（水生生物学专业论文）斜带石斑鱼芳香化酶p450基因启动子克隆与分析.pdf

斜带石斑鱼芳香化酶p 4 5 0 基因启动子克隆与分析 专业：水生生物学 方向：鱼类内分泌及分子生物学 硕士生：李木 导师：张为民教授 摘要 芳香化酶基因属于细胞色素p 4 5 0 基因家族。它所编码的芳香化酶是催化雄 激素转化雌激素反应的关键酶。在斜带石斑鱼中，本实验室前期工作表明存在卵 巢芳香化酶( c y p l 9 a ) 基因和脑芳香化酶( c y p l 9 0 ) 基因。卵巢芳香化酶基因主 要在性腺中表达，而脑芳香化酶基因则主要在脑组织中表达。这两种芳香化酶可 能都参与了斜带石斑鱼性逆转过程的调节。 本文利用g e n o m e w a l k e rp c r 和基因组p c r 的方法，成功地克隆得到斜带石 斑鱼卵巢芳香化酶( c y p l 9 a ) 基因和脑芳香化酶( c y p l 9 0 ) 基因5 旁侧序列及 其基因全长。斜带石斑鱼c y p l 9 a 基因全长约3 3 k b ，包含9 个外显子和8 个内 含子，内含子都具有保守的g t a g 边界特征。斜带石斑鱼c y p l 9 0 基因全长约8 k b ， 包含1 0 个外显子和9 个内含子。与c y p l 9 a 基因内含子不同的是，c y p l 9 0 基因 中含有1 个边界为g c a g 的稀有内含子，并且包含有3 个约为2 k b 的大内含子， 其中1 个还存在于5 u t r 中。 我们通过英特网上的转录元件搜索系统( t e s s ) ，分别对所获得的斜带石斑 鱼c y p l 9 a 基因5 旁侧区和c y p l 6 b 基因5 旁侧区各约2 6 k b 和2 5 k b 序列作 了分析。在斜带石斑鱼c y p l 9 a 基因转录起始位点上游一2 8 n t 存在一个t a t a 框， 在一1 1 7 n t 和1 4 5 h e 处存在两个卵巢芳香化酶特有的f t z f 1 结合位点，它们可能 对斜带石斑鱼c y p i g a 基因在卵巢中的特异性表达起着非常重要的作用。在哺乳 动物已证明能够影响性别决定的转录因子w t l 一k t s 和s r y 结合位点只存在于 c y p l 9 a 基因中。在斜带石斑鱼c y p l 9 0 基因5 旁侧上游一3 3 n t 存在一个t a t a 框， 在一3 3 3 n t 处存在的脑芳香化酶特有的雌激素反应元件( e r e ) ，以及更远端存在 的神经生长因子诱导b 蛋白( n g f i b n u r r 7 7 ) 识别位点n b r e ，它们可能调节芳 香化酶在中枢神经系统中的作用。另外，我们对斜带石斑鱼c y p l 9 0 基因第一个 内含子序列也作了启动子元件分析，发现可能存在另两个转录起始。它们的5 旁侧区序列也具有真核生物启动子序列特征，如都有t a t a 框等，但是否存在这 样的转录产物需要进一步的实验证据。 为了进一步确定斜带石斑鱼c y p l 9 a 基因的转录起始位点，我们做了p r i m e r e x t e n s i o n 实验，但是这个实验处于摸索阶段，还需继续完善。 关键词 斜带石斑鱼，芳香化酶，启动子，性腺，脑，引物延伸 c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so fp r o m o t e r so f c y t o c h r o m e p 4 5 0a r o m a t a s eg e n e si nt h e o r a n g e - s p o t t e dg r o u p e r ( e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) a b s t r a c t c y t o c h r o m ep 4 5 0a r o m a t a s e ( p 4 5 0 a r o m ，c y p ，9 ) i sam e m b e ro f t h ec y t o c h r o m e p 4 5 0s u p e r f a m i l y c y p l 9i st h ek e ye n z y m ec a t a l y z i n gt h ec o n v e r s i o no fa n d r o g e n s i n t oe s t r o g e n s o u rp r e v i o u ss t u d i e ss h o w e dt h a tt h e r ee x i s tt w o t y p e so fc y p l 9g e n e s ， c y p l 9 aa n dc y p l 9 br e s p e c t i v e l y , i nt h eo r a n g e s p o t t e dg r o u p e r c y p l 9 aw a s m a i n l y e x p r e s s e di nt h eo v a r yw h e r e a sc y p l 9 bm a i n l yi nt h eb r a i n b o t hc y p