（环境工程专业论文）偶氮还原酶azr的结构模型与功能研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 近年来偶氮染料的生物降解受到广泛关注，国内外学者陆续分离并考察了众多可脱 色偶氮染料的微生物，纯化并研究了多种具有偶氮还原酶活性的蛋白质，但对于偶氮还 原酶的结构与功能缺乏深入认识。本论文对细菌脱色偶氮染料的能力，细菌f m n 依赖 型偶氮还原酶的结构模型与功能等展开研究。 考察沼泽红假单胞菌r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 细胞及其细胞提取物脱 色偶氮染料的能力。对于生长过程中的足p a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 ，在静置缺氧条件下，可在 1 7h 内脱色8 0 以上活性艳红x 3 b ( 5 0m gl 。1 ) 。细菌在3 0 3 5o c 和p h6 - 9 具有较高 脱色能力。脱色速率与染料初始浓度间可用米门方程描述，和分别为6 5m gg c e l l jh 以和9 7 8m gl 。其细胞提取物具有偶氮还原酶活性，脱色速率远高于未破碎的细 菌细胞。对比考察两株光合细菌r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a s l 1 7 3 7 ，r p a l u s t r i sa s l 2 3 5 2 和基因工程菌e s c h e r i c h i ac o l iy b 静止期早期细胞脱色含磺酸取代基的偶氮染料的能 力。光合细菌表现出较基因工程菌更强的脱色能力。r s p h a e r o i d e s a s l 1 7 3 7 ，r p a l u s t r i s a s l 2 3 5 2 和ec o l iy b 的值分别为0 2 ，0 1 5 和o 0 6lgc e l l dh 一。两株光合细菌 具有较好的脱色混合染料的能力，ec o l iy b 脱色混合染料的效果不佳。 利用同源建模方法建立了r s p h a e r o i d e sa s l 1 7 3 7 的偶氮还原酶a z r 的结构模型。 a z r 的单体具有类似黄素氧化还原蛋白的甜d 型结构，五个相互平行的p 折叠位于分子 中央形成一个平面，五个a 螺旋分别位于平面两侧，一侧两个，另一侧三个；分子中结 合的f m n 辅基可能作为氧化还原反应中电子传递的中介。尽管依序列可将f m n 依赖 型偶氮还原酶归为两个家族，但它们的单体都具有类似黄素氧化还原蛋白的三级结构。 利用n a d ( p ) h 提供电子，a z r 可还原多种硝基化合物。以硝基呋喃为底物，a z r 硝基还原酶的最适p h = 7 ，最适温度为5 0o c 。n a d p h 为更适合的辅酶，反应遵循双底 物乒乓动力学机理。比较a z r 对2 ，4 ，6 三硝基甲苯( t n t ) 、2 ，4 二硝基甲苯( 2 ，4 d n t ) 、 2 ，6 二硝基甲苯( 2 , 6 d n t ) 等几种多硝基取代甲苯的还原发现，n 汀为最适底物； 2 ，4 d n t 比2 。6 d n t 更适合降解。经h p l c m s 检测，t n t 的还原产物可能为羟胺二硝 基甲苯。a z r 能遵循双底物乒乓动力学机理还原外加f m n 。n a d p h 和f m n 的米氏常 数分别为o 5 和1 4 2m m ，为1 7 2 41 t m o lm gp r o t e i n 。1m i n 一；外加f m n 抑制a z r 的 偶氮还原酶和硝基还原酶活性，是n a d p h 、甲基红和硝基呋喃的竞争性抑制剂，抑制 常数肠分别为1 7 、2 3 和6 4 m 。a z r 具有广泛的底物范围，不但可以还原偶氮化合 物、硝基化合物和f m n 等有机物，还可以还原铁氰化钾和重铬酸钾等无机底物，是一 种新的硝基f m n 还原酶家族的成员。 偶氮还原酶a z r 的结构与功能研究 在序列对齐分析和结构模型分析的基础上，选择a z r 分子中f m n 辅基附近两个环 状结构中的t y r 7 4 、h i s 7 5 和l y s l 0 9 等氨基酸位点，利用多次p c r 的方法进行了k 1 0 9 a ， k 1 0 9 h ，y 7 4 w 和h 7 5 n 等定点突变研究。利用ec o l i 异源表达并纯化几种突变型a z r 。 对比考察野生型与突变型a z r 的活性。以酸性红b 为底物，野生型a z r 的最适p h 为 7 8 ，k 1 0 9 h 和h 7 5 n 的最适p h = 6 ，而k 1 0 9 a 和y 7 4 w 的最适p h = 9 。突变的引入可能 改变了a z r 分子表面的电荷情况，从而改变了其最适p h 。与野生型a z r 相比，几种 突变型a z r 的酶活都出现下降，表明y 7 4 、h 7 5 和k 啪对酶活有重要影响。分析底物结 合常数表明，y 7 4 w 和h 7 5 n 突变对n a d p h 的结合无影响，而只影响a z r 对甲基红 和硝基呋喃的结合：h 7 5 n 突变后a z r 完全丧失硝基还原酶活性。第1 0 9 位氨基酸荷正 电对甲基红的结合有重要影响，而对硝基呋喃的结合无影响；k 1 0 9 h 对n a d p h 的结合 并非保守突变，其结合不仅需要该处荷正电，可能还与空间结构有关。k 删可能只参与 对n a d p h 的2 磷酸基团的结合，而对n a d h 的结合无影响。 自然界中天然存在的偶氮类和硝基类芳香化合物并不常见，因此还原酶a z r 可能 具有其他功能。醌类化合物广泛存在于自然界和各种生物体的代谢过程中。a z r 与来自 不同域的醌还原酶的氨基酸序列中都较为保守地存在一段4 0 5 0 个氨基酸构成的参与结 合底物与辅酶的序列。a z r 与醌还原酶n q 0 1 的单体具有类似的“p 型结构( r m s d = 9 5 a ， 4 6 7a t o m s ) 和黄素辅基结合方式。a z r 具有醌还原酶活性，遵循乒乓机理，可还原甲 萘醌、2 羟基1 ，4 萘醌( l q ) 、葸醌2 磺酸和葸醌2 ，6 二磺酸等萘醌和葸醌化合物，甲 萘醌为最适底物，而对1 ，4 苯醌无活性。与偶氮和硝基化合物相比，醌类化合物为a z r 更适合的底物。双香豆素抑制a z r 的醌还原酶活性，为n a d p h 的竞争性抑制剂，抑 制常数( , - - 8 7 6 a m 。胞内过量表达的醌还原酶a z r 提高了ec o l iy b 对氧化应激的耐 受。在h 2 0 2 、甲萘醌、百草枯等应激源存在条件下和经热休克处理后，ec o l iy b 的存 活率都高于对照株ec o l ij m l 0 9 。氧化还原介体l q 的加入可提升ec o l ij m l 0 9 和ec o l i y b 培养物脱色偶氮染料的能力。