁日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不 以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论 文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索 与阅览服务：学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢 利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。坏保密。 学位论文全文电子版提交后： 蜩意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 作者签名：日期： 导师签名： 赵：l 途。 日期： 广西大掌硕士掌位论文嗜热j u i 的分离鉴定及其固态发醇产木聚糖葺每的初步研究 第一章前言 1 1 嗜热真菌研究进展 嗜热真菌( t h e r m o p h i l i cf u n g i ) 为自然界中一类能够在最低温度为2 0 。c 或2 0 。c 以 上环境生长，最高生长温度为5 0 或5 0 以上生长存活的特殊真菌类群，而把最低生 长温度在2 0 以下，最高生长温度为5 0 。c 的则称为耐热真菌( t h e r m o t o l e r a n tf u n g i ) ， 二者的关键区别在于能否在2 0 c 以下生长 1 3 】。嗜热真菌因在高温条件下具有独特的 生存适应能力，并可产生多种嗜热酶等特殊的代谢产物，现已经成为研究热稳定酶和 生物进化的重要微生物来源。近年来，嗜热真菌在国内外的研究很活跃，主要表现在 分类学、酶学、应用研究等方面都取得了重要的研究进展。 1 1 1 分类研究 早在1 0 0 多年前，嗜热真菌就已被发现，世界上第一个嗜热真菌m u c o rp u s i l l u s 是 i 主t l i n d t 于1 8 8 6 年描述的【4 】。随后，t s i k l i n s k a y a 发表嗜热真菌t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s ； m i e h e 描述t h e r m o m y c e sa u r a n t i a c u s 和m a l b r a n c h e ac i n n a m o m e a ；g r i f f o n & m a u b l a n c e 描述t a l a r o m y c e st h e r m o p h i l u s 5 。】。早期人们发现嗜热真菌的物种数量较少，自 l a t o u c h e l 8 于19 5 0 年报道嗜热真菌c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u m 具有降解纤维素的能力以 来，人们对嗜热真菌的研究兴趣大增。1 9 6 4 年c o o n e y & e m e r s o n 出版了嗜热真菌的第 一部专著，该书涉及嗜热真菌的系统学、形态学及生物学等方面，首次对嗜热真菌的 概念进行界定，并描述了嗜热真菌】3 个种和2 个变种，使嗜热真菌的分类研究进入快 速发展时期i l j 。后来，由于有些研究者将最适生长温度在4 0 或4 0 。c 以上的耐热真菌 也纳入嗜热真菌的范畴，一度造成了嗜热真菌概念的混淆。m o u c h a c c a 2 1 首次全面系 统地对嗜热真菌种的命名、分类地位和种存在的合理性以及同种异名现象进行了修 定，并重新强调t c o o n e y & e m e r s o n 的概念，这是一篇关于嗜热真菌多样性和分类现 状的权威性评述资料。