（发酵工程专业论文）红曲橙色素的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 红曲色素作为食品添加剂应用1 i 食品着色历史悠久。在红曲色素的混合物中，从感观 上来看，橙色素是最为鲜艳夺目的色素，目前在围内外仪限于小样试制，尚未实现大规模 生产，在食品及其它领域的应用目前也未得到充分的丌发研究；但因其颜色较为独特、醒 目，在众多需要着色剂的产品中都可找到其应用前景，是值得丌发的红曲色素品种。所以 系统地研究如何开发红曲橙色素这品种，提高液态发酵法生产橙色素的产量，丌发橙色 素的应用领域，具有重大的理论意义和现实意义。 本文首先研究了红曲橙色素的发酵生产工艺，通过单冈素及正交实验，确定了红曲菌 液态发酵产橙色素的最佳培养基配方为( l ) ：玉米淀粉6 0 o ；硫酸铵4 0 ；k h 2 p 0 42 0 ； k 2 h p 0 42 0 ；m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ：c a c l 20 1 ；f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 ；z n s 0 4 7 h 2 00 0 1 ；m n s 0 4 h 2 0 o ，0 3 ；n a n 0 32 o ；起始p h 值为5 0 ；发酵时间为4 o d 。在此基础上又对液态深层发酵生产 橙色素的操作工艺条件进行了研究，并分析了发酵过程中溶氧量对产橙色素的影响，最终 在优化的发酵工艺条件下得到了色价为7 1 7u m l 、色调为1 1 3 的橙色素液态产品。 对橙色素产品的不同制备方法进行了研究。直接喷雾干燥法：将发酵液加入助干燥剂 后直接进行喷雾干燥，得到色价高达3 8 6 2 0 7 u 幢、色调为1 9 9 的橙色调的混合色素产品； 通过先用有机溶剂提取，而后进行喷雾干燥的方法得到了蛋白质等杂质含量极少的橙色素 粉末状产品：采用有机溶剂萃取，而后经过两次板层析的方法得到了橙色素针状结晶产品， 并对其进行了纯度鉴定，发现其主要成分为红斑红曲素，从峰面积归一化计，红斑红曲素 占了样品总量的8 5 9 3 ，可以作为红曲橙色素分析检测实验中的标样。并用其建立了作 为红曲橙色素之一的红斑红曲素的h p l c 定性、定量检测方法。 对红曲橙色素的稳定性进行了研究：橙色素的热稳定性良好，光稳定性差；在酸性条 件下较稳定，p h 5 7 时橙色素可能发生变化，导致吸光值下降，最大吸收峰对应波长发生 位移；n a 2 s 0 3 与h 2 0 2 对橙色素有一定的破坏作用，而加入n a c l 与蔗糖对橙色素没有太大 影响。各种氨基酸会与橙色素发生不同程度的反应。 在其稳定性研究的基础上，对红曲橙色素在食品与日化行业的应用进行了初步研究。 在食品行业中，橙色素可以应用于奶油、白酒、果汁及肉制品等着色，通过实验初步确定 了橙色素在这些物质中的添加量：奶油的添加量最好不大于o 5 、白酒1 2 u m l ( 橙色素 色价：酒体积) 、果汁1 6 u m l 、肉制品中的添加量因各人喜好而异，并对着色后着色效果 的稳定性做了分析，着色物一般在避光的环境里相对较稳定，在室内自然光及阳光直射的 地方，着色液都极易退色；在同化行业中的应用，由于实验条件的限制，仅对橙色素在洗 洁精中的应用做了初步的研究，在洗沽精里添加橙色素也可以通过调节橙色素的量得到令 人满意的黄色或橙色，且着色相对稳定，洗涤后无色素残留。 关键词：红曲菌橙色素液态发酵精制检测应用 阻南人学坝l 学位论义 a b s t r a c t t h eu s eo f 疗，o 盯d s f “sp i g m e n t sa sf o o da d d j c t i v eh a sal o n gh i s t o r y i nt h ea d m i x t u r eo f 棚。蚪黜c 淞p i g m e n t s ，o r a n g ep i g m e n t sa r et h eb e s lf r e s hp i g m e m s ，w h i c hi so n l yp r e p a r e di n a v e r ys m a l lw a yi ni a b o r a t o r y ，a n dh a v e n tb e e ne x p l o i t a g e da n da p p l i e da d e q u a t e l y b e c a u s eo fi t sp a n i c u l a r ，s t r i k i n gc o l o u ra n dl u s t r e ，i ti so n eo f 珊o ，7 订s c 甜sp i g m e n t sa si s g o o df b re x p l o i t u r e ，a n dw ec a nf i n do u tm a n yp r o d u c t i o n sw h i c hc a nb ep a i n t e du s i n g o r a n g ep i g m e n t