（环境工程专业论文）微囊藻毒素光降解途径研究.pdf

摘要 摘要 随着水体污染和富营养化程度的加剧，淡水湖泊发生水华的频率和规模日益严重。 蓝藻水华污染所带来的主要危害之一是产毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类 型的藻毒素，在我国常见的主要有m c l r 和m c r r 。本文探讨了微囊藻毒素提取的优 化条件，研究了自然条件下的两种微囊藻毒素m c l r 、m c r r 的光降解，考察了微囊 藻中的叶绿素对藻毒素降解的影响。研究了叶绿素浓度、p h 、辐照强度、光波长等条件 下，m c l r 、m c r r 的降解效果，并且利用光量子产率探讨了不同光源对藻毒素降解 的影响，同时得到了实验室条件下，m c l r 、m c r r 的动力学模型以及在叶绿素作用 下，微囊藻毒素的光降解途径和降解产物。结论如下： m c s 溶液中叶绿素的含量对于光降解有重要影响，叶绿素浓度越高，反应的降解速 率越快。在叶绿素浓度为0 1m g m l 的条件下，日光照射3 0m i nm c l r 、m c r r 的去 除率即可达到9 5 以上。另外，反应溶液的p h 值对m c s 也产生了重要的影响，在酸性 条件下的降解效果好于中性和碱性条件。在研究过程中紫外区( 2 0 0 3 0 0n m ) 的光，在 日光光降解m c s 中起主要作用，与体系最大吸收光谱范围一致的2 4 0 2 8 0n l n 的光激发 效果最好，光解作用也最强。同时，辐照强度以及量子产率对m c s 降解有着重要的影 响。辐照强度越大，量子产率越高，m c s 的降解率和降解速度越大。 通过叶绿素对藻毒素的催化氧化的动力学规律，并用一元线性回归方程对不同氧化 降解时间后藻毒素的相对残余浓度对反应时间的相关性进行了分析，结果表明，叶绿素 催化氧化降解藻毒素符合一级反应动力学模式，通过回归求出了反应条件下的一级速率 常数，分别为k e ( m c l r ) 0 0 2 4 8l ( m o l m i n ) ( r 2 = 0 9 7 9 2 ) ，k 2 ( m c r r ) 0 0 18 5 l ( m o l m i n ) ( r 2 = 0 9 7 3 1 ) 。从而为叶绿素催化氧化降解藻毒素提供了一定的理论依据。 在此基础上，利用液相色谱质谱法对叶绿素光催化氧化降解藻毒素的分子机理和 降解产物进行了初步的探讨，结果发现m c l r 、m c r r 在反应体系的降解过程中经过 a d d a 基团剥落、a d d a 侧链断裂以及m d h a - a s p 断裂等三种不同的途径，转化为若干种 不同的中间产物，其中部分产物含量明显。研究同时发现，因催化降解的不稳定性，导 致中间产物再次被矿化为c 0 2 和水等最终无机物质，从而达到降低其毒性的目的。相对 于m c l r 和m c r r 的光催化降解途径，中间产物也产生了不一致的变化，这也与基 团的差异有关。 关键词：微囊藻毒素；h p l c ；叶绿素；光降解；动力学；降解产物；降解途径 a b s 仃a c t a b s t r a c t w i t l lt h eg r a v ec o n c e r no fp o l l u t i o na n de u t r o p h i c a t i o nd e g r e eo ff r e s hw a t e r , a l g a l b l o o mh a sb e c o m em o r ea n dm o r es e r i o u s 们1 ep o t e n tt o x i nm i c r o c y s t i ni sf r e q u e n t l yr e l e a s e d d u r i n gc y a n o b a c t e r i a lb l o o m si ne u t r o p h i cw a t e r sa n dm a yi m p o s e ar i s kt oh u m a nh e a l t ha n d e n v i r o n m e n t t h eu s u a lm i c r o c y s t i n si nc h i n aa r em c - r ra n dm c l r t h i st h e s i sd i s c u s s e s m i c r o c y s t i n s o p t i m i z e dc o n d i t i o n so ft h ee x t r a c t i o np e r i o da n daf a s ta n a l y s i ss t e pi sm e a s u r e d b yu s i n gh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；m e a n w h i l e ，t h ed e g r a d a t i o n so fm c - l r a n dm c - r ra r es t u