l 9g e n e sm a y b ei n v o l v e di nt h es e xc h a n g eo f t h eo r a n g e s p o t t e dg r o u p e r t h e 5 - f l a n k i n gr e g i o n sa n df u l ll e n g t ho f t h ec y p l 9g e n e si nt h eo r a n g e s p o t t e d g r o u p e rw e r es u c c e s s f u l l yc l o n e db yg e n o m e w a l k e rp c ra n dg e n o m ep c r t h ef u l l l e n g t ho fc y p l 9 ag e n ei sa b o u t3 3k b ，w h i c hc o n t a i n s9e x o n sa n d8i n t r o n s ，a n dt h e b o u n d a r yo ft h ei n t r o na n de x o nf r o m5 t o3 e n df o l l o w st h eg t a gr u l e t h ef u l l l e n g t ho fc y p l 9 bg e n ei sa b o u t8k b ，w h i c hc o n t a i n s1 0e x o n sa n d9i n t r o n s i n c o n t r a s tt oc y p l 9 ag e n e ，c y p l 9 bg e n eh a sar a r ei n t r o nw i t ht h eb o u n d a r yo fg c a g a n dt h r e eb i gi n t r o n so fn e a r l y2 k b ，o n eo fw h i c hi sp r e s e n ti nt h e5 u n t r a n s l a t e d r e g i o n t h et r a n s c r i p t i o ne l e m e n ts e a r c hs y s t e m ( t e s s ) w a se m p l o y e dt oa n a l y z et h e 5 - f l a n k i n gr e g i o n so ft h ec y p l 9g e n e s ，a b o u t2 6k bi nc y p l 9 ag e n ea n d2 5k bi n c y p l 9 bg e n eo ft h eo r a n g e s p o t t e dg r o u p e r c y p l 9 ag e n eh a dat a t ab o xa t n u c l e o t i d e ( n t ) 一2 8 ，a n dt w of t z f 1b i n d i n gs i t e sa t 一1 1 7b pa n d 一1 4 5b pu p s t r e a mo f t h ep u t a t i v es t a r ts i t et h ew t l k t sa n ds r yf f a c t o r sw e r es h o w nt ob ei n v o l v e di n m a m m a l i a ns e xd e t e r m i n a t i o n ) m o t i f sw e r ef o u n do n l yi nt h ec y p l 9 ag e n e c y p l 9 b g e n eh a da 弘b o xa t 一3 3n t ：a ne r ea t 一3 3 3n t ，a n dn b r e ，ac o n s e n s u sb i n d i n g s i t ef o rn e r v eg r o w t hf a c t o ri n d u c i b l e bp r o t e i n ( n g f i b n u r r 7 7 ) a td i s t a lr e g i o n ， w h i c hm i g h tm a n i p u l a t et h ef u n c t i o no fa r o m a t a s ei nt h ec n s i na d d i t i o n ，w ea l s o a n a l y z e dt h ef i r s ti n t r o no fc y p l 9 bg e n e ，a n df o u n dt h a ti tc o n t a i n e da n o t h e rt w o p o t e n t i a lt r a n s c r i p t i o ns i t e s ，w h i c hn e e dt ob ev e r i f i e df u r t h e r i no r d e rt oc o n f i r mt