（遗传学专业论文）应用转基因技术提高稻谷耐贮藏特性的研究.pdf

致谢 本论文是在导师孙宗修研究员的悉心指导下完成的，从选题、方案制定和实施 鬟绣采分橱、论文撰写，无不凝聚蓿导师豹心盘i 手羹智慧。羚j | ；忘我的工 筝精神、渊 博的知识、严谨的治学态度、踏实的科研作风以及对科学前沿敏锐的洞察力无不深 深影晌着我。三年来，导师给了我众多的学习机会，参加留际视构培训、参加国际、 国内学术会议以及铡各兄弟实验室攀习，使我开隧了眼赛，增长了见识，t l i 丰富了 自己的专业知识。这些都将使我受髓终生。三年来导师在学习和生活上无徽不至的 关怀，终令我终生戆忘。在此，囊我尊敬的导爆弥宗修先垒致以最崇高懿敬意 本研究的顺利实施得益于中科院上海植物生理生态研究所王宗阳研究员和中国 农鼗大学彭友良教羧熬热力糖蘩稻拯导。畿既致爨壤诚挚熬感落l 本论文的完成离不开课题组斯华敏、付距萍、颜红岚、于永红、胡国成等老师 的关心稻帮轴。 刘梅、刘文真、汪得凯、李付报、丁建、金静、施利刹、许永汉、于彦春、哪 敏、廖鸥娟等同学在我三年的掌习、工作和生活中提供了不少有益的帮助和建议； 在上海檀物生理生态磺究绣试验款阀得到了杨惠军、沈辉、骧俊、朱荚等闲学的建 议和帮助：在中国农业大学试验期间得到了王扬、张世宏、付艳萍等同学的指导和 帮劲，在此一并表瑟衷心的感澎。 在三年的学习嫩活中，中国水稻研究所郑康乐研究员、唐健研究员、钱前研究 员、朱逡东研究员、程式华研究受、李鹾鞠研究爨、晦藏装戮研究员；浙江大学糸 睦元教授、方盛国教授、郭泽建教授等给予了热情的关心和帮助。 秦志鲷、邱孝珍、龚美珍、毛淑珠、赘辉林等辩辅入爨为本实验付出了大量辛 勤的劳动。 感谢远在四川的父母、哥哥、姐姬对我的支持和鼓励；感谢岳父、岳母、爱妻 卢悦以及妹妹三年采给予我豹理解巍支持，我黪每一分进步都魄含藩你们豹付爨l 没有你们的爱，很难想像我能顺利究成这三年的学业! 感爨所有关心积帮助过我黪矮导、老师、露学和朋友绥； 何正权 2 0 0 3 年5 月杭州 塑塑：叁堂堕主堂垡垒兰 一旦：壅塑! 兰 摘要 粮食安全是一个全球性的战略问题，是关系到国家乃至世界政治稳定和经济发 展的大事。我国有6 5 以上的人口以大米为主食，水稻担当着我国粮食安全的第一 重任，而粮食贮备又是其中重要的一环。我国每年因稻谷陈化问题损失的包括作为 食用和种用的稻谷占总产量的3 ，造成几十亿元的经济损失。稻谷在一般贮藏条 件下第二年就会产生陈化变质现象，高温高湿地区则更快。为此，我国储备粮通常 采用分散分批、定期推陈储新、轮流更新的方法，耗费了大量的人力、物力和财力。 近年来的研究表明，稻谷贮藏期间脂质的降解是导致其品质下降并产生陈味的 主要原因之一，其中脂氧合酶是脂质降解的关键酶。因此从理论上讲，l o x 的缺失可 以明显地阻止脂质过氧化作用，减缓贮藏粮食氧化变质的速度，保持清新气味，提 高耐贮性。上述推论已经在水稻l o x 3 缺失体与耐贮性关系的研究中得到了证实。 另外，水稻中l o x 的三个同工酶基因已被成功克隆。这些研究为利用基因工程的方 法提高稻谷自身的耐贮藏遗传特性铺平了道路。本研究利用基因工程新近研究进展， 分别采用反义r n a 及r n a 干涉技术在水稻胚乳中特异沉默内源l o x 基因，以期提 高稻谷自身的耐贮藏遗传特性。 另外，基于对转基因安全的考虑，特别是本试验的目的器官是作为粮食的水稻 胚乳，我们从s y n g e n t a 公司引进了甘露糖选择标记基因，以期能初步建立水稻遗传 转化的甘露糖选择标记系统，为今后能在水稻转基因研究中利用这一安全的选择标 记系统打下基础。 主要研究结果如下： 1 ) 构建了三个用于转化的双元表达载体：a ：p 1 3 w 4 h ，含胚乳特异表达启动 子、l o xc d n a 发夹结构及潮霉素选择标记基因幼，；b ：p 1 3 w 8 a p ，含胚乳特异表 达启动子、肠xc d n a 反义结构及甘露糖选择标记基因m a n a ；c ：p 1 3 w 8 h p ，含胚 乳特异表达启动子、l o xc d n a 发夹结构及甘露糖选择标记基因脚口删。 2 ) 以农杆菌介导用表达载体p 1 3 w 4 h 对粳稻品种石狩白毛( i s h i k a r i s h i r o g e ) 和t 1 6 2 进行了转化，分别获得1 5 8 个和5 6 个独立转化株系。经p c r 检测，石狩白 毛转基因植株的p c r 阳性率为9 4 3 ( 1 4 9 1 5 8 ) ，t 1 6 2 转基因植株的p c r 阳性率 为9 8 2 ( 5 5 5 6 ) 。s o u t h e r n 检测结果表明，外源d n a 片段已完整整合到水稻基因 塑塑：查兰堕：兰堂堡堡奎j 兰! ! 塑里 组中，多数为单拷贝插入，拷贝数最多的有4 个。对部分t 1 代种子进行了潮霉素抗 性遗传分析，证明外源基因在转基因后代中发生了分离。本研究获得的幼胚转化效 率为1 3 4 9 ，而转化成熟胚的效率为1 1 9 6 。与本实验室获得的结果相比较，幼 胚转化效率相对较低，文中对此进行了讨论。 3 )以幼胚为转化受体，农杆菌介导分别用p 1 3 w s a p 和p 1 3 w 8 h p 对粳稻品种 石狩白毛进行了转化，经过在含不同甘露糖和蔗糖浓度组合的培养基上筛选，分别 获得1 3 个和2 7 个独立转化株系。