d i e du n d e rn a t u r a lc o n d i t i o n t a k i n gw a t e rs a m p l ed u r i n gt h e e u t r o p h i c a t i o np e r i o di nt a i h ul a k e ，i to p t i m i z e st h ec o n d i t i o n so fc h l o r o p h y l l ，p h ，i r r i d a t i o n i n t e n s i t i e s ，n g h tw a v e l e n g t h s i ta l s of o c u s e so nt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tl i g h ts o u r c e s t h r o u g hq u a n t u my i e l d t h i st h e s i sd i s c u s s e st h ep a t h w a ya n dp r o d u c t so fm i c r o c y s t i n so f p i g m e n tc o n c e n t r a t i o n st ot h ep h o t o c a t a l y t i cd e g r a d a t i o n a f t e ri r r i t a t i o nw i t hs u n s h i n e , t h er e s u l t ss h o wa sf o l l o w s ：t h er e s u l t ss h o w e d 廿l a t c h l o r o p h y l lw a sak e yf a c t o ro np h o t o c a t a l y t i cd e g r a d a t i o no fm c s ，a n dt h ed e g r a d a t i o nl e v e l w a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fc h l o r o p h y l l w i t ht h eo c c u r r e n c eo f0 1 m g m l - lc h l o r o p h y l l ，o v e r9 5 o fm c s w a sd e g r a d e da f t e r3 0m i n u t e s s u n l i g h ti r r a d i a t i o n , w h i l e 、析t l lt h ea i do fo 0 5m g m l - 1a n do 0 1m g m l 一1c h l o r o p h y l l o n l y6 5 a n d5 6 o f m c sw a sr e m o v e d t h eu l t r a v i o l e tr e g i o n ( 2 0 0 - - - 3 0 0n m ) o ft h es u n l i g h tp l a y sad o m i n a n t r o l ei n p h o t o c a t a l y t i cd e g r a d a t i o no fm c s ，a n d2 4 0n l nw a st h eo p t i m a lw a v e l e n g t hf o r o p t i c a le x c i t a t i o na n dp h o t o c a t a l y t i cd e g r a d a t i o no fm c s 1 1 1 el i g h ti n t e n s i t yw a sa l s oa n i m p o r t a n tf a c t o ri nm c sp h o t o c a t a l y t i cd e g r a d a t i o n , a sah i g h e rl i g h ti n t e n s i t yr e s u l t e di na h i g h e rr e m o v a lr a t i oa n dr e m o v a lr a t eo fm c s t h eo x i d a t i o nk i n e t i c so fm c - l ra n dm c r rw a s i n v e s t i g a t e d i nd e t a i lu s i n g c h l o r o p h y l la c c o r d i n gt ot h em e t h o do ft h el a wo fi s o l a t e dp a r a m e t e r e x p e r i m e n t a lr e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eo