s t h e r e f b r e ，t h es y s t e m i cs t u d ya b o u tt h ee x p l o i t u r eo ft h i s ， o 盯口s c “5 o r a n g ep i g m e n t s ，i n c r e a s eo ft h eo r a n g ep i g m e n t sy i e i da n dl o o k i n gf b rt h ea p p l i c a t i o n s c o p e sh a sag r e a ts i g n i 6 c a n c eb o t ho f t h e o r e t i ca n dp r a x i s f i r s t l y ，t h ef 色r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fo r a n g ep i g m e n t sp r o d u c e db y ，行d 疗5 c ”sw e r e s t u d i e d ，a n dt h eo p t i m i z ec o m p o s i t i o n so fc u l t u r em e d j u mw a sd e t e r m i n e db a s e do ns i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t sa n dt h eo r t h o g o n a l e x p e “m e n t a ld e s i g n t h eo p “m i z e dc u l t u r ea s f o l l o w s ( g l ) ：c o m s t a r c h ，6 0 o ；a m m o n i u ms u l f a t e ，4 o ；k h 2 p 0 4 ，2 o ；k 2 h p 0 4 ，2 0 ； m g s 0 4 7 h 2 0 ，o 5 ；c a c l 2 ，o 1 ；f e s 0 4 7 h 2 0 ，o 0 1 ；z n s 0 4 7 h 2 0 ，o 0 1 ；m n s 0 4 h 2 0 ，o 0 3 ； n a n 0 3 ，2 o ； i n i t i a t i v e p h 5 o ； f e r m e n t a t i o nt i m e ，4 0 d t h e nt h et e c l i l i c sc o n d i t i o n so f s u b m e 唱e df b n l l e n t a t i o nw e r er e s e a r c h e d a 1 1 du n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s t h el i q u i d p r o d u c t i o no fo r a n g ep i g m e n t sw a so b t a i n e da t71 7 u m lo fc o l o rv a l u ea n d1 13o fc o l o r s h a d e i tw a sd i s c o v e r e dt h a tag r e a td e a lo fd i s s o l v eo fo x y g e ni s p r o p i t i o u s t ot h e p r o d u c t i o no fo r a n g ep i g m e n t s t h ed i f f b r e n tp r e p a r a t i o nm e t h o d so fo r a n g ep i g m e n t sw e r es t u d i e d d i r e c ts p r a y d r y j n go ff 色丌t 1 e n t a t i o n 】j q u o rt u m e dt ot h ep r o d u c t j o nw j t hc o j o rv a j u e3 8 6 2 ，0 7 u ga n d c o l o rs h a d e1 9 9 s e c o n dm e t h o d ：e x t r a c t i o nb ym e a n so fo r g a n i cs o l v e n ta n ds p r a yd r y i n g b yt h i sm e t h o d ，w eo b t a i n e dt h ep r o d u c t i o nw i t hp r o t e i na 1 1 do t h e ri m p u r i t i e si ns m a l l a m o u n t s f i n a l l y ，n e e d l ec r y s t a lo fo r a n g ep i g m e n t sw a sp r e p a r e db yt l c i