高中生物 专题5课题3 血红蛋白的提取和分离精讲导学课件 新人教版选修1.ppt

课题3血红蛋白的提取和分离 一 蛋白质的提取 分离和鉴定的方法1 凝胶色谱法 血红蛋白的分离方法 1 概念 根据 的大小分离蛋白质的有效方法 也称做 相对分子质量 分配色谱法 2 原理 凝胶 分离原理 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度较慢 通过凝胶的时间 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程 移动速度较快 通过凝胶的时间 多孔球体 多糖类化合物 贯穿的通道 相对分子质量较小 较长 较长 相对分子质量 较大 较短 较短 2 缓冲溶液 1 作用 在一定范围内 缓冲溶液能够抵制 对溶液ph的影响 维持ph基本不变 2 配制 通常由1 2种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 的缓冲液 外界的酸和碱 使用比例 在不同ph范围内使用 3 电泳 血红蛋白的分离或鉴定方法 1 概念 带电粒子在 的作用下发生 的过程 2 原理 许多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有 在一定的ph下 这些基团会带上 或 在电场的作用下 这些带电分子会向着 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 的不同 使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 电场 迁移 可解离的 基团 正电 负电 与其所带电荷相反 的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移 速度 二 蛋白质的提取和分离过程1 样品处理 血红蛋白由 肽链组成 包括两条 和两条 每条肽链环绕一个 基团 此基团可携带 或 四条 肽链 肽链 亚铁血红素 一分子氧 一分子二氧化碳 1 红细胞的洗涤 目的 方法 去除杂蛋白 黄色血浆 暗红色红细胞 五倍体积生理盐水 2 血红蛋白的释放 蒸馏水 10 3 分离血红蛋白溶液 离心后试管中的溶液分为4层 从上往下依次为 第1层 无色透明的 第2层 脂溶性物质的 白色薄层固体 第3层 的水溶液 透明液体 第4层 其他杂质的暗红色沉淀物 将试管中液体用 过滤 除去 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的 液体 甲苯层 沉淀层 血红蛋白 红色 滤纸 脂溶性沉淀层 红色透明 4 透析 粗分离 过程 取1ml的 溶液装入 中 将其放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为7 0 透析12h 原理 透析袋能使 自由进出 而将 保留在袋内 目的 去除 血红蛋白 透析袋 磷酸缓冲液 小分子 大分子 样品中相对分子质量较小的杂质 2 纯化 凝胶色谱操作 制作 装填 因为干的凝胶和用 的凝胶的体积差别很大 所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量 在装填色谱柱时 不得有 存在 凝胶色谱柱 凝胶色谱柱 缓冲液平衡好 气泡 样品的加入和洗脱 3 纯度鉴定 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断 的蛋白质是否达到要求 需要进行蛋白质 鉴定方法中使用最多的是sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 纯化 纯度的鉴定 思考辨析 1 判断正误 1 凝胶色谱法分离蛋白质只根据分子大小 与其携带的电荷性质和大小无关 2 不同蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小的蛋白质易通过凝胶颗粒 先从层析柱洗脱下来 分析 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢 通过凝胶的时间较长 后洗脱下来 而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快 通过凝胶的时间较短 先洗脱下来 3 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质移动速度与蛋白质分子大小和其携带的电荷都有关系 分析 由于在凝胶中加入了sds 其所带负电荷的量远远大于蛋白质分子原有的电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移速率完全取决于分子的大小 4 透析过程中 用到的透析袋是一层选择半透膜 具有选择透过性 分析 透析袋是一层半透膜 小分子能通过 大分子不能通过 但不是一层选择透过性膜 选择透过性是针对有活性的生物膜来说的 2 问题思考 1 鸟类血液和哺乳动物血液中 最好用哪种血液来提取血红蛋白 为什么 提示 哺乳动物血液 由于哺乳动物成熟红细胞中没有细胞核 容易获得血红蛋白 2 红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白 还含有细胞破碎物 脂质 甲苯等有机溶剂 怎样除去这些杂质呢 提示 红细胞破碎混合液 中速长时离心 2000r min 10min 滤纸过滤除去脂质 分液漏斗分离出血红蛋白 一 血红蛋白的提取和分离的原理1 蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析 2 电泳方法 易错提醒 1 琼脂糖凝胶电泳操作简单 电泳速度快 样品不需要事先处理 