矮型鸡于正常型鸡的miRNA表达谱分析.doc

摘 要在现代社会，肥胖问题已经成为全球性的一个公共健康疾病，引起了人们越来越多的关注。脂肪的生长涉及多基因表达、多信号途径及网络式调控，过程极其复杂。microrna（mirna）是一类存在于真核生物体内，大小为1825nt的非编码(non-coding)内源性小分子物质，在多种生物学过程，包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、以及脂肪的生成代谢中发挥重要作用。选用小鼠、大鼠和鸡胚等实验动物来研究脂肪的生成机制，已经为解决肥胖问题提供了一些依据。但是选用矮小型鸡与正常型鸡来作为实验动物对脂肪的生成机制进行研究还未见报道。为了研究这两个品种鸡之间脂肪生成的差别，我们选用7周龄的矮小型鸡和正常型鸡做为实验动物，运用mirna微阵列技术分析腹脂中mirna的表达谱,芯片结果显示：mir-10b，mir-148a，mir-199-3p，let-7k在矮小型鸡中表达上调，正常型鸡表达下调，其中mir-10b达到极显著差异(p0.05)；mir-181a-5p，mir-2188在矮小型中表达下调，正常型鸡表达上调，达到显著差异（p0.01）。分析与脂肪生成相关的差异表达的mirna的功能，能为人类和伴侣动物的肥胖症等能量代谢综合征寻找新的治疗靶标以及调控家畜的脂肪组织发育从而改善肉质提供借鉴和参考。关键词：鸡 mirna 脂肪the analysis of mirna profiles in abdominal fat of dwarf chicken and normal chickenxia liangcollege of science, south china agricultural university， guangzhou 510642，chinaabstract：in modern society, obesity has become a global public healthy problem, more and more people pay attention to it. the signaling pathway of fat growth involved in polygene expression, and network control, the process is extremely complex.micrornas (mirnas) are a class of small non-coding rnas (approximately 1825 nucleotides in length), existing in eukaryotic organisms, are involved in the regulatory network of many biological processes and play an important role in many processes ,including cell proliferation, cell differentiation, apoptosis, and fat metabolism. study the generation mechanism of fat with mice, rats and chicken embryos has provided some basis to solve the problem of obesity. but choose dwarf chicken and normal chicken as experimental animals to study the mechanism of fat formation has not been reported. to investigate the different of fat formation in two types of chicken,we choose 7- week old dwarf chicken and normal chicken as experimental animals. we have adopted mirna microarray technology to analyze the expression profile of mirna in abdominal fat. the results showed that mir-10b,mir-148a,mir-199-3p,let-7k up-regulated in dwarf chickens, down-regulated in normal chickens, and mir-10b up-regulated extremely significant (p0.01)；mir-181a-5p，mir-2188 down-regulated in dwarf