t st u m e do u t t h a tt h em a j o rc o n s t i t u e n to ft h en e e d l ec r y s t a li sr u b r o p u n c t a t i n ep a s tas e r i e so fd e t e c t i o n s ， a n dt h er u b r o p u n c t a t i n ec o n t e n tt o o ku p8 5 9 3 o fg r o s s w ee s t a b i i s h e dt h ed e t e m i n a t i o n o fr u b r o p u n c t a t i n ei n 卅d 门口5 c “sp i g m e n t sb yh p l c t h e s t a b i l i t yo fo r a n g ep i g m e n t sw a sd e t e c t e d 0 r a n g ep i g m e n tw a ss t a b l et oh e a t i n g c o m p a r a t i v e l y ，n o ts t a b l et ol i g h ta n ds t a b l ei na c i dc o n d i t i o nw i t hi t ss t a m l i t yw e a k e n e di n p h 5 。7w h i c ha p p e a r e dt h ef a l l o fa b s o r b e n c ya n dt h ee x c u r s i n go fm a x i m a la b s o r p t i o n a p e x ；w h e nn a 2 s 0 3a n dh 2 0 2w e r ea d d e d ，t h es t a b i l i t yo ft h ep i g m e n tw a ss e r i o u s l y a f k c t e d ，b u tn o tc h a n g e dw i t hn a c la n ds u c r o s e ；t h ee x t e n to fr e a c t i o no fo r a n g ep i g m e n t a b s 缸百c t a n dd i f k r e n ta m i n oa c i d sw a sd i 日k r e n t i h e na c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t sw es t l l d i e dt h e a p p l i c a t i o no fo r a n g ep i g m e n t si nf b o da n dc h e m i c a li n d u s t r y i nf b o di n d u s t r y ，o r a n g e p i g m e n t sc a nb eu s e da sp i g m e n t 矗t i o no fc r e a m ，w i n e ，s y r u p ，m e a tp r o d u c ta i l ds oo n t h e r e c m i t m e n to fo r a n g ep i g m e n t sh a sb e e nd e t e h n i n e dt 1 1 r o u g hc o r r e s p o n d i n ge x p e r i m e n t s ： l e s s t h a i l0 5 i nc r e a m ，1 2 u r i l l ( c o l o r v a l u e ：c u b a g e o f 丽n e ) i n 、v i n e ，1 6 u m l i l ls y r u p ，i n m e a tp r o d u c tt h et r e ti sd i f b r e mf o l i o wo n e si n c l i n a t i o n s i na d d i t i o n ，t h es t a b i l i t yo f c o l o u r e ds a m p l e sh a sa l s ob e e ns t u d i e d i nc h e m i c a li n d u s t r y ，w eo m yd ot h er e s e a r c ho n t h ea p p l i c a t i o no fo r a n g ep i g m e n t si nc l e a n s e re s s e n c eu n d e rl a b o r a t o r yc o n d i t i o n s r e s t r j c t j o n s k e yw o r d s ： 如玎娜c 淞，0 啪g ep i g m e n t s ，l i q u i ds t a t e 如兀n e n t a t i o n ，p u “f i c a t i o n ，d e t e c t i o n ， a p p l i c a t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签钮蕴篓亟 日期：加 年f 2 月细 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：猛釜鱼 导师签 日期： 江南大学硕士学位论文 红曲橙色素的研究 第一章前言 1 1 红曲及其产品发展简史 红曲菌以其能产生大量代谢产物而得名，是我国先人的伟大发现。