电泳后区带易染色 样品极易洗脱 便于定量测定 2 测定蛋白质的相对分子质量常用sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小 而非所带电荷的性质和分子的形状 典例训练1 2011 广东高考 以下关于猪血红蛋白提纯的描述 不正确的是 a 洗涤红细胞时 使用生理盐水可防止红细胞破裂b 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核 提纯时杂蛋白较少c 血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测d 在凝胶色谱法分离蛋白质的过程中 血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢 解题关键 解答本题的关键是明确以下三点 1 洗涤过程的目的和注意事项 2 红细胞适合作为本实验的材料的特点 3 洗脱过程中哪种分子移动更快 解析 选d 本题考查血红蛋白的提取及凝胶色谱法分离蛋白质的原理 相对分子质量越大的蛋白质通过凝胶色谱柱的速度越快 故d错误 a正确 洗涤的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化 加入的是生理盐水 缓慢搅拌10min 低速短时间离心 重复洗涤三次 直至上清液不再呈现黄色 表明红细胞已洗涤干净 b正确 哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器 提纯时杂蛋白较少 c正确 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 如果操作都正确 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随着洗脱液缓慢流出 这使得血红蛋白的分离过程非常直观 简化了操作 变式训练 以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是 a 红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水 重复洗涤3次b 将血红蛋白溶液放在质量分数为0 9 的nacl溶液中透析12小时c 凝胶装填在色谱柱内要均匀 不能有气泡存在d 蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较大的移动速度慢 解析 选c 红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的生理盐水 重复洗涤3次的目的是除去杂蛋白 透析时使用物质的量浓度为20mmol l的磷酸缓冲液 而不是用0 9 的nacl溶液 蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较大的在凝胶外部移动 移动速度快 在装填凝胶柱时 不能有气泡存在 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 二 提取和分离血红蛋白的实验操作1 样品处理 2 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的装填 用蒸馏水溶胀凝胶 均匀装填色谱柱 在约50cm高的操作压下 用300ml的物质的量浓度为20mmol l的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h 使凝胶装填紧密 2 打开流出口 使缓冲液与凝胶面平齐 关闭出口 3 样品的加入和洗脱 易错提醒 1 小心加入磷酸缓冲液到适当高度后 再连接缓冲液洗脱瓶 打开下端出口 进行洗脱 不能边加缓冲液边洗脱 这样会扰乱洗脱顺序 2 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 再用试管收集流出液 此时收集到的才是纯度较高的血红蛋白溶液 典例训练2 下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置 请回答下列问题 1 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分 其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有功能 2 甲装置中 b是血红蛋白溶液 则a是 乙装置中 c溶液的作用是 3 甲装置用于 目的是 用乙装置分离蛋白质的方法叫 是根据 分离蛋白质的有效方法 4 用乙装置分离血红蛋白时 待 时 用试管收集流出液 每5ml收集一管 连续收集 解题关键 1 理解凝胶柱作用的原理 依据蛋白质分子在其中的移动路径不同导致的不同洗脱顺序来分离不同大小的分子 2 分析磷酸缓冲液的作用 抵制外界的酸和碱对溶液ph的影响 维持ph基本不变 3 掌握蛋白质的分离与提取所用到的方法 离心法和透析法 解析 1 血红蛋白能携带氧气 体现了蛋白质具有运输功能 2 甲装置中 b是血红蛋白溶液 则a是磷酸缓冲液 乙装置中 c溶液的作用是洗脱血红蛋白 3 甲装置用于透析 粗分离 目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 用乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法 是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 4 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每5ml收集一管 连续收集 答案 1 运输 2 磷酸缓冲