chickens and up-regulated significant in normal chickens(p0.05). studying the mirnas expressed differently and analyzing their function can provide reference for solve the problems of obesity in human and company animals.key words：chickens mirna fat 目 录1前言12 材料与方法32.1 实验动物.32.2 主要试剂及仪器32.3 样本的采集32.4 用于microrna 表达谱分析的样品总rna制备32.5 芯片检测43 结果与分析43.1 总rna提取及检测43.2 mirna 检测芯片图53.3 mirna检出率63.4 矮小型鸡与正常型鸡腹脂mirna表达谱73.5 矮小型鸡与正常型鸡腹脂mirna差异表达谱.94 讨论9参 考 文 献11致 谢13131前言在现代社会，肥胖、型糖尿病问题已经成为了一个公共性的健康疾病，越来越多的引起了人们的关注。它们的病理过程涉及脂类代谢和脂肪形成，深入理解脂肪形成的分子机制，对解决这些疾病的防治问题具有重要意义。 一直以来，脂肪组织被认为是带有一些优良特性且能储存能量的惰性组织，例如它可做为绝缘物质以及机械性地支撑更重要的结构。1994年瘦素的发现，预示着人们逐渐意识到脂肪细胞是整个身体能量平衡的必要调节剂。这些细胞分泌一些蛋白，它们的调节过程因体内平衡血压免疫功能血管形成以及能量平衡状态的不同而不同(tong, 2001; farmer, 2006; rosen, 2006)。脂肪细胞来源于多能间充质干细胞。脂肪生成为两个阶段。第一是定型，这是分化特征出现前确定分化方向的过程，多功能间充质干细胞分化成前体脂肪细胞，失去了向其他方向细胞分化的能力，但是在形态学上与先前细胞不能区分开；第二是终端分化，细胞具有了成熟脂肪细胞的特性：脂质的转移和合成，对胰岛素的敏感性以及脂肪细胞特殊蛋白的分泌。microrna(mirna)是一类大小约1825nt的内源性非编码小rna分子，具有高度保守性，其本身不具有开放阅读框(open reading frame, orf)，是一组不编码蛋白质的短序列rna，是一种广泛存在的对基因表达进行调控的分子。mirna广泛存在于真核生物中，其序列和功能在不同物种间非常保守。1993年, lee等（1993）在秀丽新小杆线虫(caenorhabditis elegan)中发现了第一个定时调控胚胎后期发育的基因lin-4。此后,研究者又在线虫c.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7。2001年10月 science报道了研究者从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似c.elegan的lin-4 的小rna基因,称为microrna（mirna）。随后多个研究小组在包括动物、果蝇、植物、病毒等多种生物物种中鉴别出上千个mirnas。从micrornas被发现至今，人们对micrornas研究的热情一直剧增。人们发现micrornas在许多生物过程中都具有调节作用，包括调节发育、细胞增殖、分化，凋亡以及脂肪细胞分化。研究表明，mirna不但调控动物脂肪细胞的分化， 还参与脂类代谢及与脂类代谢相关的激素内分泌调节，有的甚至与肥胖、型糖尿病等脂类代谢病的基本病理相关（poy m n，2007；takanabe r，2008）。esau c等（2006）研究发现mir -122直接调节体内脂类代谢，将mir -122 的反义寡核苷酸投予小鼠可增加肝脏脂肪酸氧化作用，同时降低脂肪酸合成；删除mir -14 导致动物甘油三酯和甘油二酯水平增加（xu p，2003）；这些研究事实表明， 通过mirnas 功能的研究，可以加深对脂肪形成和脂类代谢性疾病的病理生理过程的分子机制了解，并将mirnas 作为这些代谢性疾病治疗的潜在靶点。目前，虽然对mirnas 调节动物脂肪细胞分化和脂类代谢的了解还不多，但mirnas 自身的调节特点及其潜在应用价值，使其必将成为未来几年该领域的研究热点。并且，mirna作为小调控rna,研究其对脂肪细胞分化的调节作用,可以从一个新的角度了解脂肪组织的生长发育机理。本研究以7周龄ghr缺失型矮小型鸡为研究对象，以正常型鸡为参照，采用微阵列基因芯片技术检测矮小型鸡（dw-）和正常型鸡（normal）腹脂中的mirna表达情况，分析mirna的表达谱，找出差异表达的mirna,为进一步筛选出与脂肪生成相关的mirna,并探讨其在脂肪生成过程中的作用机制提供依据。2 材料与方法2.1 实验动物实验动物来自于南海种禽有限公司。2个品种均为隐性白羽洛克鸡。