最近，s a l a r & a n e j a 【9 j 对世界上已发表的嗜热真菌种类进行全 面的评述和修订，首次承认4 2 个种，其种5 个种为接合菌，2 3 个种为子囊菌，1 4 个种 为无性型真菌( 半知菌类) ，作者还提供了嗜热真菌鉴定的检索表，以及每个物种的 地理分布和生长基物等信息。 我国嗜热真菌的分类研究起步较晚，1 9 8 8 年陈桂玉和陈瑞青首次报道台湾的嗜热 广西大学硕士掌位论文嗜热真菌的分离鉴定及其固态发酵产木聚糖嗣f 的初j | 卜】开究 真菌6 个种、耐热真菌2 个种，随后陈桂玉及其合作者又多次报道台湾的嗜热真菌 0 0 - 1 3 】。1 9 9 7 年李多门i 等开始报道我国大陆的嗜热真菌【1 4 1 ，并系统开展我国嗜热真菌的 分类研究，他们共分离鉴定嗜热真菌1 4 种，包括1 个新种【”】。到目前为止，我国已知 报道的嗜热真菌有2 8 个种。 1 1 2 酶学研究 嗜热真菌可产生多种热稳定性酶，其中主要包括耐热木聚糖酶、嗜热蛋白酶、纤 维素酶、淀粉酶、葡萄糖异构酶等t 3 j ，其中耐热木聚糖酶是嗜热真菌酶学研究的热点。 嗜热真菌能够分泌胞外木聚糖酶，所产的耐热木聚糖酶高温条件下不仅在具有耐 高温的性能而且产酶水平较高，非常适合工业化酶制剂的生产。国际上嗜热真菌产耐 热木聚糖酶的研究文献报道很多，研究菌株主要集中在疏棉状嗜热丝孢菌( z l a n u g i n o s u s ) 和嗜热子囊菌( z 口z ，m 朋泐c 姗) 两个种f 1 6 捌】。疏棉状嗜热丝孢菌所产的木聚 糖酶活水平很高，既耐热又具有良好的耐碱性能，在造纸工业上表现出很好的应用前 景【2 l 】。国内杨绍青等研究了嗜热拟青霉j 1 8 固体发酵产木聚糖酶，并对其固态发酵产 酶条件进行了优化f 捌；李秀婷【2 3 1 等对zl a n u g i n o s u s 耐热木聚糖酶活性中心研究发现， 色氨酸和谷氨酸( 或天冬氨酸) 残基是维持酶活性的两个重要基团，前者位于该酶的 底物结合中心，而后者可能位于酶的催化中心。 嗜热蛋白酶也是嗜热真菌酶学研究的一个热点。在发酵、酿造、食品、日用化工： 纺织、制革、医药等工业和农业领域中该类酶都具有广泛的应用价值，特别是其在高 温条件下具有良好的热稳定性和高活力，因此不仅可以从理论上阐明酶的耐热机制， 而且在实际应用领域中也具有重要意义。早在1 9 7 0 年代，国外就开始嗜热真菌产嗜热 蛋白酶的研究阱，2 5 1 。最近，m a c c h i o n e 等【2 6 】通过比较9 个不同嗜热真菌固态发酵产蛋 白酶的研究，发现zl a n u g i n o s u s 在以麸皮为基质的固态发酵培养时酶活力最高。国内 刘振伟和李多) 1 1 1 2 7 1 、朱俊华等【2 8 】也对疏棉状嗜热丝孢菌热稳定蛋白酶的产生条件、 分离纯化及特性等也进行了报道，得出了该酶的酶学性质，如最适反应温度、最适p h 和半衰期。 嗜热真菌的其它酶学研究也获得重要的进展。最近，b r i e n z o 等对耐热子囊菌 酶学研究的最新进展进行了评述，共涉及到该菌1 9 个不同来源的菌株所产的2 1 种不同 种类的嗜热酶，这些酶的酶活力很强，而且具有广阔的工业应用前景。国内对嗜热真 菌产生的热稳定葡萄糖淀粉酶、热稳定仅2 淀粉酶、酸性0 【2 淀粉酶、内切b 2 葡聚糖酶 2 广西大国昀炙士掌位论文嗜热i l 菌的分离鉴定及其固态发醇产v 一聚糖酶的初步研究 等的研究也取得可喜进展 1 4 , 3 0 , 3 1 】。 