红曲又称“丹曲”， 传统意义上指以大米为原料，接种红曲菌经固体发酵而成的红曲米。目前红曲的定义有所 外延，泛指以红曲菌为菌种，发酵( 包括固体发酵和液体发酵) 而制成的各类产品的总称。 红曲的故乡在中国，在浩瀚的中国历史典籍中，我们祖先大量记录了红曲在酿酒、发酵食 品、食用色素、中药等方面的广泛应用。大约在唐代，我国劳动人民就掌握了将曲霉科真 菌紫红色曲霉接种在粳米上制造红曲的技术，开创了我国和世界用微生物发酵法制造食用 色素的先河。在后来的古籍文献如宋初的清异录、元代的日用本草、明代的天工 开物本草纲目和清代的本草约编中都有红曲制作和应用的相关记载【l 】。 红曲菌属的近代研究始于1 8 8 4 年荷兰学者、t i d 曲e m 从马铃薯培养基上分离得到的 两株红曲菌菌株。红曲菌( 胁n 傩c 淞) 是一种小型丝状腐生真菌，属真菌门( e “m 妒d p | i l y m ) ， 子囊菌亚门口s c d m y 砌，不整子囊菌纲c p k c f o 叼，c 8 招s ) ，红曲科( a 如h 甜c 口c 8 口p ) ，本科仅 有一属，即红曲菌属( 胁n 嬲c “砂。主要种类有：红曲菌( m 口”勋) 、烟色红曲菌( m 肛z 辔f d 5 埘、 紫红曲菌( m p ”p 啪“s ) 和红色红曲菌( m r “6 6 p r ) 等。 随着现代科技突飞猛进的发展，国内外学者对红曲已有了更广泛深入的研究。研究表 明：红曲菌可发酵产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶等酶类物质，还可产生醋酸、葡萄糖酸、 柠檬酸等有机酸类物质。在红曲菌菌丝体中，蛋白质、氨基酸总量和必需氨基酸都很高。 另外，红曲茵还能产生多种次级代谢产物如色素、抗生素、莫那可林k 、麦角固醇和中药 成分等。随着现代人们健康意识的加强和科技水平的进步，对于红曲的药理活性物质研究甚 丰，科学家们用其提取或制成降血脂，预防胆结石，防止骨质疏松，治疗慢性肠炎，防止 贫血等食疗作用的药品或保健品。红曲产品作为一种天然色素，在国内应用很广，已广泛 用做果味水、果味粉、果子酱、汽水、配制酒、糖果、糕点、熟肉制品、腐乳等食品的着 色剂，美食家、烹饪高手常用其与甜酒糟、花椒、盐配合用来腌制糟鱼、糟肉等，色红耀 眼、糟香浓郁、昧醇至极【3 0 】，在化妆品，环保产品方面的应用也正在开发。日本对红曲色 素应用也比较多，其市场对红曲色素的消耗从1 9 8 1 年的1 0 0 吨上升到1 9 9 2 年的6 0 0 吨， 产值1 5 ，0 0 0 ，0 0 0 美元，产品有红色日本清酒，红色糖浆，含蛋白质的红色酱菜等等【8 】。 1 2 红曲色素的研究进展 1 2 1 红曲色素的种类及结构 目前已知结构的红曲色素有6 种，呈现橙色，黄色，红色三种颜色。其中橙色的是红 曲玉红素( m o n a s c o r u b r i n e ) 和红斑红曲素( r u b r o p l l i l c t a t i i l e ) ；黄色的是安卡红曲黄素 ( a n k a 丑a v i n e ) 和红曲素( m o n a s c i n e ) ；红色的是红斑玉红胺( m o n a s c o n i b r 锄i n e ) 和红 第一章前言 斑红曲胺( r u b r o p u n c t a i i i i n e ) 。该六种色素的其结构、分子式和分子量分别见图1 1 ，1 2 ， 1 3 。 h 3 r = 爿岛h l ，：红益玉红素( m o n a s c o m b n n e )c 2 】h 2 6 0 5m = 3 8 2 眦5 i l l ：红斑红曲素( r u b m p u n c t 撕n e )c 2 l h 2 2 0 5m = 3 5 4 图1 1 橙色素结构和分子量 f i g 1 一lm o i e c u l a rs 臼u c t u r eo f o r a n g ep i g m e n t h 3 r 7 h l s ：安卡红曲黄素( a k a f i “i n e )c h 3 0 0 sm - 3 8 6 ( y e l l o w ) r = c 5 h i l ：红曲素( m 0 n a s c i n e )c 2 l h 2 6 0 5m = 3 5 8 ( y e l l o w ) 图1 2 黄色素结构和分子量 f i g 1 2m o l e c u l a rs 咖c t u r eo f y e l l o wp i g m e n t s h 3 r = c 7 h 1 5 ：红斑玉红胺( m o n a s c o m b m m i n e ) c h 2 7 n 0 5 瓶_ 3 9 7 r = c 5 h l l ：红斑红曲胺( r u b 唧l l n c t a m i n e ) c 2 i h 廿n 0 4m = 3 5 3 图1 3 红色素结构和分子量 f 培1 3m o l e c l l l a rs 仉l c c u r eo f p u r p l ep i 舯e n 乜 以上六种色素是非水溶性的，但可以溶于有机溶剂。