在1 5 9 l 甘露糖结合5 9 l 蔗糖使用时，获得了最 高转化效率( 6 9 ) 。经p c r 、s o u t h e r n 检测以及甘露糖抗性遗传分析，证明外源 基因已经完整整合到水稻基因组中，并在转基因后代发生了分离。转p 1 3 w 8 a p 的 平均转化效率为2 4 ，大大低于转p 1 3 w 8 h p 的平均转化效率( 4 7 ) ，这表明转 基因效率可能与外源目的基因结构有很大关系。本研究初步建立了水稻遗传转化的 甘露糖选择标记系统。文中还对该体系的各种影响因素及存在的问题分别进行了分 析讨论。 4 ) 分别对转p 1 3 w 4 h 的9 个、转p 1 3 w s a p 的2 个和转p 1 3 w 8 h p 的4 个株系 的t 1 代种子进行了人工陈化以及l o x 酶活测定，并将它们分别与潮霉素或甘露糖 抗性遗传分析结果以及s o u t h e r n 杂交结果进行了对比。对于多数单拷贝插入的转基 因株系，人工陈化后发芽呈现的分离情况与潮霉素或甘露糖筛选后出现的分离情况 一致，即成3 ：1 分离，但也有例外。对于双拷贝或多拷贝插入的株系，潮霉素或甘 露糖筛选时的抗性率较高，而人工陈化后的发芽情况却普遍偏低。人工陈化后的发 芽率与l o x 酶活呈现负相关关系。发夹结构对内源l o x 酶活最高抑制效率达9 2 ， 明显高于反义结构的抑制效率( 6 5 ) 。选择t 2 代中性状较好的株系进行了人工陈 化试验，并从中选出了3 个纯合耐贮藏株系。文中还对l o xe d n a 不同结构及其拷贝 数对水稻内源基因的沉默或阻抑效果以及可能的机制进行了讨论。 关键词：水稻，耐贮藏，遗传转化，l o x ，反义r n a ，r n a 干涉，选择标记，甘 露糖 浙江人学博十学位论文 英文摘要 a b s t r a c t f o o d s e c u r i t y ，w h i c h i sr e l a t e dt ot h ep o l i t i c a ls t a b i l i t ya n de c o n o m i cd e v e l o p m e n to f a c o u n t r yo re v e nt h ew h o l ew o r l d ，i sas t r a t e g i cp r o b l e m f o rt h ew h o l ew o r l d r i c ei ss t i l l o n eo ft h ep r i m a r ys t a p l ef o o d si nc h i n aa n dt h en u m b e ro f p e o p l el i v i n go n r i c ei sa b o u t 8b i l l i o n ，w h i c hi s6 5p e r c e n to ft h et o t a lp o p u l a t i o n f o o d s t u f fr e s e r v ei st h ek e y r i n go f f o o ds e c u r i t y t h el o s i n gt h a tw a sd u et od e t e r i o r a t i o no fr i c eg r a i n sd u r i n gs t o r a g ei s a b o u t3 o ft h et o t a ly i e l da n di tw a s t e ds e v e r a lb i l l i o ny u a n p e ry e a r r i c eg r a i n sb e g i n d e t e r i o r a t i o nn o r m a l l ya f t e ra b o u to n e y e a rs t o r a g ea n d t h i sw i l lf a s t e ri nt h er e g i o nw i t h h i g h e rt e m p e r a t u r ea n dh u m i d i t y i no r d e rt om i n i m i z et h el o s i n go fr i c eg r a i n s ，t h e ya r e r e p l a c e di nb a t c hp e r i o d i c a l l yi ns t o r a g ep e r i o da n dt h i sm a d eab i gw a s t eo fl a b o rf o r c e ， m a t e r i a l sa n d m o n e y m a n yr e s e a r c hw o r k si nr e c e n ty e a r si n d i c a t e dt h a tt h ed e t e r i o r a t i o no fr i c eg r a i n s d u r i n gs t o r a