x i d a t i o np r o c e s sw a sf i r s to r d e rw i t hr e s p e c tt or e a c t a n t si nt h r e ea c t i o n so f c h l o r o p h y l lo x i d a t i o nm c l r , m c - r r a tp h7 5 2a n d2 0 c ，t h er a t ec o n s t a n tka sf o l l o w , k 2 ( m c - l r ) 0 0 2 4 8l ( m o l m i n ) ( r 2 - d0 9 7 9 2 ) ，k 2 ( m c - r r ) 0 0 18 5 l ( m o l m i n ) ( 1 r = 0 9 7 31 ) ，r e s p e c t i v e l y ni sd i s c u s s e do nt h ep a t h w a ya n dp r o d u c t so fp h o t o c a t a l y t i cd e g r a d a t i o no fm c s u s i n g l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y t h er e s u l t ss h o wt h a tt h r e ep a t h w a y sa r e c o n c l u d e di nt h ed e g r a d a t i o n s ，s o m ep r o d u c t sa r ef o u n d ，w h i c ht u r nt oc 0 2a n dh 2 0i nt h e e n d k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i n s ；h p l c ；c h l o r o p h y l l ；p h o t od e g r a d a t i o n ；d y n a m i c s ；p r o d u c t s ； p a t h w a y i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是各人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 富营养化水体中水华污染现状与危害 随着人类生活方式的改变、工业化、城市化的发展以及农业生产大量使用化肥，大 量的营养物质注入水体，致使水体富营养化日益严重。当环境条件适宜时，湖泊中浮游 蓝藻大量繁殖，形成水华，严重影响了水质和环境卫生，引起了公共卫生部门、供水机 构、生物学、环境学、生态学等研究工作的广泛重视，有关蓝藻水华及其毒素的研究也 日益深入【l j 。本章参考了国内外学者的相关研究以及报道文献，主要介绍了蓝藻水华污 染的现状、危害和防治，同时概述了微囊藻毒素的研究进展，为进一步研究微囊藻毒素 提供了较为深入的理论基础。 富营养化( e u t r o p h i c a t i o n ) 是指氮、磷等无机营养物大量进入相对封闭、水流缓慢的 水体，引起藻类和其它水生植物大量繁殖，水体溶解氧下降，水质恶化，其它水生生物 大量死亡的现象【2 】。富营养化可分为天然富营养化和人工富营养化。在自然条件下，由 于水土流失、蒸发和降水输送等过程会使水体中的营养物质逐渐积累，使一些湖泊从贫 营养向富营养化发展，逐渐演化为沼泽，最终演化为陆地，这一自然过程需要几千年甚 至几万年才能完成。但是人类活动的影响会急剧加速这一过程，特别是现代生活中人类 对环境资源开发利用活动日益增加，工农业迅速发展，大量的营养物质进入并积累在湖 泊、海湾中，导致富营养化可以在短时期内出现【3 羽。目前，我国除了云南滇池、江苏 太湖和安徽巢湖三大淡水湖泊已发生严重的蓝藻水华污染外，长江、黄河中下游的许多 湖泊和水库中也都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染现象，并检测到藻毒素的存在 6 - 1 1 1 o 面对天然淡水水体富营养化程度日益加剧和蓝藻水华暴发越来越频繁的局势，如何 控制蓝藻的过量繁殖生长和有效去除藻毒素，已成为我国乃至世界环境科学研究领域的 一个难题。 1 2 微囊藻毒素的研究进展 随着水体富营养化程度的加剧和范围的扩大，淡水蓝藻水华暴发的频率和强度日趋 严重。当蓝藻水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味，不仅影响 水环境景观，而且释放出多种藻毒素【1 2 】。在已发现的各种藻毒素中，微囊藻毒素 ( m i c r o c y s t i n ，m c ) 是一类在蓝藻水华中出现频率最高、造成危害最严重的藻毒素【1 3 1 。 m c 是藻细胞内毒素，当藻细胞衰老、死亡后，毒素被释放到水体中。大面积严重的藻 类水华发生会使水体中的毒素浓度达到m g l 水平，部分毒素还随藻细胞和悬浮物沉淀 进入沉积物中，有报道指出底泥中吸附的毒素可达1 3 - 2 4m g l t l 4 】。