其中一个以隐性白羽洛克鸡为基础，通过导入矮小型基因（dw）并经多个世代的选育，形成了遗传性能稳定的矮小型隐性白羽洛克鸡，简称矮小型鸡（dwarf chicken）；另一个为体型正常的隐性白羽洛克鸡，简称正常型鸡（normal chicken）。2.2 主要试剂及仪器固相rna酶清除剂购于天根有限公司；北京六一电泳仪dyy-cc型；苏州sw-cj-1 cu型双人单面净化工作台；2.3 样本的采集随机抽取按常规饲养方法饲养至7周龄的矮小型鸡和正常型鸡各9只，用经depc水处理过的器械分离出腹脂，分别装入冻存管中，迅速置于液氮（-196）中保存；2.4 用于microrna 表达谱分析的样品总rna制备矮小型鸡与正常型鸡腹脂的总rna的抽提按照常规的trizol提取方法进行。总rna的提取采用invitrogen 公司的trizol reagent 进行。所接触的所有器械都预先用rna酶固相清除剂进行处理。（1）将50100mg组织用液氮研磨成粉末状后，加入1ml trizol reagent 匀浆，室温静置5min，转入1.5ml 离心管中，4 12000g 离心10min,收集上清至新的离心管中；（2）rna的分离：加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀，静置15min至分层明显，4 12000g 离心15min，离心后分成3层，上层为无色水层，中间为白色蛋白层，下层为红色有机层，rna主要在上层无色水相中；（3）rna的沉淀：小心吸取上清新的ep管中，注意不要将中间层和有机层吸入管中，加入同等体积冰上预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置1015min，4 12000g 离心10min；（4）rna的洗涤：去上清，离心后在管侧和管底出现白色胶状沉淀。加入1ml 75%现配的冰上预冷的乙醇，轻轻晃动，4 12000g 离心10min；（一般重复3次）（5）rna的溶解：弃尽上清，用移液器将剩余液体彻底吸掉，注意不要吸到沉淀。室温放置510min，至乙醇完全挥发，即rna沉淀稍稍透明即可，如果过度干燥，会使rna难以溶解。加入适量的depc水，冰上放置35min，帮助rna溶解。（6）rna的保存：提取的rna应立即用于下一步实验或置-80冻存。（7）rna的检测：采用紫外分光光度计和变性琼脂糖凝胶电泳检测总rna的浓度和质量。2.5 芯片检测首先将7周龄的矮小型鸡和正常型鸡的腹脂按序号每3个样品等量混合成1个rna池，每个品种各有3个rna池。7周龄的腹脂rna池，正常型鸡以nf-1、nf-2、nf-3编号，矮小型鸡以df-1、df-2、df-3编号。实验按2个品种进行设计，分别包含3个生物学重复。rna样品采用polya聚合酶扩展3末端形成polya尾，把一个寡核苷酸标记连接到polya尾上用于荧光染色。采用特定标记的cy5染料进行荧光染色。通过微循环泵在芯片上进行杂交，过夜。杂交体系采用100l 6sspe的缓冲系统（0.90m nacl，60mm na2hpo4,6mm edta, ph6.8）,含25%甲酰胺，34。杂交后用激光扫描仪（genepix 4000b）收集杂交信号的图像，并使用array-pro 图像分析软件进行数字化处理。扣除背景值，采用lowess（locally-weighted regression）方法对芯片数据进行归一化处理（normalization）（bolstad等，2003）。采用专业软件分析数据，计算出两组检测信号的比率、p值和t值。mirna表达谱检测由联川生物公司（lc sciences）完成。芯片探针依据mirbase 19.0版（http:/www.sanger.ac.uk/software/rfam/mirna/）列出的mirna进行设计。实验所采用的mirna检测芯片共包含789个探针。3 结果与分析3.1 总rna提取及检测腹脂总rna提取后，各取rna样品1l进行变性琼脂糖凝胶电泳，约15min后于紫外检测仪上进行观察并拍照。如图1-1，图1-2所示，rna样品的28s、18s条带清晰，上样孔中无残留。应用分光光度计进一步测定rna样品的纯度，结果显示a260与a280比值均在1.9以上，表明rna样品质量完全符合芯片分析要求（表1-1）。图1-1 正常型鸡腹脂总rna检测结果fig.1-1 the detection results of total rna in normal chicken图1-2 矮小型鸡腹脂总rna检测结果fig.1-1 the detection results of total rna in dwarf chicken表1-1 正常型鸡与矮小型鸡总rna检测结果table 1-1 the detection results of total rna样品编号a260/280a260/230浓度（g/l）总量（g）样品质量描述sample no.concentrationtotal quantitydescription of qualitynf-11.972.090.5704.43rna完好nf-21.912.070.3404.14rna完好nf-31.922.040.3504.16rna完好df-11.962.020.3204.05rna完好df-21.932.020.2304.55rna完好df-31.951.940.2403.85rna完好3.2 mirna 检测芯片图对矮小型鸡和正常型鸡7周龄的腹脂mirna表达谱进行芯片分析。