i i 3 应用研究 嗜热真菌所产酶系丰富，对复杂碳水化合物具有较强的生物转化功能，目前嗜热 真菌的应用主要表现在蘑菇培养料的堆制发酵、有机废弃物的堆肥化处理、固体酒曲 生产等领域。 1 1 3 1 嗜热真菌在蘑菇堆肥中的应用 在蘑菇培养发酵料广泛存在着嗜热真菌，s t r a a t s m ae ta 1 【3 2 1 首次曾从蘑菇培养料 中分离到2 2 种嗜热真菌，发现嗜热革节孢( s c y t a l i d i u mt h e r m o p h i l u m ) 为其中的优势 种，在整个堆肥发酵阶段都广泛分布，同时还发现嗜热革节孢在内的9 种嗜热真菌对 蘑菇菌丝的生长还具有促进作用。嗜热真菌在堆肥发酵过程中后期和蘑菇培养料二次 发酵培养阶段都表现为优势微生物。其后，b e l s k n o i n ge ta 1 【3 3 1 研究发现嗜热黑腐质 霉( h u m i c o l an i g r e s c e n s ) 较多的培养料中其蘑菇产量也较高，并指出用黑腐质霉作 为判定培养料发酵成熟度的指示性真菌。w i e g a n t 3 4 】研究实验也表明，嗜热革节孢在 蘑菇堆肥生产过程中是一种很重要的嗜热真菌，通过代谢途径可为蘑菇生长提供一个 合适的c 0 2 浓度，有利于提高蘑菇的产量。d e f i k x t ”】贝i j 认为蘑菇菌丝在呼吸代谢途经 期间，会产生一种极微量的细胞色素酶类抑制剂，这种抑制剂可以阻碍嗜热真菌的生 长，而对蘑菇的生长则有促进作用，当两者竞争蘑菇处于优势地位时，最终会把处于 劣势的嗜热革节孢的菌体蛋白作为其的营养来源；另外，嗜热真菌还能够大量分泌 c l 酶，弥补蘑菇菌丝分泌纤维素酶中c 1 酶活性极弱的缺点。因此，嗜热真菌可作为 增温发酵剂应用于蘑菇培养料堆制。 1 1 3 2 嗜热真菌在有机废弃物处理中的应用 地球总生物量的6 0 - - 8 0 为纤维素，它是可再生生物资源最主要的来源【3 6 1 。 农作物秸秆、工业生产的有机废物和城市垃圾等纤维废弃物资源数量巨大，研究表明 堆肥中对纤维素、木质素降解能力较强的微生物主要是嗜热真菌和嗜热放线菌f 3 7 】。 堆肥法是目前对资源化、无公害化处理的重要手段之一，它依靠自然界广泛分布 微生物或某些特定微生物发酵剂，对废弃物在特定p h 、温度条件下进行发酵降解处 理，促进有机物转化为稳定的腐殖质【3 8 】。 堆肥法的发酵历程主要为中温和高温两个阶段，堆肥中的高温发酵阶段是嗜热真 菌主要集中的时期，通过接替堆肥中的中温菌群主导发酵进程【3 9 4 0 】。当可溶性碳源物 3 广西大鼍酞页士学位论文1 热真菌的分离囊；定及x - 固态发酵产术聚糖酶的初步研究 质如糖、有机酸等在堆肥中已被其它微生物消耗殆尽，等待嗜热真菌的则主要是以纤 维素为主的多糖类组分，但有趣的是有些嗜热真菌却不能利用纤维素，如z l a n u g i n o s u s ，zd u p o n t i i ，m a l b r a n c h e ap u l c h e l i av a t j “珈t e a ，m u c o r p u s i l l u s 等【4 1 1 ，这些 真菌通常只能利用共生伙伴降解纤维素、半纤维素时释放的糖进行生长，它总是与纤 维素降解菌协同生长，比如zl a n u g i n o s u s 与纤维菌c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l e 混生时生长 很好。因此，嗜热真菌在堆肥法处理有机废弃物起着重要的作用。 1 1 3 3 嗜热真菌在酿酒、食品上的应用 嗜热真菌现已广泛用于酿酒行业。