h e t r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t e so ft h ec y p l 9g e n e ，w ec o n d u c t e dp r i m e re x t e n s i o na n a l y s i s ， w h i c hi ss t i l lu n d e rw a y k e y w o r d s 印i n e p h e l u sc o i o i d e s ；c y p l 9 ；p r o m o t e r ；o v a r y ；b r a i n ；p r i m e re x t e n s i o n 4 月l j 舌 鱼类的生殖活动受外部环境因素和神经内分泌的双重调节。下丘脑、脑垂体 和性腺通过相互调节，促进和制约着鱼类生殖细胞的发生、性别分化和性腺发育 成熟及其繁殖活动。如下丘脑产生促性腺激素释放激素( g n p m ) 可刺激脑垂体分 泌促性腺激素( g t h ) 作用于性腺，促使性腺组织产生类固醇激素直接作用于生殖 细胞，引起生殖细胞发育成熟和排卵( 洪万树等，2 0 0 0 ) 。同时，类固醇激素也会反 馈调节g n r h 和g t h 的分泌。外源的性类固醇激素可以诱导许多鱼类的性分化， 即雄激素诱导雄性化( p a n d i a ne ta l ，1 9 9 5 ；李英文等，1 9 9 4 ) ，雌激素诱导雌性化 ( 方永强等，1 9 9 2 ) 。因此性类固醇激素在鱼类性腺分化发育过程中起着重要的 调节作用。 一性类固醇激素的生物合成 鱼类性类固醇激素主要包括雄激素和雌激素。雄激素能促进雄性器官和副性 征发育。雌激素又称动情激素，不仅促进雌性生殖器官和第二性征的发育、成熟， 维持其正常状态，而且能引起雌性动物出现动情期变化。天然雄激素是一类含有 1 9 个碳原子的甾体化合物，主要有睾酮( t e s t o s t e r o n e ，t ) 、雄烯二酮 ( a n d r o s t e n e d i o n e ，a d s d ) 、双氢睾酮( d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ，d h t ) 等。其中睾酮 分泌量最大，活性最高。天然的雌激素是含有1 8 个碳原子的甾体化合物，主要 包括雌酮( e s t r o n e ，e 1 ) 、雌二醇( e s t r a d i o l ，e 2 ) 、雌三醇( e s t r i o l ，e 3 ) ，其中雌 二醇的分泌量最大，活性最高。雌激素对性腺发育成熟有重要作用( p i f e r r e r ， 2 0 0 1 ) ，而且对中枢神经系统的形成和活动也有重要调节作用( l e p h a r t ，1 9 9 6 ) ， 还能促进骨骼成熟、影响皮下脂肪的沉积( k h o s l ae t a l ，2 0 0 3 ) 。 和哺乳类一样，鱼类雄激素的来源主要是精巢的间质( l e y d i g ) 细胞。其合 成是以胆固醇为原料，首先转变为孕烯醇酮( p r e g n e n o l o n e ) ，而后由各种不同的 酶进一步催化形成各种激素。雌激素的主要来源是由排卵前的卵母细胞双层滤泡 膜合成：膜细胞层在g t h 作用下由胆固醇合成雄激素( 睾酮) ，然后转移到颗粒 细胞层，芳香化为雌二醇( n a g a h a m a e ta l ，1 9 8 3 ) 。雌激素由雄激素在甾环的第 l o 位上去甲基化，同时a 环芳香化形成( t h o m p s o ne la l ，1 9 7 4 ) 。雄激素和雌 激素的合成途径如图1 。 雌激素的生物合成需要许多酶的参与，而其中芳香化酶( a r o m a t a s e ) 是催化雄 激素向雌激素转化的一个关键酶。它能够催化某些雄激素( 如睾酮和雄烯二酮1 转 化为雌激素( c o n l e y e ta l ，2 0 0 1 ) 。因此生物体内芳香化酶的活性和分布能反映雌 激素的生物合成状况( s i m p s o n ，2 0 0 0 ) 。 醋酸 h 0 h 0 胆固醇 孕烯醇酮 1 7 。理化酶j卟 h ， 17 a 一羟孕烯醇酮 脱羟表摧酮 m 一羟化酶5卟 够洲 譬擎 叶人j 异构鼍人八 17 一羟孕酮 17 , 2 0 - 一1 。 影 固醇脱氢酶 l 茚p k 丫一 翮鼍人以j 堆烯二醇 雄烯二酮 雌酮 ：7 一酮还原酶l ( j 。1 1 7 - 目目还原写。 哉酽o 肭要人从j从 。 墨丸酮 “ 雌二醒 图1 ：雄激素及雌激素合成途径 二芳香化酶的组成和作用机理 芳香化酶是由两个酶组成的复合物。一个是细胞色素p 4 5 0 芳香化酶 ( p 4 5 0 a r o m ) ，它属于细胞色素p 4 5 0 家族，位于细胞内质网上。p 4 5 0 a r o m 是一 种细胞色素加氧糖蛋白，将c 1 9 类固醇底物转化为c 1 8 雌激素。