此外，法国学者b i a n c 等于1 9 9 4 年分离出了两种复合色素，呈现红色，是单一色素和培养基中的谷氨酸复合而成的，这两 种色素是水溶性的，命名为g 1 岫l o m a s c o n l b 渤e 和g l u t a u l r u b m p u n c t a i n e 【9 1 ，其结构和名 称见图1 4 。b y o n g s “l i 血等从a 如 甜c 淞s p k b l 0 菌种的代谢产物中分离纯化出了两种黄色 2 红n 钉橙也素的 i j f 究 素其结构见图l 一5 。 c h 3 ( c h 2 ) 3 c h 2 、，0 r 2 c 7 l 】5 ：g i u t a r y l o m a s c o r u br i n m 2 5 l l r 2 c 5 h 1 1 ：g l u t a r y l r u b r o p u n c t a “n e m 5 4 8 3 图l 一4 两种复合色素的结构和分子量 f i g 1 4m o l e c u l a rs t u c t u r ec o m p o u n do f t h et w om u l r i p l ep i g m e n t s 0 h 0 左为黄色素i ：c 2 】h 2 6 0 5 m = 3 5 8 右为黄色素i i ： c 2 2 h 2 8 0 5m = 3 8 2 图1 5 两种黄色素的结构和分子量 f j g 1 - 5m o l e c u 】a rs t u c t u r ec o m p o u n do f t w oy e l l o wp i g m e n t s 1 2 2 橙色素性质及其在色素合成途径中的作用 图1 一l 已经给出了橙色素的结构及分子量，橙色素的两种成分：红斑红曲素与红曲玉红 素，二者的不同之处在于支链烷基链的长度，前者r = c 5 h 后者r = c 7 h l5 。所以二者性 质有极大的相似之处，目前还不太容易将其分离，一般都是将二者作为一个整体橙 色素来考虑。橙色素是红曲中一种主要的抑菌物质，能够抑制革兰氏阳性菌以及大肠杆菌， 其抑菌性与吸光度呈正相变化。橙色素m o n a s c o r u b i n 及r u b r o p n c a t i n 具有活泼的羰基，很容易 与氨基起作用，因此不但可治疗胺血症，而且还可能是优良的防癌物质，红曲所产生的单胺氧 化酶阻遏物早就用于对帕金森氏综合症及其相关的精神病治疗j 。 关于红、黄色素的形成机理，人们提出了各种假设，至今还没有公认的理论。c a r e l s 和s h e p h e r p 认为这几种色素都是由橙色素经化学氧化而得来的i l “，从结构式可以看出黄色 素是由橙色素还原而来，而紫红色素的制各可以通过将橙色素的毗哺酮中的一0 一转变成 一n h 一，色素的合成途径如图1 6 所示。红曲玉红胺与红曲玉红素的质谱行为差异可以由基 峰离子来确定。因此如果能够将红曲色素中的橙色素与其它色素分离开，对其理化性质加 以研究，不仅有助于验证红曲红、黄色素形成的假设，而且有助于人们对红曲各色素有进 一步的认识。 辛酸通过酯化作用结合在生色团上产生红曲玉红素，而己酸和生色团酯化形成红斑红 第一章 刚i 曲素”j 。这两种橙色素会通过异构转化为相应的两种黄色素：安卡红曲黄素和红h 素。 而紫色素红斑点玉红胺和红斑红曲股 是通过橙色素与n h 3 单位的氨基化作用 产生的【i ”。所有的这些色素都是醇溶性的胞内色素。当它们和氨基酸一个一n h 2 单位结合 后形成的复合色素g 1 u t a r y l m o n a s c o r u b r i n e 和g l u t a r y i m b r o p u n c t a t i n e 则是水溶性的，最终分 泌到培养基中”。 1a c e t a t e + 3m a l o n a t e s la c e t a t e + 5m a l o n a t e s p o 嗽e f i d es y n l h e o c t a n “ch e x a k e t ；d e 士山 ro b 、c h ， 夕一“。4 太，l m o n a s c o r u b n n e r 6 1 妇d 6 图l 一6 色素的合成途径 f i g 1 6m e t a b o l i cp a t i l w a yo f 和瑚s c 蚶p i g m e n t s 1 2 3 红曲色素生产状况 红曲色素主要在东南亚国家中进行生产和应用，其中中国和日本生产量最大，我国 2 0 0 4 年产量在7 0 0 0 吨左右。