部分mirna检测芯片图见图1-2。 图1-2 mirna检测芯片图fig.1-2 the detection results of mirna chip3.3 mirna检出率本实验所采用的mirna检测芯片共包含789个探针。矮小型鸡和正常型鸡7周龄腹脂中mirna的检出率见表1-2。表1-2 矮小型鸡和正常型鸡腹脂中mirna检出率 table 1-2 mirna detection rates in abdominal fat of dwarf and normal chickens组织类型histological types品种variety检出率 detection rate探针数probessignal3232signal512signal5127周龄腹脂矮小型鸡564（71.5%）151（19.1%）74(9.4%)789正常型鸡554（70.2%）144（18.3%）91(11.5%)789从检测结果来看，以检出信号值32为标准，7周龄腹脂中，矮小型鸡检测出mirna共225个，检出率为28.5%；正常型鸡检测出mirna共235个，检出率为29.8%。3.4 矮小型鸡与正常型鸡腹脂mirna表达谱图1-3 矮小型鸡和正常型鸡7周龄腹脂mirna表达谱（signal2000）fig.1-3 mirna expression profiles of abdominal fat of 7-week-old dwarf and normal chickens(signal2000) 3.5 矮小型鸡与正常型鸡腹脂mirna差异表达谱图1-3 矮小型鸡和正常型鸡7周龄腹脂mirna表达谱（512signal2000）fig.1-3 mirna expression profiles of abdominal fat of 7-week-old dwarf and normal chickens(512signal2000） 通过比较我们发现，矮小型鸡和正常型鸡腹脂mirna表达谱非常接近，只有少数mirna在不同品种之间存在显著差异，表现出物种内的保守性（表1-3）。其中mir-10b，mir-148a，mir-199-3p，let-7k在矮小型鸡中表达上调，正常型鸡表达下调，其中mir-10b达到极显著差异(p0.05)；mir-181a-5p，mir-2188在矮小型中表达下调，正常型鸡表达上调，达到显著差异（p0.01）。表1-3 矮小型鸡与正常型鸡腹脂mirna差异表达谱table 1-3 differential mirna expression profiles of abdominal fats in dwarf and normal chickens组织类型histological typesmirna矮小型鸡dwarf chicken正常型鸡normal chickenfold changesp-value腹脂mir-10b47959181281.963.50e-03mir-181a-5p218026031513120.282.62e-02mir-148a258435715742730.503.01e-02mir-199-3p461569532742980.244.43e-02mir-21883871227431500.884.66e-02let-7k656124334780.943.36e-02注：fold change 指正常型鸡与矮小型鸡腹脂中mirna表达量的比值。4 讨论 近年来，肥胖、ii型糖尿病等已成为严重危害人类健康的代谢性疾病，它们的病理过程涉及脂类代谢和脂肪形成，因此深入了解脂肪形成的分子机制，对解决这些疾病的防治具有重要意义。microrna是一类存在于真核生物体内，大小为1825nt的非编码内源性的小分子物质。广泛存在于病毒、动物和植物等许多生物的基因组中，其编码基因大多与已知的蛋白编码或非编码基因重叠，且多以基因簇形式位于小于310 kb的间隔区内，与其宿主基因的mrna一起表达。mirna在不同物种、不同组织中具有高度保守性，具有时间性、空间性和组织特异性，如mirna-1、mirna-206等与心脏和骨骼肌特异性mirna(mccarthy j j et al ，2007；sokol n s et al，2005)，mirna-143为脂肪特异性mirna（trakooljul n et al，2010）， mirna-375在胰脏特异性表达（kloosterman w p et al，2007）自1993年lee等在秀丽新小杆线虫（c.elegans）中意外发现一种定时调控胚胎后期发育的首个mirna-lin4以来，越来越多的mirna被发现。