由于已有许多研究 表明微囊藻毒素对动物和人类都具有明显的毒性效应，因此，m c 对人和动物的饮用水 安全、以及水生态系统的稳定均已构成严重的威胁1 1 5 】。 江南大学硕士学位论文 1 2 1 微囊藻毒素的概述 由于蓝藻在世界各地广泛分布，从寒冷的极地湖泊的冰到高达7 0 以上的温泉， 从干燥的沙漠到热带雨林，几乎世界上有光线和水能到达的地方，都可能出现它的踪迹， 因此全世界很多地区、国家的天然水体中都能够检测到藻毒素。如德国的m u g g e l s e e 湖， 夏秋季节藻毒素的最高含量为3 n g l t l 6 1 ；法国的g r a n d - l i e u 湖，不同时间、不同采样点 每克干重水华含有藻毒素0 2 3 n g l ，9 月份藻毒素含量最高，每克干重纯藻含有藻毒素 5 0 6 n g l 1 7 】；丹麦的天然水体中，每克干重水华最高含有藻毒素4 7 0 n g 1 8 】；泰国的水库 和池塘中，每克干重水华含有藻毒素o 7 0 8 m g ，大约是德国、法国水体的1 0 万倍1 1 9 1 ； 收集韩国1 2 个湖的水华，每克干重水华含有藻毒素在2 0 - - 一1 5 0 0 n g 之间【2 0 1 。我国曾在 2 0 世纪8 0 年代对全国范围内的水源水质进行过全面的调查，结果表明3 4 个湖泊中有一 半以上的湖泊面积处于富营养化状态。进入2 0 世纪9 0 年代，我国淡水水体富营养化状 态也日益严重，涉及范围不断扩大。在长江、黄河、松花江等主要河流和太湖、巢湖、 武汉东湖、昆明滇池、鄱阳湖、上海淀山湖等主要淡水湖泊中都曾发现有大量藻类繁殖， 并有毒素产生【2 。从某种程度上讲，藻毒素的污染问题己成为全球性的环境问题。 1 2 2 微囊藻毒素的结构 微囊藻毒素基本结构是由7 个氨基酸组成的单环多肽，也称7 肽单环肝毒素，相对 分子量在1 0 0 0 左右，由于多肽可变位置上氨基酸种类的变化，导致了微囊藻毒素的多 样性 2 2 】。目前己发现了7 0 多种不同类型的微囊藻毒素，其中毒性较大的的是m c l r 、 r r 和y r ( l 、r 、y 分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸) ( 图1 1 ) ，其主要差别是在环状 m c 组成中1 个氨基酸的不同1 2 3 2 4 】。 m i c r o c 2 第一章绪论 m i c r o m i c r o 图i - i 微囊藻毒素( m c s ) 的结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo fm i c r o c y s t i n s h h 1 2 3 微囊藻毒素的产生 关于的产生机理是目前研究的热点，主要有两种观点：一是环境因子的影响，另一 是基因决定，即微囊藻分有毒株和无毒株两种1 2 5 1 。 m c 的产生受光照、温度、营养盐、溶解氧、叶绿素含量、水流速度、浑浊度等多 种环境因子的影响【2 6 j 。光照、温度主要是通过影响藻类生长而制约藻毒素的分布。适合 有毒微囊藻生长的有利条件一般为温度在2 8 8 - 3 0 5 1 2 之间，最低限为1 0 ，最高限为 4 0 c ，水温低至1 3 时，水华趋于消失【2 7 i 。而在营养盐中，不同种类的营养盐作用不 一。氮和碳影响不明显，磷的作用较明显。微量元素中a i 、c d 、c r 、c u 、m n 、n i 和 s n 对毒素产生无影响，而f e 、z n 影响极明显。这些环境因子主要通过作用于细胞分裂 速度而控制毒素的产生，而不是直接作用于毒素产生的代谢途径，而且细胞分裂速度和 毒素产生率之间存在一定的线性相关关系【2 8 】。 持毒素基因决定论者认为，徼囊藻有毒株( t o x i cs t r a i n s ) 和无毒株( n o n t o x i cs t r a i n s ) 的毒性是由遗传决定的，而且微囊藻有毒株和无毒株的遗传差异在于是否存在一种或几 3 江南大学硕士学位论文 种编码毒素合成酶的基副2 9 1 。 1 3 微囊藻毒素的毒性 对m c 的研究之所以倍受重视，是与它们的危害分不开的。近年来，蓝绿藻在世界 各地的河流、湖泊、池塘和水库中存在并引起人畜中毒。m c 具有肝毒性，能在贻贝和 扇贝的消化腺内积累并沿着食物链进入鱼、鸟、哺乳动物及人类等高营养级的生物体内 o o l o 动物通过直接接触或饮用含有m c 的水会出现乏力、腹泻、呕吐、呼吸急促、厌食 等症状，甚至导致肝肿大出血及肝坏死，并因呼吸阻塞而死亡【3 1 3 4 】。人体直接接触含有 毒素的水如游泳、划船等，会引起皮肤、眼睛过敏及头痛、眩晕、恶心、呕吐等症状。 少量喝入可引起急性肠胃炎长期饮用会引发肝癌等疾病乃至死亡。近年来，世界上许多 国家和地区均发生过有关m c 污染而引起人畜中毒的事件。如，1 9 9 6 年2 月，巴西一 血液透析中心由于使用了被藻毒素污染的水作为肾透析液，造成1 2 6 人出现了急性或亚 急性肝中毒的症状，其中6 0 人死于肝衰竭【3 5 】。