红曲色素的生产有两种方式，固态发酵( 产品为红曲米) 和 液态深层发酵( 产品为红曲红) ，其中前者为传统的生产方式，并且目前国内大多数红曲 厂家仍然采用固态发酵的方式。固态发酵的红曲色素是红曲米和红曲红色素的总称，前者 是红曲菌在蒸熟的大米上发酵生成，产品以米粒状或将米粒粉碎成粉状形式出售，后者是 江南大学硕士学位论文红曲橙色素的研究 红曲菌以米粉为原料液体发酵生成红曲橙色素，然后添加豆粉酶解液等含氮物质与之反应，生 成水溶性的红曲红色素。从本质上讲，红曲米中除了红曲红色素以外还含有未被微生物利用的 米粒、淀粉酶、蛋白酶等，而红曲红色素并不是纯的红色素，而是红、橙色素与水溶性的蛋白 质、肽、氨基酸等有机物的混合物【l 引。红曲色素的生产由固态转向液态深层发酵在中国是 近l o 多年兴起的，采用这种生产方式有助于实现生产自动化，提高产品质量的稳定性， 扩大生产规模。在国内采用液态深层发酵的企业中，居国内先进水平的企业，年产量可达 8 0 吨( 粉状红曲红) ，发酵液中的色价最高可达4 5 0 u 施l 【l 叭。 1 2 4 红曲色素的分离、提取工艺及其它方面的研究 童群义和高孔荣对红曲色素的提取工艺进行了研究，确定了菌体内的色素采用乙醇提 取工艺，发酵液中的色素采用树脂吸附、乙醇洗脱的提取工艺m i 。夏书华等发现p h 值的改 变对红曲色素的色调有很大影响，添加n a c l 和c a c b 能有效地提高红曲色素的提取率【2 1 】。 石鹤和陈丹丹等研究了红曲菌发酵液及菌体中色素的提取方法：活性炭( 粉状) 吸附法和 等电点共沉淀法能较好地提取发酵液中的色素，用6 0 乙醇在6 0 下提取6 0 分钟能较好地 抽提干燥菌体中的色素【2 2 】。钟立人、蒋家新等对红曲色素组分分离进行了研究，分离得到 了2 0 多种组分【玎】。李严巍、王梅、鲁雁飞研究了食品中红曲色素的测定方法，建立了几种 定性定量的检测方法【2 4 j 。 1 3 立题意义 食用色素是食品添加剂的重要组成部分，它不仅广泛应用于食品加工，在医药领域也 得到了广泛的应用。食用色素通常分为两类：食用合成色素和食用天然色素。合成色素 由于有着色力强、色泽鲜艳、稳定性好、易于溶解和拼色以及成本低廉等一系列优点，曾 一度被广泛应用。但随着毒理学和分析技术的不断发展，合成色素的安全性日益受到挑战 【2 ”，合成色素的数量已大大减少，天然色素引起了世界范围的广泛注意。因此食用天然色 素的研制就显得尤为重要。红曲色素是目前世界上最成功的利用发酵工程法大规模生产的 天然食用色素【2 “。 中外的科学家对红曲色素进行了广泛而深入的研究，对于红曲色素的研究卓有成效。 我国色素红曲生产方法分为两大类：一类是固态发酵的红曲米，这是一种色素纯度较低， 且是多种红曲色素的混合物，产品中含有的大量物质仍是残余淀粉和粗蛋白，由于色素纯 度不高，限制其在许多领域的应用：另一类是液态发酵生产的“红曲红”，其主要成分是 橙色素和氨基酸、肽、蛋白质等物质发生结合后的呈鲜红或紫红色调的“复合色素”，发 酵时间较长。今后液态发酵法生产应是主流。 在红曲色素的混合物中，从感观上来看，橙色素是最为鲜艳夺目的色素，如图l 一8 所示 为不同色价的橙色素粉末产品及乙醇萃取液，作为一种橙色调的红曲色素，目前在国内外 仅限于小样试制，尚未实现大规模生产，在食品及其它领域的应用目前也未得到充分的开 发研究。但因其颜色较为独特、醒目，在众多需要着色剂的产品中都可找到其应用前景， 是值得开发的红曲色素品种。另外，橙色素除色素本身的功能以外，还具其它作用，如关 于红曲产品防腐作用，自古即有记载。近年也有报道，宫慧梅口8 】及l m a r t i n k o v a 【2 9 1 都提到 5 第一章 前言 橙色素具有一定的抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌以及大肠杆菌，其原理被认为可能是红 曲色素与蛋白质类物质结合在一起，以至于使蛋自质变性，抑制细菌生长起到防腐等作用。 而且还有报道表明橙色素有增强免疫力、抗疲劳、降血脂、降血压、降血糖的功效【2 7 j 。因 此应用橙色素不但可以改善食品色泽，而且还具有一定的功能性和营养价值。因此如何开 发红曲橙色素这一品种，提高液态发酵法生产橙色素的产量，开发橙色素的应用领域，就 成为本课题研究的重要任务。橙色素是红曲色素的一个中间产物，性质比较活泼，易被氧 化或还原而生成黄色素或红色素。因此从理论上来分析，与目前以紫红色调的红曲红为主 导的液态发酵法相比，橙色素发酵时间可以缩短。从橙色素能与氨基酸、肽和蛋白质结合 生成复合色素( 呈红色或紫红色) 的事实来说，在含上述成分的各种食品中，只需添加橙 色素，也能达到使食品染成红色或紫红色的目的。 