g ew a sc a u s e db yl i p i dp e r o x i d a t i o na n dl i p o x y g e n a s e ( l o x ) w a st h ek e y e n z y m eo ft h i sr e a c t i o n ，w h i c hc a nb eb r o k e nu pb yl o s so rs i l e n c eo fl o xg e n e al o c a l v a r i e t yd a wd a m ，w h i c hl o s tl o xg e n e ，s h o w e db e r e rs t o r a b l ec h a r a c t e ra f t e ras e r i e so f s t o r a g ee x p e r i m e n t s u n f o r t u n a t e l y , t h i sv a r i e t yc o u l dn o tb eu s e df o rr i c ep r o d u c t i o nd u e t oi t sb a da g r o n o m i cc h a r a c t e r s t h i sm i g h td u et ot h el o s so f t h el o xg e n ea l s oa f f e c t e d t h em e t a b o l i s mo ft h ew h o l ep l a n t i no r d e rt op r o d u c et h er i c ew i t hb e r e r s t o r a g ea n d a g r o n o m i cc h a r a c t e r s ，a n t i s e n s er n a ，r n ai n t e r f e r e n c e t e c h n o l o g ya n de n d o s p e r m s p e c i f i cp r o m o t e rw e r ea d o p t e d ，i no u rw o r k s ，t oi n d u c et h es i l e n c eo f e n d o g e n i cl o xg e n e i nr i c ee n d o s p e r m s p e c i f i c a l l y c o n s i d e r i n gt h et a r g e to r g a no f t h i ss t u d yw a sr i c eg r a i n ，w h i c hm a i n l yu s e da sf o o d ， w eu s e dt h em a n a g e n ef r o me c o l ie n c o d i n g p h o s p h o m a n n o s ei s o m e r a s e ( p m i ) i n s t e a d o fa n t i b i o t i co rh e r b i c i d em a r k e r s ，w h i c hp r o v o k e dm u c h p u b l i cc o n c e r n ，a sas e l e c t a b l e m a r k e r m a n n o s es e l e c t i o ns y s t e mw a s e x p e c t e dt os e tu pi nr i c et r a n s f o r m a t i o na i l dd a v e t h ew a yf o rf u t u r es t u d y m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 ) t h r e eb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e d ：1 ) p 1 3 w 4 h ，c o n t m n i n gl o x 3 塑些叁堂堕堂堡堡奎 一二茎兰! ! 兰 c d n a h a i r p i ns t r u c t u r ec o n t r o l l e db ye n d o s p e r ms p e c i f i cp r o m o t e r ( e s p ) a n d h p tg e n e ； 2 ) d 1 3 w 8 a p ，c o n t a i n i n ga n t i s e n s el o xe d n a c o n t r o l l e db ye s pa n dm a r i ag e n e ；3 ) p 1 3 w 8 h p ，c o n t a i n i n g l o xe d n a h a i r p i ns t r u c t u r ec o n t r o l l e db y e s pa n dm a n a g e n e - 