藻毒素的长期慢性毒性效应严重威胁水 体周围地区人们的身体健康。研究表明，藻毒素对肿瘤有促进作用。流行病学调查发现 原发性肝癌的发生率与饮用水中的藻毒素含量呈正相关1 3 引。 1 4 微囊藻毒素的控制方法 1 4 1 微囊藻毒素分析研究现状 藻毒素对人和水生动物具有很高的毒性及潜在危害，藻毒素的分析检测技术是进行 藻毒素毒理学、藻毒素在环境中分布和迁移转化以及藻毒素脱除技术研究的基础。因此， 藻毒素分析检测的研究对于维护环境安全和人类健康具有重要的意义。目前常用的检测 方法主要有生物毒理检测法、化学分析法和生化分析法。 1 生物毒理检测法 生物毒理检测法是通过动物口服或注射来间接评价藻毒素的毒性。用纯化的微囊藻 毒素或水华蓝藻中提取的藻毒素进行测试，根据动物的生理病变及半致死剂量可初步确 定藻毒素的毒性，这也是毒理评价的常用方法【3 9 1 。例如，除个别异构体的l d 5 0 为2 0 0 - 2 5 0p g k g 外，多数微囊藻毒素的l d 5 0 为6 0 - 7 0j - t g k g 。生物毒理检测法操作简单， 但专性和灵敏度较差，且无法确定藻毒素类型及结构。 2 化学分析法 化学分析方法主要包括高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 、薄层层析色谱 ( t l c ) 、毛细电泳( c e ) 以及液相色谱质谱( l c m s ) 联用等现代分析手段，利用藻 毒素的物化性质结合灵敏的光电技术对其进行定性、定量分析。高效液相色谱是目前应 用最广泛的方法，具有较高的灵敏度和精密度，依据保留时间定性，一次可以测定多种 藻毒素。高效液相色谱可以分离纯化、定性或定量检测微囊藻毒素【4 0 , 4 1 】。一般是先将水 华蓝藻的藻毒素提取液或实际水样通过固相萃取吸附富集，溶剂淋洗后将净化的藻毒素 洗脱，然后用于定性、定量分析。同时可与质谱或核磁共振联用确定藻毒素的分子式和 4 第一苹绪论 结构【4 2 舶】。藻毒素侧链a d d a 基团的共轭双键在2 3 8 - - 一2 3 9 n m 处有最大的紫外吸收， 故可利用紫外检测器检测藻毒素【4 5 1 。对于流动相，一般采用乙腈水或甲醇水体系的不 同浓度梯度淋洗，在水相中加入定比例的三氟乙酸或采用酸性的磷酸盐缓冲溶液以保 持酸性( p h 约2 5 ) ，用c 1 8o d s 固相萃取柱对藻毒素进行分离d 6 , 4 7 。因为h p l c 对 藻毒素的检测限为0 1 1 0m g l ，而天然水体中的藻毒素含量仅为p g l 水平，故水样 一般要通过固相萃取柱进行浓缩并洗脱后再进行h p l c 测定。 3 生化分析法 生化分析法有酶联免疫吸附法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , e l i s a ) 和蛋 白磷酸酶抑制法( p r o t e i np h o s p h o t a s ei n h i b i t i o na s s a y , p p i a ) ，由于具有灵敏、快速、适 用于分析大批样品等特点，显示出良好的发展趋势。e l i s a 是用制备的藻毒素多克隆抗 体测定藻毒素总量d s , 4 9 。日本m b c 和美国等公司制备了单克隆抗体的试剂盒，可以检 测到0 0 5 , - - , 1 0p g l 的藻毒素浓度。但因不同类型藻毒素的结构非常相似，因此，也不 能识别出藻毒素的特定类型，只能测定藻毒素的总量。p p i a 则是利用微囊藻毒素对荧 光物质蛋白磷酸酶p p l 和p p 2 a 活性专一性的抑制效应进行定量分析，检测限可达 0 0 1 2 - 0 1 7 7 i - t g l 5 0 , 5 1 】。蛋白磷酸酶抑制法常与放射性的3 2 p 或荧光剂结合使用，增加 了测定操作与设备，而且藻细胞内源磷酸酶的存在会增大测定误差。另外，和酶联免疫 吸附法一样，蛋白磷酸酶抑制法测定的也是藻毒素的总量。 1 4 2 微囊藻毒素处理技术研究现状 由于微囊藻毒素具有水活性，且分子量较小，较难为常规的水处理工艺去除，需使 用一些特殊的处理方法。目前去除微囊藻毒素的方法包括絮凝、化学降解、生物降解及 光降解等。 1 絮凝方法对微囊藻毒素的去除。 c h o w 5 2 等研究了传统的凝结絮凝沉降过滤的水处理方法对铜绿微囊藻 ( m i c r o c y s t i n sa e m g i n o s a ) 细胞的影响。结果表明，以硫酸铝絮凝去除细胞，不对细胞膜 的完整性造成破坏，也不影响细胞代谢物的释放，大部分细胞都能被完整地去除，处理 后的水体中末发现m c 浓度增加。h i m b e r g 等也发现，含有微囊藻细胞的毒素水样经硫 酸铝混合3 0 m i n 絮凝2 h 沉淀砂滤一0 5 m gn a c l 0 接触消毒2 0 m i n 工艺处理后，微囊藻 的两种毒素m 1 、m 2 去除率仅为1 1 1 8 ，产生于颤藻的两种毒素m 1 ，m 2 去除率为 2 9 3 2 ，混凝剂的增加反而引起m l 、m 2 去除率下降，其原因可能为混凝过程引起藻细 胞破裂，使细胞内毒素释放于水中【5 3 】。 