图1 - 8 不同色价的橙色素及乙醇萃取液 f i g 1 - 8t h ep h o t o so f o r a n g ep i g 巾e n t sa n de t h a n 0 1e x l c t i o n - l i q u i dw t t hd i f f b r e n tc o i o rv a i u e 橙色素作为天然色素，一般稳定性较差，对光、热等很敏感，易分解、破坏，特别是 红曲橙色素在分离前贮存在完整的细胞组织中，而分离后由于失去了细胞膜的保护机制， 在有氧的情况下会产生氧化反应，外界的光照、高温以及助氧剂等的存在都可能造成对橙 色素的破坏，因此为了更好的开发利用红曲橙色素，将橙色素与红曲其他色素完全分离， 制备纯的橙色素就显德尤为重要，在得到纯的橙色素的基础上，对其稳定性进行深入的的 研究，开拓其更为广阔的用途，如应用于饮料、化妆品( 如口红) 等产品中。 1 4 论文主要研究内容 l 红曲橙色素发酵的研究 红曲橙色素摇瓶发酵条件的研究 2 3 4 5 红曲茵9 9 0 3 小型发酵罐液态深层发酵工艺条件的研究 红曲橙色素固态发酵法生产 红曲橙色素的生产及精制 红曲橙色素粗产品的生产 红曲橙色素的提取和精制研究 红曲橙色素检测方法的研究 红曲橙色素稳定性的研究 ? 红曲橙色素在食品及日化行业的应用研究 6 红曲橙也索的究 第二章红曲橙色素发酵技术的研究 红曲色素是红曲菌应用的主要方向，近2 0 年在有关红曲的专利中有近4 0 的2 争利集中 在此领域，其中1 9 8 5 年前申请的占6 4 ，1 9 9 5 年以后1 2 年问申请的只占3 6 ，说明研究已 渐成熟，但一般所研究的多是红曲红色素，对红曲另一大类色素橙色素的发酵法 生产研究极少，几乎还未见有报道。以往红曲色素的制造是以面包粉、大米为生产原料， 采用固体培养法，此法在色素生产中有很多局限性，如：生产周期长、工艺繁杂、原料利 用率低、生产中易染菌且产品应用范围窄而不适：直大规模工业化生产p “。因此，近年来开 始采用培养期短的液体培养法，采用液体发酵法生产红曲色素的新技术，与我国传统的固 体发酵法生产红曲工艺相比，机械化、自动化程度高，染菌容易控制、具有色素含量高、 杂质少、应用范围广、节约工业用粮等优点p “。另外在生产方法上还可采用液体、固体两 步法生产红曲，即红曲霉菌种经过液体培养成种子，再移植到固体大米上繁殖而成红曲。 本研究我们采用了比较易于控制生产过程的液态深层发酵法生产橙色素，试图通过培 养基成分及培养条件和发酵条件等优化来生产以橙色为主色调的红曲色素。 2 1 材料与方法 2 1 1 主要试剂 玉米淀粉 生化试剂 k h 2 p 0 4 酵母膏生化试剂k 2 h p 0 4 蛋白胨生化试剂 m g s 0 4 7 h 2 0 马铃薯市售c a c l 2 琼脂 生化试剂 f e s 0 4 7 h 2 0 葡萄糖 a r z n s 0 4 7 h 2 0 乙酸 a r m n s 0 4 h 2 0 甲醇 a r n a n 0 3 乙醇 a r 1 4 ) 2 s 0 4 以上分析纯试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产。 2 1 2 主要实验仪器及设备 高效液相色谱仪 分光光度计 紫外分析仪器 超净工作台 电子天平 立式圆形压力蒸汽灭菌锅 往复式摇床 恒温培养箱 h p l l 0 0 u v 3 0 0 0 ，f h 2 0 3 s w c j i e a b 2 0 4 n l s b5 0 l h y g a p y xd h s 一4 0 5 0 a r a r a r a r a r a r a r a r a r 惠普公司 日本h i t a c h i 公司 上海精科实业有限公司 苏州安泰空气技术有限公司 m e t t l e rt o l e d 上海公司 上海医用核子仪器厂 太仓市实验设备长 上海跃进医疗器械厂 第一蒂 川“橙也豢发莳 = ! = 术的州究 2 1 3 菌种 本实验所使用的红曲霉菌种，除特别注叫外，一般指本实验室傈减菌种红曲霉菌株 9 9 0 3 ( 臌，” m “”幻n a k a z a w ae 【s a t o ) ，该菌株具有良好的色素， i 产能力。除此之外，我 们还使片j 了其它一些菌株：舰) 甜“啪pw m 9 5 l ：a 如”“j 唧妒w m9 6 】；m d ”“岱e 印 w m 9 7 】： 如 c “s 印p9 9 0 8 。 2 1 4 培养基 斜面培养基( p d a 培养基) ：马铃薯2 0 0 9 加水煮沸3 0 m i n ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ， 定容1 0 0 0 ml ，自然d h 。 基础发酵培养基( 叽) ：k h 2 p 0 4 ，2 o ：k 2 h p 0 4 ，2 0 ；m g s 0 4 - 7 h 2 0 ，o 5 ：c a c l 2 ，o 1 ： f e s 0 47 h 2 0 ，o 0 1 ：z n s 0 4 7 h 2 0 ，o 0 1 ：m n s 0 4 h 2 0 ，o0 3 ；n a n o 】，2 0 ；p h 5 8 6 o 。 深层发酵种子及发酵培养基：基础培养基中加入玉米淀粉6 0 l ，硫酸铵4 l ，p h 5 o 。 固态发酵生产橙色素培养基：种予培养基同深层发酵培养基，固态发酵培养基为不同 比例的大米与小米的混合物加入l 醋酸溶液7 5 m l 装于1 0 0 0 m l 三角瓶中，棉塞封口， o1m p a 灭菌3 0 m i n 。 