2 ) j a p o n i c a r i c e i s h i k a r i s h i r o g e a n dt 1 6 2w e r et r a n s f o r m e dw i t hp 1 3 w 4 hv i a a g r o b a c t e r i u m 1 5 8a n d5 6i n d e p e n d e n tl i n e sw e r er e g e n e r a t e dr e s p e c t i v e l y t h e r ea r e 1 4 9 ( 9 4 3 ) o fi s h i k a r i s h i r o g er e g e n e r a t e ds h o o t sa n d5 5 ( 9 8 2 ) o f t 1 6 2r e g e n e r a t e d s h o o t sw e r ep c rp o s i t i v e s o u t h e r nb l o ta n dg e n e t i ca n a l y s e ss h o w e dt h a tt h ep l a n t s c o n t a i n e dt h ef o r e i g ng e n e sa n dt h eg e n e sw e r et r a n s m i t t e dt ot h ep r o g e n yi nm e n d e l i a n f a s h i o n t h ei m m a t u r ee m b r y o st r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yi nt h i se x p e r i m e n tw a s1 3 4 9 a n dt h em a t u r e e m b r y o s w a s 11 9 6 i nc o n t r a s tw i t ht h ei m m a t u r e e m b r y o s t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y ( 3 0 - 4 0 ) n o r m a l l yg o ti no u rl a b ，t h ef r e q u e n c yw eg o tw a s r e l a t i v e l yl o w a n dw em a d ead i s c u s s i o nh e r e 3 1i s h i k a r i s h i r o g ew a st r a n s f o r m e dw i t hp 1 3 w 8 a pa n dp 1 3 w 8 h pv i aa g r o b a c t e r i u m 13a n d3 7 i n d e p e n d e n t l i n e sw e r er e g e n e r a t e d r e s p e c t i v e l y a f t e rs e l e c t e do nm e d i a c o n t a i n i n g d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fm a n n o s e t h eh i g h e s tt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y ( 6 9 ) w a sp r o d u c e do nm e d i u mc o n t a i n i n g1 5 lm a n n o s ew i t h5 9 1s u c r o s e m o l e c u l a r a n dg e n e t i ca n a l y s e ss h o w e dt h a tt h ep l a n t sc o n t a i n e dt h ef o r e i g ng e n e sa n dt h eg e n e s w e r et r a n s m i t t e dt ot h ep r o g e n yi nm e n d e l i a nf a s h i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e m a n n o s es e l e c t i o n s y s t e m ，w h i c hw a sd e v o i d o ft h e d i s a d v a n t a g e s o fa n t i b i o t i co r h e r b i c i d es e l e c t i o n ，c o u l db eu s e df o rr i c ea g r o b a c t e r i u m m e d i a t e di m m a t u r ee m b r y o t r a n s f o m a t i o n 4 ) t h et 1g e