2 。化学降解方法对微囊藻毒素的去除。 ， 化学氧化法是目前研究较多的一种处理m c s 的方法。水处理工艺中常用的氧化试 剂主要有氯系药剂、臭氧、双氧水和高锰酸钾。 预氯化是传统的高藻水处理工艺。早期的研究认为氯化对m c s 无降解作用，后来 发现氯能降解部分藻毒素。n i c h o l s o n 等【5 4 】使用1 - 2 m g l 的氯气与2 5 1 6 m g l 次氯酸钙 与水接触3 0 m i n 后，初始浓度为1 3 0 3 0 0l ag l 的m c l r 与节球藻毒素的去除率可达 9 5 ，使用1 5 3 0 m g l 次氯酸钠溶液可以去除7 0 - - 8 0 。l a m 等【5 5 】在实验室进行了降解 5 江南大学硕士学位论文 藻毒素的化学药剂的试验。高锰酸钾、氯气可能使藻细胞裂解导致毒素浓度增加。在酸 性及中性条件下，足量的次氯酸钠可有效降解藻毒素。在澄清水中，c 1 0 2 投加量达到 6 m g l 以上时，m c 去除率为8 0 - - 9 0 ，1 0 m g l 的k m n 0 4 能去除原水中5 5 左右的藻 毒素。s e n o g l e s d e r h a m 掣5 6 1 发现纯净水中纯藻毒素与藻细胞提取液氯化后尽管三氯甲 烷与卤乙酸低于饮用水浓度限值，但是处理后的水样对p 5 3 转基因老鼠却有着致癌作 用。上述研究说明高剂量的氯可以降解藻毒素，但m c s 或者降解中间产物可能和氯协 同生成了新的“三致作用的消毒副产物。 臭氧在水处理中可起到脱色、除味、消毒、助凝等多种作用。含藻毒素的饮用水源 水进行臭氧化预处理，可有效降解m c s 。初始浓度为1 5pg t , 的提取于冻干微囊藻的 m c s 水溶液，经1 0 1 5 m g l 的臭氧预处理，去除5 0 的毒素，初始浓度为5 0 1l lg l 的 提取于新鲜藻的藻毒素水溶液，预臭氧化可去除9 0 的毒素1 57 1 。s t e f a n 等【5 8 】使用浓度为 0 3 2 m g l 臭氧与含藻毒素的水接触9 m i n 后测定去除效果，结果显示，去除效果与藻 细胞密度、臭氧浓度、接触时间和温度有关。r o s i t a n o 等1 5 9 j 调查表明臭氧分解m c l r 比氯、h 2 0 2 、k m n 0 4 更有效，而且在酸性条件下这种降解更为有利。由于臭氧在水中 溶解性较差，最大的一个问题是成本过高。 尽管h 2 0 2 已经被用来处理含酚废水、纸浆废水、以及其它各类有机废水，但对m c s 的去除效果并不明显，2 0 m g 1 的h 2 0 2 处理6 0 m i n 仅能去除1 的m c l r t 6 0 l 。另一项研 究中h 2 0 2 臭氧和h 2 0 2 u v 对m c s 的去除效果较单独h 2 0 2 作用均有大幅提耐6 1 】。 3 生物降解方法去除微囊藻毒素。 呲e n a l ( a 和w a t a n a b e 6 2 】发现从天然水体中分离出的铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) 对m c l r 有降解能力，在初始5 0 m g l 的高浓度下，2 0 d 的去除率为9 0 以上，负责催化m c 降解的降解酶是由该菌株所分泌的碱性蛋白酶。 国内闰海【6 3 】率先从云南滇池底泥中分离出了能够降解m c 的微生物纯菌种，经中 国科学院微生物研究所鉴定为青枯菌( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 。研究发现此菌种在3 d 内可将初始浓度分别为5 0 2 和3 0 1m g l 的m c r r 和l r 全部降解，日平均降解 m c r r 和l r 的速率分别高达1 6 7 和9 4m g l 。 吕锡武等采用序批式生物膜反应器对3 种m c 进行降解的实验显示1 6 4 ，好氧条件 下，草履虫对藻毒素降解起重要作用。另一些无脊椎动物( 如：贻贝、螯虾) 对m c 有 较大的耐受性，但毒素在其体内有残留富集和放大效应，可达到相当高的浓度，通过食 物链对人类健康造成潜在的危害。 4 光降解与光催化氧化方法对微囊藻毒素的去除。 近几年，有关光催化方法降解水中微量藻毒素的研究开始引起国际间关注，被认为 是极有前景的藻毒素处理技术。 光照充足时，可进行缓慢的光化学降解或异构化【6 纠，蓝藻细胞内毒素在日光照射下 可改变侧链a d d a 的双键异构体而使其毒性明显降低( 半衰期约1 0 d ) ，而当微囊藻毒素 暴露在最大紫外吸收波长( 2 3 8 2 5 4 n m ) 时，则降解较快( 半衰期在数分钟内) 。t s u j l t 6 6 1 等人 的研究发现，在野外条件下，阳光的照射使含有色素的蓝藻大量降解毒素转化为无毒性 6 第一章绪论 且致突变性比m c 小的多的同分异构体，当有5m g m l 的蓝藻色素存在时，m c l r 的 光解半衰期只要5d ，但纯的m c 不易被光降解。他们还研究了紫外线照射对藻毒素的 光降解，藻毒素在其最大吸收波长附近的紫外线的照射下，很容易被降解，当然降解也 与光强有关。