中国许多著名的大曲酒发酵过程都有嗜热真菌 的参与，例如麸曲酱香型白酒的生产工艺就是利用高温堆积和高温发酵工艺流程【4 2 】， 因此，为提高酒的质量、降低粮耗适当地将嗜热真菌应用到酒曲生产中，有着十分重 要的价值【4 3 】。另外，嗜热真菌在食品上的应用主要是其产生的耐热木聚糖酶可以增大 面包体积、改善面包的组织结构，防止面包快速老化畔】。 1 2 木聚糖酶研究进展 1 2 1 木聚糖酶 木聚糖是植物半纤维素的主要组分，在自然界中的含量仅次于纤维素，其主链由 木糖残基以1 3 - 1 ，4 键连接而成。木聚糖酶( 1 ，4 1 3dx y l a nx y l a n o h y d r o l a s e ，e c 3 。2 。1 8 ) 广泛存在于各种微生物中，对自然界中大量半纤维素的降解起着重要作用。该酶 主要以内切方式水解木聚糖分子中的p 1 ，4 木糖苷键，水解产物主要为寡聚木糖，同 时伴有少量的木糖和阿伯糖，产生的木糖可转化为化工原料木糖醇，而寡聚木糖具有 特殊的生理功能，它叮增殖动物肠道内的双歧杆菌，木聚糖酶在饮料工业和制桨造纸 中也具有潜在应用价值。 木聚糖酶也属于一种诱导酶和复合酶，分子量范围一般在8 0 0 0 1 5 0 0 0 之间，目前 国内主要利用霉菌、放线菌来生产木聚糖酶，但多数菌株属于中温型微生物，产酶温， 度为2 8 - - - 3 0 ，生产的木聚糖酶热稳定性差且活力低，以致限制该酶的应用领域。而 嗜热真菌所产的木聚糖酶的最适温度范围一般为4 0 c 6 0 。c ；最适p h 范围为4 7 ；等电 点一般在3 1 0 之间，木聚糖酶的氨基酸组成相差也不大，主要为丙氨酸、甘氨酸、谷 氨酸、丝氨酸等【4 5 】，其特点是产酶速度快、量大且分解木质纤维效率高，极具开发潜 力。 4 广西大学硕士掌位论文1 r 热鼻菌的分离鉴定及其固态发曹事产木聚糖酶的初步研究 1 2 2 木聚糖酶的诱导底物 生产高产量木聚糖酶的关键因素是选择合适的木聚糖酶高产菌株、适合的诱导底 物( 主要是碳源的选择) 以及最佳的培养基组成和培养条件。由于丝状真菌较酵母和 细菌能够产生更大量的木聚糖酶，因此倍受研究者的青睐。但缺点是在产木聚糖酶的 同时往往纤维素酶也伴着产生m 】，这与纸浆造纸工业所要求的木聚糖酶中不含有纤维 素酶活性相冲突。 因此，在利用真菌进行发酵产单一成分木聚糖酶时，一般以不含纤维素的木聚 糖为碳源且将培养基中的氮碳比控制在较低水平时，往往可以得到无纤维素酶活性的 木聚糖酶【4 7 】。但是，较高活性的木聚糖酶的获得，对于一些微生物来说，加入纤维素 类物质在培养基中是必不可少的，女f l t h e r m o m o n o s p o r ac u w a t g 、n e u r o s p o r ac r a s s a 等 【4 8 ，4 9 】 o 某些底物不仅可以作为诱导物也可以作为抑制剂，在某些菌株中它能够使木聚糖 酶活力提高，而在另外一种菌株产木聚糖酶的过程中却充当抑制剂的作用，如木糖能 够提高链霉菌( 跏印幻叼旧嚣l i v i d a n s ) 2 趸a u r e o b a s i d i u mp “觑肠珊木聚糖酶活性 5 0 - 5 1 但 却抑制隐球( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 木聚糖酶的产生【5 2 】。 另外，还有一些影响微生物木聚糖酶产生的关键影响因子，如底物数量、化学性 质、底物与木聚糖酶的结合紧密程度等等。另外由半纤维素降解释放出来的木糖往往 可以抑制木聚糖酶活性，充当抑制剂的作用。所有这些影响因子对于微生物产木聚糖 酶的表达分泌具有综合效用。 1 2 3 固态发酵生产木聚糖酶 目前，木聚糖酶的生产主要是利用微生物通过液态发酵和固态发酵方法生产，但 两种发酵方式各有优缺点。