另一个是和 p 4 5 0 a r o m 相连的一种非特异性的黄素蛋白，在大多数细胞中都存在，叫做尼克 酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( n a d p h ) p 4 5 0 细胞色素还原酶，负责将电子从 n a d p h 传递到p 4 5 0 a r o m 上( s i m p s o ne la l l 9 9 4 ) 。 芳香化反应发生在内质网中，是一种氧化反应。每1 m o l 雌激素的形成，需 要3 t o o l 的n a d p h 和0 2 。黄素蛋白运送n a d p h 到p 4 5 0 a r o m ，后者结合雄激 素，并将氧原子加入到雄激素分子中，即将雄激素的a 环芳香化，脱去1 9 位的 碳原子并将3 位的羰基转化为羟基，从而将雄烯二酮和睾酮等雄激素转化为雌酮 和雌二醇( s i i t e r i 1 9 8 2 ) 。 整个芳香化反应过程中，细胞色素p 4 5 0 芳香化酶起主导作用，对调节整个 性类固醇激素的平衡有重要意义( w c h i i t s ，1 9 4 2 ) 。因此，对于芳香化酶的研究 主要集中于细胞色素p 4 5 0 芳香化酶。 在大多数哺乳动物中，p 4 5 0 a r o m 由c y p l 9 单基因编码，之所以命名为 c y p l 9 ，是因为c 1 9 上的甲基是氧化攻击的位点( s i m p s o ne ta l ，1 9 9 7 ) 。该基因 属于细胞色素p 4 5 0 基因家族，其氨基酸序列具有明显的细胞色素p 4 5 0 基因家 族的特征：跨膜区，i 螺旋区，o z o l s 肽，亚铁血红素结合区( s i m p s o ne la l 。1 9 8 9 ) 。 c y p l 9 基因的表达受组织特异性的启动子调控，组织特异性表达是其表达模式的 最大特点。人c y p l 9 基因以单拷贝位于人染色体组的1 5 q 2 1 2 区带( 图2 ) ，包 含有一个3 0k b 的编码区和一个9 3k b 的调节区，这个调节区包含1 0 个组织特异 性启动子。每个启动子都有独特的d n a 调节序列和转录因子，这些启动子分别 对应于性腺、骨头、脑、血管、脂肪、皮肤、胎儿肝脏和胎盘( b u l u ne t a l ，2 0 0 3 ) 。 但在鱼中却发现了由两种不同基因编码的p 4 5 0 a r o m ，分别来自性腺( c y p l 9 a ) 和脑( c y p l 9 b ) ( t c h o u d a k o v ae la l ，1 9 9 8 ；t o n ga n dc h i a n g ，2 0 0 1 ) 。这两种芳香化酶 具有特异性的启动子和不同的组织分布，表达受不同调节因子影响，在胚胎发育 过程中有不同时空表达，具有独特的功能( k i s h i d a e la l 2 0 0 1 ；c a l l a r de t a l ，2 0 0 1 ) 。 这种多基因编码同一蛋白现象可能是由于进化过程中基因复制时发生串联复制， 然后分散而得出的结果：而单基因多启动子现象则是由于复制后的聚合而产生的 ( c a l l a r de ta l ，1 9 9 7 ) 。 图2 人c y p l 9 ( p 4 5 0 a r o m ) 基因组结构，位于人染色体组的1 5 q 2 12 区带。每个组织表 达特异的外显子i 或5 - u t r 后，再连接到外显子i i 的剪接位点( a g g a c t ) j 2 ，这样芳香化 酶m r n a 的编码区和翻译的蛋白质就都是相同的( b u l u ne t a l ，2 0 0 3 ) 。 至今，人们已经从哺乳类( c o r b i ne ta l ，1 9 8 8 ；h i c k e ye ta l , 1 9 8 8 ；t e r s h i m ae t a , 1 9 9 1 ) 、鸟类( m c p h a u lg ta l ，1 9 8 8 ；s h e ne ta , 1 9 9 4 ) 、两栖类( m u r d o c ke ta , 2 0 0 3 ； j e y a s u r i ae t a l ，1 9 9 8 ) 和鱼类( t a n a k a e t a l , 1 9 9 2 ；t r a n t ，1 9 9 4 ；i j i r ie t a l ，2 0 0 3 ；z h a n g e t a l ，2 0 0 4 ) 中克隆到了p 4 5 0 芳香化酶的e d n a 。这些e d n a 编码氨基酸序列( 特 别是在亚铁血红素结合区) 具有较高的同源性，表明芳香化酶在进化上和功能上 都是保守的。 芳香化酶古基因最早大概出现在1 5 0 0 万年以前，到9 0 0 万年前，c y p l 9 基 因开始分离出来。5 0 0 万年前时开始出现在性腺组织，在4 0 0 万年前才出现于脑 组织( n e b e r te ta l ，1 9 8 7 ) 。c a l l a r d 等0 9 8 4 ) 等在文昌鱼( a r n p h i o x u s ) 这种最原 始的脊索动物的性腺( 包括精巢和卵巢) 中检测到了芳香化酶的活性，但没有在 脑中检测到；在无颚七鳃鳗( 1 a m p r e y ) ( 俗称八目鳗) 脑中不确定是否存在芳香 化酶活性( c a l l a r de t a l ，1 9 8 0 ) 。