m c l r 在1 4 7l x w c m 2 u v 的光照辐射下，半衰期为1 0m i n ；在2 5 5 0 l - t w c m 2 u v 的光照下，1 0m i n 后被完全降解；而在更弱的紫外线照射下还发现有同分异 构体生成。w e l k e r 等【6 1 7 】研究了腐殖质类物质对m c l r 、m c y r 、m c r r 的间接光降 解效果，经8 小时光降解后这些毒素的浓度分别为起始浓度的5 、5 3 和4 4 ，由腐 殖质分解生成的单分子氧、过氧化氢和氢氧自由基被认为是此降解过程中的活性氧化 剂。 光催化氧化是比光降解更为有效的降解藻毒素的方法。l i n d a 等【6 3 j 以质量浓度为 0 1 的t i 0 2 作为催化剂，采用2 8 0 w 的紫外灯照射水样，m c l r 在2 0 m i n 内由2 5 0 m g l 降至h p l c 检测极限以下。s h e p a r d 6 9 j 等报道了应用t i 0 2 做光催化剂来降解m c l r 、 m c y r 和m c y a ，三种毒素降解都很迅速，半衰期小于5 m i n 。d o n g k e u nl e e 7 0 j 等t i 0 2 将负载到活性炭上( g a c t i ) 来光催化降解m c s ，在连续稳定运行5 4 0 m i n 内，m c s 的去 除率都在9 5 以上。对降解产物进行电导分析显示，光催化氧化对藻毒素的矿化率低于 1 0 ，表明仅有少量毒素得以完全降解，其余毒素转化为新产物，因此确定分解产物的 性质及毒性是十分必要的。a n d r e w 等【_ 7 1 】对毒素的光催化氧化降解机制进行了分析，认 为t i 0 2 在紫外光照射下产生电子- 孑l 穴对，与吸附在表面的h 2 0 或羟基作用，形成表面 活性中心，释放出氧化性极强o h 的基团，这些强氧化性的基团作用于a d d a 侧链中 的c = c 键使之断开，生成了与之结构相似，但毒性明显降低或消除的新产物。 二氧化钛( t i 0 2 ) 是常用的光降解催化剂，研究其光催化降解m c 的报道很多。f e i t z 7 2 l 等人的研究表明，m c 在日光或紫外光照射下均不发生变化，但在加入光催化剂t i 0 2 时才发生显著光解，在m c 初始为8 0 熠几时，其半衰期可降低到1 0m i n 左右。 在天然水体中，m c l r 的光解速率非常低，半衰期要达到9 0 1 2 0d 。如果在日光 照射下以腐殖质作为光敏剂，初始1 0 鹇lm c 浓度下的半衰期可减少到l o 5h 【73 。 1 5 论文的研究意义、研究目标和主要研究内容 1 5 1 研究意义 研究掌握天然水体中微囊藻毒素污染产生和消亡的规律，了解自然条件下微囊藻毒 素降解的机理和主要影响因素，对于开发针对微囊藻毒素去除的水处理技术，保障供水 水质有着重要的指导意义。光催化降解微囊藻毒素，处理条件温和，可以在自然条件下 自发的进行，紫外光和光催化生成的羟自由基o h 还具有强烈的抑止藻类生长和杀菌消 毒的能力。如果在供水处理中采用还可以去除饮用水中预氧化而产生的多种有害的微量 卤代烃，极大地提高了饮用水的安全性。近几年，有关光催化方法降解水中微量藻毒素 的研究开始引起国际间关注，被认为是极有前景的微囊藻毒素处理技术，国内虽然已经 有了大量光催化处理有机废水的研究，也有应用于饮用水处理的尝试，但以m c 作为降 7 江南大学硕士学位论文 解对象少见报道。目前关于微囊藻毒素光降解的研究多着眼于采用半导体材料t i 0 2 作 为催化剂进行光催化降解藻毒素，少有关于水体中自然存在或产生的物质对光催化降解 微囊藻毒素的作用的研究，对于天然水体中具体是什么物质( 如：具体是哪种色素) 是微 囊藻毒素降解的光敏剂，以及微囊囊藻毒素在这些催化剂或光敏剂作用下的降解分子途 径和机理尚未见有报道。 1 5 2 研究目标 ( 1 ) 确定提取纯化天然水体中的藻毒素方法。 ( 2 ) 初步确定影响微囊藻毒素光降解的关键因素。 ( 3 ) 确定微囊藻毒素光降解的动力学参数。 ( 4 ) 确定微囊藻毒素光降解途径和产物分析。 1 5 3 研究内容 ( 1 ) 研究比较确定m c 的提取纯化方法，优化提取纯化条件。 ( 2 ) 研究确定在微囊藻毒素光降解中起关键作用的光敏物质。考察光照强度、p h 、 温度、色素浓度1 等对光降解反应的影响。 ( 3 ) 利用h p l c 图谱上底物和产物的出峰情况初步识别m c l r 和r r 敏化光催化降 解的产物；对质谱图进行解谱和分析，推测降解产物的结构。 本论文为国家自然科学基金( 2 0 7 0 7 0 0 7 ) 资助项目 8 第二章叶绿素作用下微囊藻毒素的光降解研究 第二章叶绿素作用下微囊藻毒素的光降解研究 2 1 前言 微囊藻毒素在分析和纯化过程中几乎不存在降解和异构化反应，非常稳定。当只有 太阳光照存在条件下，微囊藻毒素降解得也非常有限，但是研究发现加入从微囊藻中提 取的色素后，降解反应速率加快。微囊藻毒素的降解和异构化反应取决于色素的浓度。 色素存在条件下的光降解被认为是目前有实际应用价值的藻毒素去除方法之一。 