利用廉价的作物秸秆如麸皮、玉米芯及甘蔗渣等富含木聚 糖的材料为碳源的固态发酵，对能源和机械设备等的要求不高，操作技术比较简单， 生产成本也低，单位体积培养基的酶产率远高于液态发酵，但固态发酵酶系比较复 杂，且常伴有纤维素酶的产生，不容易控制，难以精确测量木聚糖酶的产量；而液态 发酵完全是在液体环境下进行。底物的利用、产物的生成都以溶液的形式扩散，使整 个发酵过程保持在一个均匀条件下进行，容易机械化，但缺点是设备要求高，技术要 求比较严格，成本高 2 0 , 5 3 - 5 5 】。 在酶制剂的生产过程中，影响酶生产成本的重要因素是作为碳源的材料成本价 5 广西大学硕士掌位论文- 蕾热真菌的分离鉴定及其固态发酵产术聚糖酶的初步研究 格，因此，适宜的碳源对提高木聚糖酶的产量至关重要。研究表明，许多丝状真菌合 成和分泌胞外木聚糖酶的专一底物为木聚糖，但纯木聚糖制备工艺复杂，价格昂贵， 不利于实际生产的需要。而固态发酵能够利用廉价的富含木聚糖的农业纤维废弃材料 为原料生产木聚糖酶。因此，目前，国内外主要采用固态发酵转化廉价农业废弃物生 产木聚糖酶，整个过程不仅实现对农业废弃物的综合利用和木聚糖酶的高效生产，而 且还可以减少废弃物对环境的污染。 国内在嗜热真菌固态发酵产木聚糖酶研究方面进展较快，杨绍青等【捌报道嗜热拟 青霉j 1 8 固态发酵产木聚糖酶达到了) 8 5 8 0 u g 干基碳源，是国际上为数不多报道产木 聚糖酶水平超过1 5 0 0 0 i u g 的高产真菌；周秀梅和夏黎明f 5 6 1 以麸皮、玉米芯等进行嗜 热子囊菌固态发酵，在优化培养基条件下木聚糖酶活力最高达到1 0 3 2 1 u 儋干基碳源； 而李秀婷等吲报道的疏绵状嗜热丝孢菌变种经过优化固体发酵培养，最高木聚糖酶活 力达1 5 0 2 3 i u g 干基碳源。 1 2 4 耐热木聚糖酶的应用 木聚糖酶可应用于食品、饲料、造纸等很多行业，具有比较广阔的应用前景【2 9 】。 而耐热木聚糖酶因其在高温条件下的高活力和酶的热稳定性，因此在木聚糖产业中具 有更大的竞争优势，应用更为广泛，目前包括日本、美国在内的很多国家都启动了嗜 热真菌酶的研究计划。 1 2 4 1 食品工业 木聚糖经木聚糖酶作用后的水解产物如木糖和低聚木糖等可广泛应用于食品工 业。人体肠道内的低聚木糖残存量高，它具有极好的双歧杆菌增值活性【5 8 】，而且甜度 低，使用后血浆中葡萄糖量不会迅速增加，为糖尿病患者和肥胖者所青睐【5 9 1 。日本己 利用固定似o r y z a e 和a n i g e r 来生产低聚木糖。因此在国外利用木聚糖酶水解底物的 特异性和作用模式一度成为研究热点【6 0 1 。生产低聚木糖，不仅可以促进我国低聚糖工 业的生产向着一个新的方向发展，而且可以带动我国处理农业废弃物的步伐，让其变 废为宝，既充分利用了资源，又保护了环境，因此具有重大的经济效益和社会效益。 另外，在面包焙烤工业木聚糖酶业被广泛应用。国外研究的报道比较多，主要是 向面粉中添加木聚糖酶作为面粉的品质改良剂，改善对过度发酵面团的稳定性和耐受 性，增大烘烤后面包体积，提高入炉急涨性能，并降低面包的老化速率，6 1 1 。 1 2 4 2 造纸工业 6 广西大掌硕士掌位论文嗜热，l r 的分离疆 定及其固态发醇产术聚糖酶的初步研究 芬兰科学家v i i k 撕等于19 8 6 年【6 2 】首次提出木聚糖酶可应用于纸浆漂白。此后，国外 掀起了研究木聚糖酶进行纸浆助漂的热潮，尤其在造纸和纸浆工业中禁止使用氯的情 况下，西欧和北美一些国家开始利用木聚糖酶来预漂纸浆，提高木素溶出率，减少化 学漂剂用量，改善纸浆的漂白性能，从而达到在不污染环境的前提下改善纸张特征的 目的。