然而，在软骨鱼类( s h a r k s ) 、两栖类、爬行类和 鸟类的脑中都能清楚地检测到芳香化酶的活性( c a l l a r de la l l 9 7 7 ；g e l i n a se t a l ，1 9 9 8 ) 。但方永强等用免疫细胞化学和原位杂交技术在文昌鱼神经系统( 脑和脊 髓) 中都找到了芳香化酶的活性和转录产物，因此芳香化酶基因的进化还需要进 行讨论( 方永强等，2 0 0 3 ) 。 在目前所研究过的所有脊椎动物中，雌激素，特别是1 7b 雌二醇( e 2 ) 在 早期发育，青春期出现，成熟生殖周期中担当着非常重要的角色。e 2 直接影响 许多生理事件，包括肝卵黄蛋白原的合成，卵母细胞的生长，配子形成，以及低 等脊椎动物温度依赖性的性别决定。细胞色素p 4 5 0 芳香化酶，c y p l 9 基因的产物， 是一个非常重要的类固醇生成酶。它能催化雄激素转变为雌激素( 特别是催化雄 ( 甾) 烯二酮为雌激素酮和睾酮为e 2 ) 。这一转化过程对鱼类、鸟类、爬行类和两 栖类等脊椎动物的性分化和性腺发育是必不可少的( e l b r e c h te ta l ，1 9 9 2 ； w e n n s t r o me ta 1 9 9 5 ；r i c h a r d m e r c i e re a 1 1 9 9 5 ) 。 三、芳香化酶在鱼类体内的分布 许多研究者已证实，芳香化酶广泛存在于大多数脊椎动物( 从鱼类到鸟类) 的 脑和垂体中，但在鱼类( 金鱼和蟾科鱼类) 脑和垂体中的水平比其他脊椎动物高出 1 0 0 倍( c a l l a r de ta l ，1 9 8 1 ) 。进一步研究发现，芳香化酶还存在于鱼类的性腺中 ( c a l l a r de ta , 1 9 8 2 ；m o n o de ta l ，1 9 9 2 ) 。在赤点石斑鱼中，脑芳香化酶 ( p 4 5 0 a r o m b ) 有广泛的组织分布，脑和垂体的表达量很高，各组织表达量有明 显的雌、雄差异；而性腺芳香化酶( p 4 5 0 a r o m a ) 表达主要集中于垂体和性腺，且 不论雌雄，其性腺表达量均高于脑垂体，干1 p 4 5 0 a r o m b 的表达模式明显不同，表 现为在脑部，p 4 5 0 a r o m b 表达量高于p 4 5 0 a r o m a ，而在性腺，p 4 5 0 a r o m a 表达量 高于p 4 5 0 a r o m b ，两种芳香化酶在脑垂体和性腺出现重叠表达( 李广丽等， 2 0 0 4 ) 。 鱼类体内雌激素的生成量与芳香化酶的活性有关。成熟金鱼( c a r a s s i u s a u r a t u s ) 和琵琶鱼( o p s a n u s t a u ) 芳香化酶主要集中在脑垂体和前脑，它们中的神 经内分泌组织能够产生大量的雌激素。琵琶鱼延脑和脊髓前部产生雌激素的量高 于中脑和后脑以及脊髓的其它部分( p a s m a n i ke ta l ，1 9 8 5 ) 。产生芳香化酶有特定 的区域和特殊的分泌细胞类群，莫桑比克罗非鱼( o r e o c h r o m i s m o s s a m b i c u s ) 脑 垂体中产生芳香化酶的主要部位是在p p d ( p r o x i m a lp a r sd i s t a l i s ，间叶) 区，它 产生芳香化酶的量l l n i l ( n e u r o i n t e r m e d i a t el o b e 过渡叶) 区高出2 5 倍( c a l l a r d gve ta l ，1 9 8 8 ) 。大杜父鱼( m y o x o c e p h a l u so c t o d e c i m s p i n o s u s ) ( c a l l a r de l a l ，1 9 8 1 ) 、虹鳟( s a l m o g a i r d n e r i ) ( l a m b e r te t a l ，1 9 8 2 ) 、金鱼和琵琶鱼( p a s m a n i ke t a l ，1 9 8 5 ) 、非洲鲶鱼( c l a r i a s g a r i e p i n u s ) ( t i m m e r se t ，1 9 8 7 ) 和三刺鱼( g a s t e r o s t e u s a c u l e a t u s ) ( b o r ge l a l ，1 9 8 7 ) 等间脑中芳香化酶的活性都很高 鱼类脑垂体中芳香化酶催化雄激素转化为雌激素的速率在不同种类之间 也有差异。金鱼的转化速率最高，为3 6p m o l m g 。h 一：琵琶鱼次之( p a s m a n i k e la l ，1 9 8 5 ) ，为1 6 p m o l m g 一1 h 1 ；其他种类如大西洋鲑鱼( s a l m os a l a r ) ( a n d e r s o ne ta l , 1 9 8 8 ) ，0 6 p m o l m g 一1 h ；三刺鱼，0 1p m o l m g 。1 h 。1 ； 大杜父鱼( c a l l a r de t a , 1 9 8 8 ) ，0 1p m o l m g 。