2 2 材料及方法 2 2 1 实验材料与试剂 微囊藻毒素标准品m c l r ，m c r r ( a l e x i s 公司) 纯度 9 7 ，三氟乙酸( 色谱纯， t e d i a ) ，甲醇( 色谱纯，t e d n ) ，乙腈( 色谱纯，t e d 认) ，乙酸( 分析纯，上海化 学试剂厂) ，碳酸镁( 分析纯，上海化学试剂厂) ，丙酮( 分析纯，上海化学试剂厂) ， 超纯水；藻粉收集于滇池水华时的蓝藻，通过冷冻干燥手段制备。 2 2 2 主要实验仪器 表2 - 1 主要实验仪器 t a b l e2 - 1e q u i p m e n t so fe x p e r i m e n t s 名称制造厂商 s u p e l c l e a nl c - 18s p e3m lt u b e s 0 4 5p m 混合纤维酯微孔滤膜 0 2 2 j a n 混合纤维酯微孔滤膜 m e t t l e rt o l e d op l 2 0 0 2 型电子天平 高速冷冻离心机 超声波细胞粉碎机 k q 3 2 0 0 d b 型数控超声波清洗器 s h b i i i 循环水式多用真空泵 杯式过滤器 美国s u p e i c o 公司 上海兴业净化器材厂 上海兴业净化器材厂 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 h i m a cc r 2 2 g s o n l c s & m m r i a l s 昆山市超声仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司 江苏省金坛市晶玻实验仪器厂 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 微囊藻毒素的提取与纯化 取5 0 - 1 0 0 m g 冷冻干燥后的藻粉，放入三角瓶中，加入2 0 m l5 乙酸溶液搅拌 在超声细胞粉碎机条件下提取2 0 m i n ，然后以转速8 0 0 0 r m i n 离心分离5 m i n ，取出上 清液( i ) ，残渣再用含有甲醇溶液( 8 0 ) 2 0 m l 提取2 0 m i n ，同样条件下再次离心分 离，取出上清液( i i ) ，残渣用甲醇溶液再提取一次，得到上清液( i i i ) ，合并上清液( i i ) 9 江南大学硕士学位论文 和i i i ) 用旋转蒸发仪蒸干再与上清液( i ) 合并得到溶液( i v ) 。 用3 0 m l 甲醇和3 0 m l 纯水活化s p e 小柱，溶液( ) 以5 m l m i n 的流速流过 小柱，待上样后用1 5 m l 3 0 的甲醇溶液淋洗s p e 小柱，最后用1 0 m l 纯甲醇洗脱柱 中的毒素，收集洗脱液用旋转蒸发仪蒸发近干，再用l m l 甲醇重新溶解后转移至 1 5 m l 样品瓶中用氮气浓缩干燥，最后准确加入5 0 0ul8 0 甲醇溶液定容于一2 0 冷 冻避光保存。 本章建立的蓝藻中微囊藻毒素的分离、纯化及分析流程图如下： 重复 图2 - 1 藻毒素分离纯化流程图 f i g 2 1i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o do fm i c r o c y s t i n s 2 2 3 2 藻细胞内叶绿素的提取和测定 称取新鲜蓝藻，在冰箱内低温干燥6 8 h 后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉 末及2 - 3 m l9 0 丙酮，充分研磨，提取叶绿素a 。用离心机( 3 0 0 0 - 4 0 0 0 r m i n ) 离心1 0 r a i n 。 将上清液倒入5 m l 或1 0 m l 容量瓶中。 再用2 3 m l 的9 0 的丙酮，继续研磨提取，离心1 0 m i n ，并将上清液再转入容量 瓶中。重复1 2 次，用9 0 的丙酮定容为5 m l 或1 0 m l ，摇匀。 将上清液在分光光度计上，用l c m 光程的比色皿，分别读取7 5 0 n m 、6 6 3 n m 、6 4 5 n m 、 6 3 0 n m 波长的吸光度，并以9 0 的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。 叶绿素a ( m g l ) = 1 1 6 4 ( 0 d 6 6 3 一o d 7 5 0 ) - 2 1 6 ( o d 6 4 5 - o d 7 5 0 ) + 0 1 0 ( o d 6 3 0 o d 7 5 0 ) 测定萃取液的色素浓度以后，每单位体积色素量的计算如下： 叶绿素a ( m g m 3 ) = 叶绿素a 提取液定容后的体积( l ) 水样体积( m 3 ) ( 由于蓝藻叶绿素中c h l a 占绝大多数，故研究中以c h l a 量代表叶绿素的量) 。 由于色素易变质，实验中所用色素为新提取得色素。本次实验所用蓝藻叶绿素的提 1 0 第二章叶绿素作用下微囊藻毒素的光降解研究 取大致方法如下： _ 囫一困一圈一团一圈一臣圈 图2