n e r a t i o n s e e d so f9l i n e st r a n s f o r m e dw i t hp 1 3 w 4 h ，2l i n e sw i t h p 1 3 w 8 a p a n d4l i n e sw i t hp 1 3 w 8 h pw e r ed e t e c t e dw i t ha r t i f i c i a la g i n gm e t h o da n da l s o l o xa c t i v i t i e sw e r em e a s u r e dr e s p e c t i v e l y w i t ht h e s er e s u l t s ，as e r i e so f c o m p a r i s o n w e r em a d ew i t ht h er e s u l t so fh y g r o m y c i n bo rm a n n o s es e l e c t i o na n dt h er e s u l t so f s o u t h e r nb l o t t h eg e r m i n a t i o nr a t i o so f a r t i f i c i a la g e ds e e d sh a v e n e g a t i v er e l a t i v i t yw i t h t h ea c t i v i t i e so fl o x t h eh i g h e s tr a t i o ( 9 2 ) o fl o x a c t i v i t yr e s t r a i n tw a sp r o d u c e db y l o xe d n a h a i r p i ns t r u c t u r ea n do n l y6 5 p r o d u c e db ya n t i s e n s el o xe d n a 3p u r el i n e s w i t hb e t t e rs t o r a b l ec h a r a c t e rw e r es e l e c t e df r o mt 2g e n e r a t i o na f t e r a r t i f i c i a l a g i n g 4 浙江人学博七学位论文 英文摘要 e x p e r i m e n t w ea l s od i s c u s s e dt h ep o s s i b l em e c h a n i s m o ft h ei n h i b i t i o no f e n d o g e n i cl o x g e n eb y d i f f e r e n tl o xe d n as t r u c t u r e s k e yw o r d s ：o r y z as a t i v a ，s t o r a b l ec h a r a c t e r ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，l o x ，a n t i s e n s e r n a ，r n a i ，s e l e c t a b l em a r k e r ，m a n n o s e 5 浙江人学博l 学位论文 文献综述 第一篇文献综述 第一章植物脂氧合酶研究进展 1 脂氧合酶简介 脂氧合酶( 1 i p o x y g e n a s e ，e c1 1 3 1 1 1 2 ，l o x ) 是一种含非血红素铁的蛋白质。 它不仅广泛存在于动、植物细胞中，在藻类( z i r n m e r m a na n dv i c k ，1 9 7 8 ) 、面包酵 母( h a m b e r g ，1 9 8 6 ) 、真菌以及氰细菌( b e n e y t o u t 等，1 9 8 9 ) 中均发现有l o x 的存 在。a n d r e 和h o u 于1 9 3 2 年首次报道了来源于大豆的l o x 。而来源于动物的l o x 却是在四十多年后的1 9 7 5 年才见诸报道( n u g t e r e n ，1 9 7 5 ；s c h e w e 等，1 9 7 5 ) 。l o x 由单肽链组成，特异催化含c i s ，c i s 一1 ，4 戊二烯结构多元不饱和脂肪酸的加氧反应， 产生具有共轭双键的过氧羟基衍生物。在植物中其底物主要是亚油酸( l i n o l e i ca c i d ) 和亚麻酸( l i o n l e n i ca c i d ) ，在动物体内其底物主要是花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ) 。 在亚油酸和亚麻酸的加氧位置是c 9 和c 1 3 ，在花生四烯酸上的加氧位置主要是c ， c 1 2 和c 1 5 ，也可以在c 8 、c 9 和c l 】位上加氧( 图1 - 1 1 ) 。 近年来，有关该酶的研究倍受人们关注。