h 。这种差异的原因目前尚 不清楚，仍有待进一步探讨。 四、芳香化酶在个体发育中的作用 研究表明，芳香化酶可以影响哺乳动物中枢神经系统的功能和发育，调节神 经内分泌和繁殖功能以及性行为( l e p h a r t ，1 9 9 6 ) ，并参与非哺乳动物性腺分化的 调控( p i f f e r r e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。很多实验己证实芳香化酶可控制多种鱼类的性别分 化和性别转化( n a k a m a r ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。鱼类雌雄个体间以及成熟个体与未成熟个 体问芳香化酶的活性存在着一定的差异。曾有研究表明，雌大杜父鱼脑垂体中芳 香化酶的活性比雄大杜父鱼高得多，合成雌激素的量显著多于雄鱼( o l i v e r e a le t a l ，1 9 8 5 ) 。成熟的和未成熟的雄性大西洋鲑鱼脑部和脑垂体组织能将雄烯二酮转 化为雌酮和1 71 3 一雌二醇，由于成熟的雄性大西洋鲑鱼脑部芳香化酶活性比未成 熟的个体高，因此合成雌激素的能力比未成熟的个体强，尤其是端脑和间脑两部分 ( a n d e r s o ne t a l ，1 9 8 8 ) 。脑垂体合成雌激素的能力在未成熟雌鱼和未成熟雄鱼之 间没有区别( a n d e r s o ne t a l ，1 9 8 8 ) 。莫桑比克罗非鱼脑垂体中r p d ( r o s t r a lp a r s d i s t a l i s ，前叶) 和p p d 两区域芳香化酶活性的差别雌雄之间不明显，但小脑中雌 鱼的含量高于雄鱼，而神经垂体中叶则雄鱼高于雌鱼( c a l l a r de ta l ，1 9 8 8 ) 。金鱼生 殖季节期间脑部芳香化酶的活性雌鱼高于雄鱼，而脑垂体中这种现象不明显 ( p a s m a n i ke ta l ，1 9 8 8 ) 。性未分化或刚分化的虹鳟鱼苗中没有出现芳香化酶活性 ( v a n d e n h u r ke t a l l 9 8 2 ) 。 硬骨鱼类脑中芳香化酶活性会随季节变化而波动。生殖季节过后的大西洋鲑 鱼，端脑和间脑中芳香化酶的活性降低( m a y e r e t a l ，1 9 9 1 ) 。金鱼和三刺鱼脑中芳 香化酶的活性生殖季节高于非生殖季节。日本鳗鲡( a n g u i l l a j a p o n i c a ) 血液中1 7 b 一雌二醇的含量与芳香化酶的活性有关，滤泡细胞层分泌1 7b 一雌二醇的量取 决于芳香化酶活性的高低。芳香化酶通过催化雄激素转化为雌激素的过程来加速 卵子发育早中期物质能量的积累，但过高的活性对卵子发育后期则有抑制作用。 在卵母细胞胚泡迁移阶段，过高的芳香化酶活性会抑制日本鳗鲡1 7c l ，2 0b 双羟孕 酮的形成，并妨碍卵母细胞的成熟和排卵( i j 谢e la l ，1 9 9 5 ) 。大眼梭鲈( s t i z o s t e d i o n v i t r e u m l 和金鱼在产卵之前体内芳香化酶的活性受到调节而降低( p a s m a n i ke l a l ，1 9 8 8 ；b a r r y ，1 9 9 2 ) 。y o u n g 等( 1 9 8 3 ) 以马苏大麻哈鱼( o n c o r h y n c h u sr h o d u r u s ) 滤泡膜颗粒细胞层分泌1 71 3 一雌二醇的水平来研究芳香化酶活性随性细胞发育 过程的变化。结果表明，颗粒细胞层1 7b 一雌二醇在卵黄形成期呈上升趋势，到卵 黄形成末期达到最高峰，之后迅速下降，卵子成熟时达到最低点。综合以上的研究 结果可以认为，芳香化酶通过催化雄激素转化为雌激素，促使肝脏合成卵黄蛋白原， 保证了卵母细胞的卵黄生成和积累，使得卵子的发育能够正常地进行。因此，可以 认为芳香化酶的活性对鱼类卵母细胞的发育有重要作用。孔雀鱼( p o e c i l i a r e t i c u l a t a ) 怀孕期的长短与芳香化酶的活性高低有关，当芳香化酶的活性较高时， 怀孕期缩短( v e n k a t e s he la l l 9 9 1 ) 。一般情况下，大西洋鲑鱼要在海里生活一段 时间再洄游到淡水中进行产卵繁殖，但有些雄性的大西洋鲑鱼在入海之前性腺就 已成熟。这种早熟现象，r o w e 等( 1 9 9 1 ) 认为与芳香化酶的活性有关。 雌激素对中枢神经系统( c n s ) 起重要作用( m a c l u s k ye ta l ，1 9 8 1 ) 。虽然 人们首先关注的是围产期脑的性别分化以及同生殖和性行为有关的脑区，但是越 来越多的证据表明，在许多不同的脑区和生命期中，雌激素广泛发挥着作为一般 神经营养因子的作用( m c e w e ne ta l ，1 9 9 4 ；w o o l l e ye ta l ，1 9 9 8 ；s h a y w i t ze ta l ，1 9 9 9 ； g i b b se ta l ，1 9 9 8 ) 。因为雌激素进入c n s 靶位点时可能被高水平的血浆雌激素结 合蛋白或神经雌激素代谢酶所抑制，所以激活一定神经应答的雌激素水平依赖于 在脑中雄激素转变为雌激素的芳香化作用。