对木聚糖酶应用于纸浆助漂研究报道很多，主要包括漂白前的酶处理过程，此 过程能够提高漂白效果，优化和调整纸性能，降低纸浆的卡伯值等【6 3 石5 1 。因此利用木 聚糖酶辅助漂白，不仅可以减少漂白过程中化学药品的利用量，避免有毒化学物质流 入环境，还可以提高纸浆的白度。利用木聚糖酶进行辅助漂白已被证实是对环境 友好的生物漂白技术之一【6 引。 国外有关生物酶助漂的研究和生产应用大多都是基于木浆为原料【6 7 1 。而国内的研 究则大多涉及非木材纤维浆。但是，目前研究木聚糖酶要么不耐热且偏酸性，要么含 有纤维素酶活力，这与纸浆漂白所要求的木聚糖酶耐热且偏碱性性能相背离，因此限 制国内木聚糖酶生产应用，不能满足纸浆漂白所需要的木聚糖酶偏碱性和只含有单一 木聚糖酶的要求，缺乏实际应用价值，这也是导致我国生物助漂实际应用落后于国外 的原因之一。因此，生产既耐热又耐碱且不含纤维素酶的木聚糖酶制剂是解决我国以 生物酶助漂减少环境污染问题的关键。 1 2 4 3 生物燃料工业 木聚糖酶在生物燃料方面也具有很好的应用前景。它利用纤维素酶与木聚糖酶的 协同作用高效降解农业废弃物植物纤维原料的基理，让其彻底水解为单糖，再进一 步借助基因工程和发酵工程技术使水解后的小分子物质发酵转变为酒精，具有极大的 实际应用价值，也是现在燃料酒精研究开发的热点研究问题。 1 3 本课题的目的和意义 木聚糖酶广泛应用于食品、饲料、化工、制药等领域。目前木聚糖酶的生产菌种 主要是中温菌，由于中温菌具有产酶慢，酶系比活力不高且耐热性能不强等缺点，限 制了木聚糖酶的应用。嗜热真菌能够分泌耐热胞外木聚糖酶，而且酶活力强，具有更 广阔的应用前景。本研究拟对广西南宁的嗜热真菌进行调查、分离和鉴定，收集菌种 资源并从中筛选出木聚糖酶高产菌株，在此基础上，以广西主要农作物秸秆为基质， 进行固态发酵生产木聚糖酶的研究，为农业纤维废弃物的有效利用和木聚糖酶的高效 生产提供理论依据，因而具有重的理论和经济意义。 7 广西大掌硕士掌位论文嗜期门。盘r 的分离鉴定及其固态发酵产木聚糖酶的初步研究 第二章嗜热真菌的分离与鉴定 2 1 引言 嗜热真菌为自然界中一类既可以在最低温度2 0 。c 或2 0 。c 以上环境下生存，又可以 在最高生长温度5 0 。c 或5 0 c 以上存活的的特殊真菌类群，在高温条件下表现出独特的 生存适应能力和特殊的代谢产物，并可产生嗜热酶等特殊的代谢产物，是研究生物进 化和热稳定酶的重要微生物来源。我国地域广阔，地形地貌多样化，气候类型多变， 为世界1 2 个高度生物多样性国家之一，真菌资源丰富。由于嗜热真菌生长于极端高温 环境下，在实验室常温下极少生长或不生长，而在高于常温范围内却生长良好，所以 不易被发现，这也正是嗜热真菌被生物学家们普遍忽视的原因。近年来鉴于嗜热真菌 在高温条件下表现的热稳定性和酶的高活力，已被广泛应用于酿造、发酵、食品、日 用化工、纺织、制革、医药、废物处理等领域中。嗜热真菌是一类具有重要应用价值 的生物资源，而广西尚未有人进行这方面的研究，我们开展嗜热真菌的调查和分类研 究，为该类特殊真菌的开发利用提供基础资料，具有重要的理论和经济意义。 2 2 材料与方法 2 2 1 样品采集 2 0 0 7 年5 月 2 0 0 8 年4 月，先后几次到南宁市及其周边地区采集样品，采集物 主要包括高温堆肥、木薯淀粉渣、木屑堆、朽木条、腐烂稻草、树叶、土壤等样品。 采集方法主要根据采集物而定，堆肥样品自堆肥中心取样，最好是当堆肥中心温度达 到5 0 以上时采集；土样采集时，先用洁净工具刮去土壤表层覆盖物，取离表层土 壤深o 1 0 c m 的土壤，同一采集点多处取样后再将其均匀混合，装入具有封口膜的塑 料袋中，每份土样采集量为2 0 5 0 克，并用记号笔在塑料袋上标明编号、土表植物、 地点、采集时间。 