随着现代分子生物学技术的不断发展， 一“，c 0 0 i f 1 3 ， 1 3 9 凰，、洁闩删 等“ ：八：o ，、，厂= ：、：、，厂弋高：斥式八， 亚油醴。盖麻酸。 图1 - 1 1 脂氧合酶在其主要底物上的加氧碳位 f i g 1 _ 1 - 1p o s i t i o n o f o x y g e n i n s e a i o no ns u b s t r a t eo f l o x ( 引自e s q u e r r ee ta 1 1 9 9 3 ) 植物l o x 生理功能研究发展迅速。研究表明，l o x 在植物的生长、发育、成熟、 衰老以及抵御机械伤害和病虫侵染等逆境过程起着重要的调节作用( h e i t z ，等，1 9 9 7 ； m a r c e l l e ，1 9 9 1 ；m e l a n 等，1 9 9 3 ；s i e d o w , 1 9 9 1 ) 。据现有报道，植物l o x 的可能生理 6 塑鲨盔堂堕主堂堡堡主l 塑! 墨堕 功能包括：( 1 ) 其代谢产物中含有活性氧和氧自由基，对细胞膜具有破坏作用，参 与植物的衰老( m i l a n ，1 9 9 3 ) 和抗病性过敏坏死反应( k e p p l e r a n d n o v a c k y , 1 9 8 7 ) ： ( 2 ) 其代谢产物作为抗菌或抗虫性物质( c r o f t a n ds l u s a r e n k o ，1 9 9 3 ) ；( 3 ) 为植物 激素茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 及其甲酯和愈创激素( t r a u m a t i n ) 提供合成的前 体物质。 2 脂氧合酶在植物中的分布 l a x 在植物细胞或亚细胞水平定位的研究表明，在绿色叶片中，茶树的叶 ( s e k i y a 等，1 9 7 6 ) 和大吴风草叶( f a r f u g i u m j a p o n i c u m ) ( h a t a n a k a e ta l ，1 9 7 7 ) 叶 中的l a x 定位于叶绿体片层膜上；苜蓿( b e n - a z i z 等，1 9 7 2 ) 叶中的l a x 则主要 存在于线粒体中，而在叶绿体中的活力较低；在燕麦和小麦叶( w a r d a l e ，1 9 7 5 ) 中 则主要定位于微粒体内；黄瓜果肉和果皮的l a x 则与液泡密切相关( w a r d a l e 等， 1 9 8 0 ) 。在豌豆( h a y d a r 等，1 9 7 3 ) 和大豆( v e r n o o y g e r r i t s e n 等，1 9 8 4 ) 种子发芽 的不同阶段l a x 定位也不相同。w a r d a l e ( 1 9 7 5 ) 指出，在进行l a x 的细胞或亚细 胞定位研究中，若只采用一种方法来分离各种细胞器，实验结果则会产生偏差。 表1 1 1 不同植物叶片中的l a x 活性( s e k i y a 等，1 9 8 3 ) t a b 1 - 1 1l o xa c t i v i t i e si nl e a v e so f d i f f e r e n tp l a n t s 植物名称 l a x 活性 植物名称 l o x 活性 ( p m o i 0 2 0 5 茸( p m o l 0 2 0 5 9 p l a n t s 1 f w m i n 。1 ) p l a n t s f w m i n l ) 银杏( g i n k g ob i l o b a ) o 1 0桑树( m o r u sa u s t r a l i s )1 9 2 西瓜( c i t r u l l u sv u l g a r i s ) 2 7 5马铃薯( s o l a m o nt u b e r o s u m )0 1 7 甘监( b r a s s i c ao l e r a c e a ) 0 0 4烟草( n i c o t i a n at o b a c u m )l3 l 番茄 ( l y c o p e r s i c u n 茶( t h e as i n p h s 缸) 0 3 00 3 7 e s c u f e n t u m ) 茶梅( c a m e l l i as a s a n q u a ) 0 2 0 向日葵( h e l i a n t h u sa n n u l g $ ) 0 0 5 苜蓿( m e d i c a g o s a t i v a )0 5 3莴苣( l a e t u e as a t i v a )0 0 8 大豆( g l y c i n e m a x )2 7 0 水稻( o r y z as a t i v a ) o 1 3 菜豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s )0 3 8玉米( z e a m a y s ) 0 、5 5 冬青( 1 l e xi n t e g r a ) 0 2 0 从表1 一l - l 可以看出不同物种间的l o x 活力有较大差异，如大豆叶中酶活力很 高而向同葵叶中的则很低。