脑合成雌激素的能力和神经雌激素调 节雄激素的重要作用是所有脊椎动物系统发生过程中的保守特征( c a l l a r de l d ，1 9 8 3a n d1 9 9 3 ) 。尽管在哺乳动物中，脑芳香化酶( p 4 5 0 a r o m ) 的活性是在胚 胎和初生时最高，并且主要集中在视前区下丘脑( p o a i t h ) ，但是在非哺乳动 物中相应的区域即使是成年时期也有很高的水平，并且在整个c n s 中活性都很 高。在所有被研究的脊椎动物中，硬骨鱼被检测到有特别高的p 4 5 0 a r o m 酶和 m r n a 水平( p a s m a n i ke ta l ，1 9 8 5 ) 。这个特点使得研究芳香化酶调控作用和定位 变得更方便，并且使人们有了一种新的认识。例如，芳香化酶活性验证和在金鱼 视网膜及视顶盖的特定神经纤维层的免疫标签细胞暗示神经雌激素在视觉系统 中有调控功能( g e l i n a s “a l ，1 9 9 3a n d1 9 9 7 ) 。尽管现有的成年大鼠脑中芳香化酶免 疫标签显微图显示只在侧部的膝状弯曲核和视觉皮质层有少量很弱的标记神经 元( s a n g h e r ae ta l ，1 9 9 1 ) ，但是在哺乳动物中，因物种的不同，参与视觉过程的 神经雌激素的量可能会更多。有趣的是，在硬骨鱼的生命周期中，视觉系统保留 着神经发生，突触发生和功能性神经再生的显著潜能，而这些特点在哺乳动物的 胚胎和初生时期一般受到限制。 五、芳香化酶基因的表达调控 雌激素在脊椎动物的性别发育( 解剖学、功能和性行为等特征) 中起着非常 重要的作用，而这些对脊椎动物的生殖又是至关重要的。雌激素的合成是由一种 复合酶催化的，其中一种就是p 4 5 0 芳香化酶，它由c y p l 9 基因编码。c y p l 9 基 因在脊椎动物门中如人、小鼠、大鼠、牛、鸡、斑马纹草雀、爬行类、斑马鱼， 青鳟等高度保守。在哺乳动物中，c y p ，9 基因在许多组织中都有表达，如性腺、 皮肤、脂肪组织、胚胎和脑，而在鱼里，它主要在脑和性腺中表达。除了猪( c o r b i n “a l ，1 9 9 5 ) 和大西洋缸鱼( c h i a n ge ta l ，2 0 0 1 ；t c h o u d a k o v ae t a l ，1 9 9 8 ) 证实有多 个c y p l 9 基因外，其它大多数物种都只有一个c y p l 9 基因。在人、羊、兔子和 斑马纹草雀中c y p l 9 基因的组织特异性表达的实现是通过使用不同的组织特异 启动子和不同的选择性剪接来实现的。( t o n ga n d c h i a n g ，2 0 0 3 ) 到目前为止，人类c y p l 9 基因的e d n a 全序列已经清楚，基因组全长至少7 0 k b ，由1 0 个外显子组成( c h e r t e la l ，1 9 8 8 ) 。c y p l 9 基因的外显子i 中有多个启 动子。现在已经报道的外显子i 和相应启动子，如图3 所示。 盎动平1 1 5启 竺高i 啬互尚 口 固 功予1 2启动子 z | 囤竺! 尚i 矗zi 囤i 回i 口五工翅 图3 人类芳香化酶基因外显子i 及相应的启动子 人类c y p l 9 基因存在的多个启动子分别在胎盘，胎儿的肝脏或皮肤纤维原细胞， 卵巢，卵巢或精巢，胎盘和脑，脂肪，皮肤等组织中表达。如图4 所示( m a h e n d r o o e t a l ，1 9 9 1 ；b u l u ne t a l ，1 9 9 3 ；s i m p s o ne t a 厶1 9 9 3 ；s h o z ue t a l ，1 9 9 8a n d 2 0 0 2 ) 。 p 4 5 0 a r o mm r n a ! 蠼陵墨! 量唆璺璧垒髓羔睦叁鲢塞立鲢! 强曼q 基羔篓坌羔苣q 僻 翌p ”q 卜 6 ”u ；矗 b o n e r i ：习- 一一一一一一一一一一 1 瓜卜一一一一一一一一一一 b r a i n 亚一一一一一一一一一一 s k i n 盱一一一一一一一一一一 f e t a l 一塑卜一一一一一一一一一一 t i s s u e s u i 4 b 一一一一一一一一一一 凛：踹锄a 芝- 一一一一一一一一一一 广b 一一一一一一一一一一 一b r e a 。s 。t _ 謦一 l j p l f l 一一 图4 人类芳香化酶组织特异性表达启动子 在人类、牛、甚至是鸟类中，性腺组织特异性启动子高度保守，脑的组织特异性 启动子也非常保守。这表明，在不同物种中，控制c y p ，9 基因在性腺和脑中表达 的调控元件是保守的( h o n d a e t a l ，1 9 9 6 ) 。为了更好的理解芳香化酶基因在不同 组织中表达的复杂调控机制，深入分析c y p l 9 基因启动子的工作已经展开。 在卵巢和精巢中，促性腺激素f s h 和l h 通过增加细胞内c a m p 的浓度而诱 导芳香化酶基因表达( y o n g e la l ，1 9 9 4 ) 。