目前，基于计算机基础的生物信息学预测估计，mirna约占整个基因组基因的2%3%，调控约1/3的mrna，mirna的这一作用使之成为生命科学界现研究的热点。microrna是在转录后水平调控基因的表达，主要作为基因表达的负调控因子，主要采用降解靶mrna和抑制靶mrna的翻译两种作用方式调控基因的表达。近年来的研究发现，mirna在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动过程中发挥重要的调控作用。例如在肿瘤发生机制方面，mirna可能是潜在的癌基因或者抑癌基因，并且由于mirna是作为基因表达和蛋白质翻译过程中的调节分子，在肿瘤的发生过程中起到一个调控的枢纽作用，已经有专家预测，把mirna作为肿瘤生物治疗的靶分子将比编码基因作为靶分子更加有效（chen c z et al，2005）。并且，目前实验数据证实mirna与多种人类疾病有关，包括多种癌症，艾滋病，冠心病等，因此mirna已成为相关疾病治疗的新的靶位点（trovatom et al，2004）。而且mirna将成为疾病诊断、预防和治疗的重要工具 (firea, xu set al，1998)。目前，已有很多种方法用于研究检测mirna的表达，但原理上分为两类:一种是探针杂交方法，包括northern blot，microrna芯片，基于微球杂交的检测方法，锁定核苷酸的原位杂交（lna-ish）等；另一种是扩增技术的检测方法，为基于pcr的检测方法。其中，microrna芯片技术采用大规模微阵列技术，在一片芯片上同时固定多个与mirna序列互补的探针，然后加入经过标记的样本rna，杂交后进行信号检测，可以一次性对大量的生物分子进行检测分析，大大提高了筛选的速度和通量，是目前检测整个基因组内mirna表达及调控水平变化最有效的方法。因此，通过基因芯片技术检测7周龄的矮小型鸡与正常型鸡肝脏和腹脂中差异表达的mirna, 可能会为肥胖症的生物治疗提供依据。microrna的发现丰富了人们对蛋白质表达调控的认识，有助于在rna水平对靶mrna分子进行更迅速和有效的调节。 参 考 文 献chen c z. micrornas as oncogenes and tumor suppressors. n engl j med, 2005, 353 (17): 1768 1771esau c,davis s, murray s f,et al . mir -122 re gulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting j . cell met ab,2006,3(2) : 87 -98farmer sr. transcriptional control of adipocyte formation j. cell metab, 2006, 4(4): 263-273.firea, xu s, montgomery m k, et al.potent and specific genetic interference by double-stranded rna in caenorhabditis elegansj.natrue,1998; 391(6669): 744-5)lee rc, feinbaumrl, ambros v. the c. elegans heterochronic genelin24encodes small rnaswithantisensecomplementaritytolin214j. cell ,1993, 75(5) :8432854mccarthy j j,esser k a,andrade f h. microrna-206 is overexpressed in the diaphragm but not the hindlimb muscle of mdx mousej. am j physiol cell physiol ,2007,293（1）：c451-457poy m n,spranger m,stoffel m. micrornas and the regulation of glucose and lipid metabolism j . diabetes obes metab,2007,9( 2) : 67 - 73rosen ed, macdougald oa. adipocyte differentiation from the inside outj. nat rev mol cell biol, 2006, 7(12): 885-896.sokol n s, ambros v. mesoderma