大豆种子( s h a s t r y 等，1 9 7 5 ) 的酶活力很高而成熟的茶 树种子中没有酶活力；同一植物的不同器官之间也存在差异，番茄的绿叶、末成熟 果实( 绿色) 和成熟果实( 红色) 比较，成熟果实的酶活力显著地高于绿叶和未成 塑望叁堂堕主堂堡笙茎兰塑兰堕 熟果实中的酶活力( s e k i y a 等，1 9 8 3 ) ，茶树一芽一叶、第二叶、第三叶、第四叶及 叶梗之间的酶活力差异亦较明显，随着叶的发育过程酶活力有降低的趋势。此外， 在一种叫作f u s a r i u mo x y s p o r u m 的真菌中亦检测到了l o x ( s a t o h 等，1 9 7 6 ) a 3 脂氧合酶途径 高等植物的脂肪酸氧化途径有4 条：o 氧化、b 氧化、y 氧化和l o x 途径。l o x 途径的最初反应是甘油脂类( 如磷脂) 水解释放游离脂肪酸，作为l o x 的反应底物。 一般情况下，l o x 以游离脂肪酸为底物，而难以作用于酯化的脂肪酸( 如磷脂中的 脂肪酸) ，但有些l o x ，如网状红细胞l o x 可以直接攻击磷脂，甚至生物膜( s i e d o w , 1 9 9 1 ) 。 典型的l o x 是每1 0t o o l 酶含有1 0t o o l 的非血红素铁，l o x 以其氧化态( f e 3 + 形态) 参与催化氧化过程。l o x 可以自我活化( s e l f - p r o p a g a t i n g ) ，即可被其催化 产生的脂质过氧化物活化或氧化，但当脂质过氧化物浓度很高时，也会导致l o x 的 失活。l o x f e 3 + 首先与底物亚油酸或亚麻酸结合，以立体特异性的方式，催化脱除 c l l 亚甲基上的氢原予，并进行重排反应，产生c 1 3 ( 如大豆l o x 1 ) 或c 9 ( 如大 豆l o x 2 ，3 和其他一些l o x ) 脂肪酸自由基，同时l o x 被还原成f e 2 + ，并形成 l o x 一脂肪酸自由基复合体，随后l o x 一脂肪酸自由基复合体与0 2 反应生成脂质过氧 自由基。若在厌氧条件下，则是从l o x 脂肪酸自由基复合体中释放出脂肪酸自由基， 这一反应发生在亚油酸的氧化过程，在亚麻酸的氧化过程也可能发生，这就是l o x 的脂质过氧化氢酶反应，产生脂肪酸二聚体和氧代二烯酸。l o x 初始反应的最后步 骤是氢过氧化脂肪酸自由基还原成氢过氧化脂肪酸( 如1 3 ( s ) 过氧化氢9 一顺一1 l 一 反- 十八烯二酸) ，同时l o x 被氧化成f e 3 + 形态。上述反应过程中，氢原子的脱除是 一个限制性步骤。在高等植物中，l o x 反应产物氢过氧化脂肪酸可通过l 2 个途 径被代谢分解。一个途径是氢过氧化物裂解酶催化裂解为1 3 氢过氧化亚油酸或1 3 氢过氧化亚麻酸，生成1 2 碳化合物( 1 2 一氧顺一9 十二烯酸) 和6 碳醛( 己醛或顺一3 己烯醛) ，己醛与食物的异味有关，即使在很低浓度( 如5 u g k g ) 便可产生强烈异味。 1 2 一氧一顺一9 一十二烯酸和顺一3 一己烯醛经异构化反应形成更为稳定的1 2 氧反一1 0 十二 烯酸和反一2 一己烯醛。己醛和己烯醛通常可在乙醇脱氢酶作用下转化成相应的醇；顺 一3 一己醇和反一2 - 己烯醛分别称为叶醇和叶醛，它们与叶片的青草味有关。1 2 一氧一反一1 0 浙江人学博 学位论文 文献综述 十二烯酸称为创伤激素( w o u n dh o r m o n e ) 或愈伤素( t r a u m a t i n ) ，它可被非酶氧化 生成反一2 十二烯酸，即创伤酸( t r a u m a t i ca c i d ) 。另一条途径( 至少对于亚麻酸) 是 氢过氧化脂肪酸在氢过氧化物脱氢酶催化下转化成丙二烯氧化物，丙二烯氧化物水 解产生乙酮醇；丙二烯氧化物也可进行重排和环化反应，生成1 2 一氧一顺，顺一l o ，1 5 植物二烯酸，继而经一系列反应生成茉莉酸( j a ) ( h i l d e b r a n d ，1 9 8 9 ；g a r d n e r ，1 9 9 5 ) 4 脂氧合酶的测定方法 l o x 的活性可用多元不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等作为反应 底物，利用氧电极或分光光度法来测定( a x e l r o d 等，1 9 8 1 ) 。 4 1 氧电极法 根据底物浓度一定，反应体系中的溶解氧浓度的变化与酶活力大小呈线性相关 的原理进行测定，即由于l o x 催化耗氧，溶液中氧浓度的减少速率与酶活力大小成 正比，利用氧电极可以精确地测定酶活力，此方法灵敏度极高，但测定时要严格控 制温度。本研究即采用此方法进行l o x 酶活测定。 4 2 分光光度法 在反应体系中，l o x 使多元不饱和脂肪酸氧化形成具有共轭双键的过氧化氢物， 此化合物在2 3 4n n l 波长处有吸收峰，峰高度与酶活力有显著的正相关，故可用分光 光度法进行测定，测定时，要控制好温度和时间等因素。 