2 2 2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基( p d a ) 马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂1 6 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 自然 酵母胰蛋白胨葡萄糖琼脂培养基培养基( y g ) 酵母膏3 9 ，胰蛋白胨5 9 ，葡萄糖5 9 ，琼脂2 0 9 ，水1 0 0 0 1 m l ，p h 自然 孟加拉红培养基( r b a ) 8 广西大掌硕士掌位论文嗜热真l m 的分离鉴定及其固态发醇产术聚糖酶的初步研究 蛋白胨5 0 9 ，葡萄糖1 0 0 9 ，k h 2 p 0 4 1 0 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，琼脂2 0 9 ，孟 加拉红0 0 3 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 0 2 2 3 主要仪器设备 生化培养箱上海跃进医疗器械厂 电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂 往复式恒温摇床上海智城分析仪器制造有限公司 超净工作台 一 苏州净化设备厂 pcr仪thovmo e l e c t r o nc o r p o r a t i o n 电泳仪北京六一仪器厂 酶标仪奥地利t e c a n 公司 冷冻离心机中科院武汉科学仪器厂 显微镜o i ，咿u so p t i c a lc o 灭菌锅上海博迅实业有限公司 酸度计 上海雷磁仪器厂 超低温冰箱美国f o r m a 公司 分析天平德国赛多利斯 2 2 4 主要试剂 链霉素：聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) ；石英砂；t r i s 饱和酚：氯仿：异戊醇( 2 5 - 2 4 ： 1 ) ；氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ；7 5 7 , 醇；e b 溴化乙锭( 1 0m g m 1 ) 6 l o a d i n gb u f f e r ； d n am a r k e r ；琼脂糖。 溶液配制： 1 ) c t a b 提取b u f f e r ：2 0m me d t a ，2 ( v w ) c t a b ，1 0 0m mt r i s ，p h8 5 ， 1 4m n a c i ； 2 ) 5 t b e 电泳缓冲液：5 4gt r i s ，2 0m l0 5m o l 1e d t a ( p h8 o ) ，2 7 5g 硼酸， 加双蒸水定容至1 0 0 0m l 。使用时将上述缓冲液稀释1 0 倍，使用浓度o 5 t b e 3 ) t e 缓冲液( p h 8 0 ) ( 1 0 m m t r i sh c l ；1 me d t a ) 2 2 5 菌种分离 将样品用无菌水稀释至1 0 一1 0 。稀释度，吸取0 1 m l 涂布于含有链霉素3 0 斗咖l 的 无菌各分离培养基平板上，用p a r a f i l m 封口膜封口后置于5 0 恒温培养箱中培养3 1 0 9 广西大学啊页士掌位论文嗜热真1 1 的分离鉴定及其固态发酵产木聚糖酶的初步研究 d ，在培养过程中随时观察，待平板上长出菌落，移接到新的培养基上，5 0 。c 下继续 培养，直到分离获得纯培养。