2 1 5 培养方法 ( 】) 孢子悬浮液的制备：取斜面菌种一只，加入适量无菌水和少量玻璃珠，充分振荡后 用无菌滤纸过滤，再以血球计数板计数，使孢子浓度达到1 0 6 个，m l 。 ( 2 ) 红曲菌种子培养：2 5 0 m l 三角瓶装液量4 5 m l ，接种量：孢子悬浮液2 m l 。3 0 往 复式摇床，行程1 0 c m ，1 0 0 r m i n 振荡培养4 8 h 。 ( 3 ) 红曲菌摇瓶液态培养：装液量l o o m l ( 5 0 0 m l 三角瓶) ，接种量5 。3 0 ，往复 式摇床l o o “m i n ，培养时间5 天左右。 ( 4 ) 红曲橙色素发酵过程( 固态和液态) ：p d a 斜面一制成孢子悬浮液一接种至种子液 一培养4 8 h ，接入发酵培养基，接种量为5 一培养5 天后，产品预处理，测色价、菌体量 及桔霉素含量。 ( 5 ) 发酵罐条件：1 5 l 自动发酵罐，装液量：7 0 ，通风量：1 0 l ，m i n ，培养温度3 0 ， 转速：2 0 0 r m i n ，初始p h ：6 o ，接种量5 。 ( 6 )固态发酵培养方法：将种子液接入固态培养基中，接种量为4 5 m l 。将米饭堆积在 瓶的一角，3 0 培养，经1 d 左右，待大部分米饭上菌丝开始变色时，将米粒扣散摊平， 培养5 d 左右。 2 1 6 菌体量的测定方法 菌体量的测定方法：采用干重法。取一定体积发酵液，用两层滤纸抽滤( 滤纸预先在 5 0 6 0 烘至恒重，称重) ，5 0 6 0 烘至恒重。 菌体量计算公式：菌体量( l ) = 干重发酵液体积 2 1 7 色价测定方法 发酵液测色价：发酵液经超声波破碎( 5 ：5 ，强度4 0 ) l o m i n 后，用甲醇溶解，静置 萃耿l h 后离心，取上清液，适当稀释，用紫外分光光度计检测其在5 1 0 n m ( 红色素最大吸 江南人学坝 ：学位论文 红曲橙也索的f i f 究 收波长) 和4 6 5 n m ( 橙色素最大吸收波长) 处吸光度值( 稀释倍数控制在所测的0 d 值在o j 1 0 之问) j 】于橙色素色价的计算。 橙色素色价计算公式：色价一0 d 稀释倍数( u m l ) 红曲米测色价：将烘二f 的红曲米粉碎，精确称驭0 5 0 9 ，放入2 5 m l 比色管中，加入i 甲 醇定容至刻度，摇匀后萃取1 h ，以甲醇或7 0 乙醇做空白于u v 3 0 0 0 分光光度计上扫描， 取5 1 0 n m 、4 6 5 n m 处的0 d 值用于计算色价。 橙色素色价计算公式：色价= 0 d 稀释倍数( u 但) 2 1 8 色调计算公式 除色价外，色调也是衡量色素质量的重要感官指标之一，而色调取决于各种色素的相 对比例。在本文中如无特殊说明，色调定义为0 d 4 6 5 。m 0 d 5 1 0 n 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 红曲橙色素摇瓶发酵条件的研究 2 2 1 1 高产橙色素菌种的筛选 将待试红曲菌株9 5 1 、9 6 】、9 7 】、9 9 0 3 、9 9 0 8 分别制成孢子悬浮液后，接到液态培养 基中培养，发酵结束后测定色价、色调及菌体量的含量，见表2 1 。筛选出了高产橙色素 的菌株9 9 0 3 ，发酵液中橙色素色价为3 9 4 7u m l ，菌体量为7 8 6 u m l ，色调达1 6 8 ，显 鲜艳的橙色。本文选择该菌种作为出发菌株，进一步研究发酵条件对其产橙色素的影响。 表2 15 株红曲菌产橙色素能力的比较 t 曲2 - 1t h ec o m p a r i s o no f t h ea b i l i t yo f o r a n g ep i g m e n t sp m d u c t i o nb y5m o n a s c u ss t r a i n s 2 2 1 2 碳源对产橙色素的影响 分别选择葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、糯米粉、麦芽糖和糊精作为碳源进行实验( 见图 2 1 ) 。碳源浓度5 0 叽，培养基的其他配比见2 1 - 2 中基础培养基。在以玉米淀粉作为9 9 0 3 菌种发酵的碳源时，橙色素色价及菌体量均远远高于采用其它碳源时，说明玉米淀粉不仅 仅会对菌体的生长作贡献，更重要的是对橙色素这个次级代谢产物的合成起到积极的作 用，玉米淀粉的这种影响可能是玉米淀粉的成分较复杂，而所含的无机或有机成分也较多， 对红曲霉而言营养成分更加齐全，因而更有利于橙色素的次级代谢产物的生成。由此确定， 玉米淀粉为产橙色素的最佳碳源。 旃一芾 红i f l 磴也豢发酵技术的蝴f 究 使用葡萄糖时橙色素产：量低，分析原因可能是葡萄糖是单糖，容易被分解利用，造成 其降低代谢产物在初划浓度太高，但又不利二j j 色素的广：生，这是所谓的葡萄糖效应。而玉 米淀粉是多糖，l h 于红曲荫可产生淀粉酶和糖化酶，玉米淀粉逐渐水解成单糖。单糖浓度 总是处于较低的水平。另外，玉米淀