5 脂氧合酶的生化特性 5 1 酶学特性 以亚油酸为底物，根据产生氢过氧基手性和位置专一性的不同，植物l o x 又划 分为3 种类型( f e u s s n e r , 等，2 0 0 1 ) 。第一类主要生成1 3 l 氢过氧基9 ，11 ( z ，e ) 十八碳二烯酸 1 3 一l 一11 ( z ，e ) 一o c t a d e c a d i e n o i ca c i d ，1 3 一h p o d ，又称为1 3 一氢过氧化 亚油酸】，例如大豆种子l o x 一1 和豌豆种子l o x 2 ：第二类l o x 则生成基本等量的 1 3 - h p o d 和9 - d 一氢过氧基一1 0 ，1 2 ( e ，z ) 一十八碳二烯酸 9 d h y d r o p e r o x y - 1 0 ，1 2 ( e z ) 。o c t a d e c a d i e n o i c a c i d ，9 - h p o d ，又称为9 一氢过氧化亚油酸】，包括大豆种子中的 l o x 一2 和l o x _ 3 ；第三类主要生成9 - h p o d ，例如马铃薯块茎和番茄果实中的l o x 9 塑些叁堂堕堂笪堡苎! 堕! 堑i 查 以及豌豆种子中的l o x 3 。 大豆l o x 研究最清楚，就目前所知，大豆种子中的l o x 具有3 种同工酶：l o x 一1 ， l o x 一2 和l o x 3 。早在六十年前，a n d r e 和h o u ( 1 9 3 2 ) 首先发现大豆豆腥味的产 生是由于多元不饱和脂肪酸的酶促氧化所致，其关键酶为l o x 。由于l o x 在催化 反应中不仅生成具有共轭双键的过氧化氢物，还继续分解产生醛、酮等具有挥发性 的物质，使豆品产生腥味。通过对分离得到的大豆子叶l o x 的研究，发现每一个 l o x 是一条分子量为9 6 0 0 0 左右的多肽，每个多肽中含有一个铁原子。有试验证明， 大豆子叶的l o x 处于静止无活性状态时，铁以f e + 态存在；当加入底物以后，l o x 中的铁处于f e 2 + 态，使l o x 具有催化活性。大豆种子中的l o x 都是球形水溶性蛋 白。l o x 1 、l o x 一2 、l o x 一3 的等电点分别为5 6 5 、5 8 5 、6 1 5 。三种同工酶的生化 特性是：l o x l 的反应最适p h 值是9 0 ，l o x 2 为p h 6 5 ，l o x 一3 为p h 7 0 ( a x e l r o d 等，1 9 8 1 ) 。l o x 1 对带电脂肪酸有明显的选择性，与亚油酸的反应产物几乎全是1 3 一 氢过氧亚油酸( 9 5 ) ：l o x 一2 对中性脂肪酸表现更强的活性，与亚油酸的反应产物 为9 一氢过氧亚油酸、1 3 一氢过氧亚油酸二者各占一半；l o x 3 与亚油酸的反应产物为 9 一氢过氧亚油酸( 6 5 ) 、1 3 氢过氧亚油酸( 3 5 ) ( h s i e h ，1 9 9 4 ) 。除催化原初反应 外，l o x 还催化次级反应而形成脂肪酸的二聚苯和羰基二烯酸，类胡萝b 素的漂白 即是由l o x 次级反应实现的。 在水稻种子中也存在3 种l o x 同工酶。根据层析图谱洗脱顺序的不同，分别定 名为l o x 一1 、l o x 一2 和l o x 3 ，并呈现出不同的催化产物专一性，其中l o x 1 和 l o x 一2 属于第二类l o x ，属于第三类的l o x 3 在胚成熟过程中大量表达，占未萌 发水稻种子l o x 总活性的8 0 9 0 ，而l o x 2 则是种子萌发过程中的主要成分( i d a 等，1 9 8 3 ；s u z u k ia n dm a t s u k u r a ，1 9 9 7 ) 。进一步的研究发现，l o x 一3 是由单条多肽链 组成的非血红素蛋白，每分子含0 7 3 铁原子，分子量约为8 9 9 3 k d ，主要生成 9 - h p o d ，其氨基酸组成与大豆l o x 1 和豌豆l o x 1 及l o x 一2 相类似，t r i t o n x 1 0 0 和吐温2 0 是其有效的助溶剂。与大豆l o x 相比，水稻l o x 3 活性非常不稳定，过 氧化氢酶、金属螯合剂和氮气可以稳定其活性，而巯基类化合物和脂氢过氧化物是 其抑制剂，其中前者的抑制效应与巯基化合物的氧化副产物i - 1 2 0 2 有关( o h t a 等， 1 9 8 6 ) 。 目前，对植物l o x 同工酶的生物化学和分子生物学特性已经有t x 体了解，但 激选大学薅士学位论文文献综述 瓣l o x 的分孑结构还黉馋进一步研究。 5 2 催化机理 l o x 的催化作用魁一个自由基参与的脂氢过氧化物再生循环，包括酶、底物和 氧豹相互终用。一般认为体止状态或氧化磊活倦浆l o x 鄙不煮竣结合分子氧，露不 饱和脂肪酸结台l o x 活性中心厢才启动酶促反应；而鼠不同类型的植物l o x 同工 酶，其镒纯辍麓氇存在一定蘸蒺异。缀箨稳弼类型静豌豆耱籁l o x 麓灌纯税裁 ( h u g h e s 等，1 9 9 8 ) 以及水稻种子l o x 同工酶生化特性的差异，水稻种子l o x 1 、 l o x - 2 和l o x 。3 豹催化模式觅图2 。曾先当不饱和艏膀酸( l