也可直接把样品撒在含有链霉素3 0 1 a g m l 的各分离培养 基平板上，5 0 下培养，形成菌落后采用相同方法分离。 将纯化后的菌种移接到新的p d a 培养基上并置于1 9 下培养3 1 0 天，不生长者则 可判断为嗜热真菌，生长者为耐热真菌。 2 2 6 形态学鉴定 对分离获得的菌株，接种于p d a 培养基平板上，分别置于3 0 、4 0 和5 0 。c 下培 养，观察菌落培养特征，并按l i ue ta 1 方法【6 8 1 进行玻片培养。具体为：先用灭菌的打 孔器在菌落边缘切取直径为l c m 的菌种块，然后用灭菌的解剖刀将切取的菌种块置 于无菌的载玻片上，菌丝面既可朝上也可朝下，最后盖上无菌盖玻片并将其置于无菌 的5 0 m l 塑料离心管内培养，使其离心管的直径正好等于载玻片的宽度，将其牢牢卡 住。将其放入5 0 。c 下进行培养4 7d ，为了防止菌种块失水过快，可在离心管中放 置无菌吸水棉球。待菌丝长好后，取另一洁净的载玻片，滴加一滴无菌水，取下已长 好菌丝体的盖玻片盖上，即可在显微镜下对菌丝、分生孢子梗、分生孢子等形态特征 进行观察、拍照和测量，并查阅相关资料进行鉴定。如果要制成永久玻片，可以乳酚 油或乳酸酚棉兰染色剂作为浮载剂。 2 2 7 分子生物学鉴定 2 2 7 1 菌株来源 本研究分离鉴定的4 株嗜热真菌。 2 2 7 2 菌体培养 菌体培养方法参见l i ue ta 1 等方法。培养时先铺一层无菌的玻璃纸( 直径5 c m ) 在p d a 平板上，然后在玻璃纸上移接直径为l c m 的菌丝块，根据不同菌株的生长速 度培养，待玻璃纸上长满菌丝后再用灭菌的解剖刀将菌丝体刮下，置于1 5 m l 离心管 内用于提取d n a 或冻存留待提取d n a 用。 2 2 7 3d n a 提取 参照d o y l e & d o y l e 6 9 】方法并经修改后的步骤对d n a 进行提取。具体步骤：取 刮下的新鲜菌丝体1 0 一5 0m g 置于1 51 1 1 l 离心管中，加入灭菌的石英砂和o 0 1 9p v p ， 先加入1 0 0 l _ t l6 5 0 c 的c t a b 缓冲溶液，用灭菌的磨砂玻璃棒研磨成匀浆，再加入5 0 0 “l 相同c t a b 缓冲溶液，数次颠倒使之均匀混合，置于6 5 0 c 水浴保温o 5 1h ；待 1 0 广西大掌硕士掌位论文 l 热- i l 菌的分离鉴定及其同a z , 发醇产木聚糖酶的初步研究 冷却后加入等体积6 0 0g l 饱和酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提：离心1 2 0 0 0r p m ， 1 0m i n ，再取上清液移转入另一离心管中，重复抽提一次；离心1 2 0 0 0r p m ，1 0m i n ， 取上清液加入等体积异丙醇，混合均匀，室温放置l o - 2 0m i r a 离，t , ( 1 2 0 0 0r p m ，1 5 i i l i n ) ，去上清液；取7 5 7 , 醇1 0 0l a l 洗涤两次，再倒去7 5 乙醇，风干后加入1 0 0g l t e 缓冲液；产物与6 l o a d i n gb u f f e r 混合，用o 8 的琼脂糖凝胶进行电泳检测， 于2 0 u c 保存备用。方法无法改动 2 2 7 4p c r 扩增 1 ) 引物合成：扩增和测序所用的引物i t s l ，i t s 4 由北京诺赛生物技术公司合成。 i t s1 ：5 一t c c g t a g g t g a a c c t g c g g - 3 i t s 4 ：5 t c c t c c g c t l 硝t t