在人类中，位于第二个外显子上游2 7 8 b p 处的一个类固醇生成因子1 ( s f 一1 ) 结合位点和一个c a m p 反应元件对于芳香化 酶基因卵巢特异发表基本转录非常重要( h i n s h e l w o o de ta l ，2 0 0 0 ) 。s f 一1 也叫 n r 5 a 1 ，对许多类固醇基因的表达非常重要。性腺特异启动子已经被深入研究， 因为乳腺癌原于c y p l 9m r n a 的过量表达，以及子宫内膜异位是非正常使用启 动子的结果( z e i t o u ne ta l l 9 9 9 ；z h a oe ta l ，1 9 9 6 ) 。转录因子w t i 和d a x i 抑 制c y p l 9 基因在人体子宫内膜基质细胞中的表达( g u r a t e se ta 1 2 0 0 2 ) 。除了c r e ， c c a a t 增强子结合蛋白，c e b pb 对c e b pb 缺乏小鼠的卵泡发育十分重要 ( y a n g e l a l 2 0 0 2 ) 。c e b pa 和c e b p b 也结合在子宫内膜基质细胞启动子相应 的反应元件上分别起着诱导和抑制作用。还有r x r 和p p a ry 配体抑制c y p l 9 m r n a 在人类卵巢粒层细胞和乳房脂肪纤维原细胞系的转录。一个沉默元件s 1 调控c y p l 9 基因在乳腺细胞中的活性。最近，使用酵母单杂交的方法( y a n ge t a l ，2 0 0 2 ) 显示孤核受体e a r - 2 ，c o u p t f l 和r a ry 结合到s 1 上从而下调转 录水平，然而，e r rn 一1 却起着相反的作用。c y p l 9 除了在卵巢粒层细胞中表达 外，在s e r t o l i ，l e y d i g 和精巢中的精子细胞中也被检测到。在许多精巢衍生细胞 系中一个假定的带有g a t a 重复启动子i i 被发现有结合g a t a 1 ，4 和一6 并与f o g 相连，它会导致c y p l 9m r n a 转录下降( t r e m b l a ye la l ，2 0 0 1 ) 。 c y p l 9 基因脑特异性表达与硬骨鱼类对环境的适应有关( s a k a ie l a l ，1 9 8 8 ) 。 c y p l 9 在下丘脑和脑边缘的表达被认为会对脑产生局部影响。在脑中产生的雌激 素可进一步代谢为儿茶酚组分，它也能与脑局部和附近区域的雌激素受体结合 ( l e p h a r t ，1 9 9 6 ) 。c y p l 9 基因的表达导致在啮齿动物和鸟类中的性别二态现象也 有报道。在人类，c y p l 9 基因在脑中的特异性表达与使用启动子i f 有关。在小 鼠、鸟和鱼类中，脑组织特异性启动子也已被证实。在哺乳动物和鸟类脑组织特 异性启动子中发现一段长为5 5 b p 的高度保守序列( r a m a c h a n d r a ne la 1 1 9 9 9 ) 。 然而在鱼类中却未曾发现这一序列。调控脑芳香化酶基因表达的因子也不是很清 楚。至今，脑组织特异性启动子中未曾发现有s f l 结合位点。在斑马纹草雀下 丘脑的特定区域c y p ，9 和s f 1 有重叠表达，但是在端脑和海马组织中却没有， 这可能表明s f 一1 通过别的相对独立的途径调制c y p l 9 基因在鸟类脑中的表达 ( a g a t ee ta l ，2 0 0 2 ) 。雄激素被报道能刺激c y p l 9 基因在鱼类和鸟类脑中的表达， 4 然而在哺乳动物中却起着刺激或者抑制双重作用。雌激素和外源雌激素都可上调 c y p 9 基因在斑马鱼脑中的表达。蛋白激酶c 和蛋白激酶g 促进神经递质如多 巴胺，的合成和释放，从而刺激c y p l 9m r n a 在胚胎中脑的表达( a b e d o h m a e e ta 1 1 9 9 6 ) 。目前，结合在小鼠脑特异启动子顺式调控元件的蛋白已被证实 ( h o n d ae ta l ，1 9 9 9 ) ，然而，对于它们参与调控脑组织特异表达的机制研究甚少。 六、本文研究目的及意义 斜带石斑鱼( e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) ，属鲈形目p e r c o i d e i 、艏科s e r r a n i d a e 、石 斑鱼亚科e p m e p h e h n a e ，石斑鱼属e p i n e p h e l u s 。其肉质鲜美，营养丰富，为餐 桌中的上等佳肴。由于其生长快、市场价格高而稳定，是目前我国沿海地区重要 的海水养殖经济鱼类。斜带石斑鱼是一种雌性先熟的雌雄同体鱼类，雌性鱼在大 约5 龄( 体长约为5 5 7 5 c m ) 时性成熟，在7 龄左右开始转变为雄鱼( z h a n ge ta l ， 2 0 0 4 ) ，在人工繁殖时常会遇到难以同时得到功能性雄性和雌性亲鱼的问题，给 种苗生产造成很大困难。随着我国海水鱼类人工养殖业的不断发展，遵照我国“科 技兴海”的方针，对鱼类性腺分化发育和性逆转进行深入的研究，并最终实现人 工调控将具有重要的意义。 目前，对鱼类芳香化酶活性的研究是鱼类生殖内分泌学和生殖生理学研究 的前沿领域之一，经十几年的研究，在某些方面已取得进展。如已有的研究初步表 明，芳香化酶在鱼