ec o i ly b 的介导脱色能力较ec o l ij m l 0 9 更为突出； 在o 2m ml q 存在下，ec o l iy b2h 内可脱色7 5 的苋菜红( 1m m ) ，为目前已报道的 最佳的细菌脱色表现，体现了基因工程菌降解能力的优势，为胞内异源表达的还原酶的 应用提供了新的思路。 本研究深化了对f m n 依赖型偶氮还原酶的结构与功能的认识，为a z r 等还原酶的 应用奠定基础。 关键词：偶氮染料；还原酶；同源建模；定点突变；氧化应激 大连理工大学博士学位论文 s t r u c t u r em o d e la n df u n c t i o no f a z o r e d u c t a s ea z r a b s t r a c t b i o d e g r a d a t i o no fa z od y e sh a sa t t r a c t e da1 0 to fa t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s m a n y a z o d y e d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m sw e r ei s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e d i na d d i t i o n ，s e v e r a l e 衢c i e n ta z o r e d u c t a s e sw e r eo b t a i n e da n ds t u d i e d h o w e v e r , i n - d e p t hu n d e r s t a n d i n go ft h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o no fa z o r e d u c t a s ei sl i m i t e d b a c t e r i a ld e c o l o r i z a t i o no fa z od y e sa n dt h e s t r u c t u r em o d e la n df u n c t i o no ff m n d e p e n d e n ta z o r e d u c t a s ea r es t u d i e di nt h i sd i s s e r t a t i o n d e c o l o r i z a t i o no fa z od y e sb yr h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sa s1 2 3 5 2a n di t s e e l l e x t r a c t sw e r ei n v e s t i g a t e d u n d e ra n o x i cc o n d i t i o n s ，t h eg r o w i n gs t r a i nc o u l dd e c o l o r i z eo v e r 8 0 o f5 0m gl r e a c t i v eb r i l l i a n tr e dx 3 b ( r b rx 3 b ) i n17h t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e a n dp hw e r ea r o u n d3 0 3 5o ca n dp h6 9 ，r e s p e c t i v e l y t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e ns p e c i f i c d e c o l o r i z a t i o nr a t ea n dd y ec o n c e n t r a t i o nc o u l db ed e s c r i b e db ym i c h a e l i s - m e n t e nk i n e t i c s 1 1 1 ek i n e t i cc o n s t a n t se s t i m a t e dw e r e6 5m ggc e l l _ h - 1f o ri m 觚a n d9 7 8m gl qf o r a z o r e d u c t a s ea c t i v i t yw a sf o u n di ni t sc e l le x t r a c t s w h i c hd e m o n s t r a t e dm o r ee f f e c t i v e d e c o l o r i z a t i o np e r f o r m a n c et h a nw h o l ec e l l s d e c o l o r i z a t i o no fs u l f o n a t e da z od y e sw a s i n v e s t i g a t e d w i t h e a r l y - s t a t i o n a r y - p h a s e c e l l so ft w op h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ( p s b ， r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e sa s1 17 3 7 a n dr p a l u s t r i sa s1 2 3 5 2 ) a n dag e n e e n g i n e e r e ds t r a i n ( e s c h e r i c h i ac o l iy b l t h et w op s b s t r a i n sd e m o n s t r a t e dh i g h e rd e c o l o r i z a t i o na b i l i t i e st h a n t h er e c o m b i n a n to n e v a l u e so f 毅如1w e r e0 2 ，0 15a n d0 0 6lgc e l l qh 1 f o rr s p h a e r o i d e sa s 1 17 3 7 r p a l u s t r i sa s1 2 3 5 2a n dec o l iy b ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 et w op s b s t r a i n ss h o w e dh i g h e rd e c o l o r i z a t i o na b i l i t i e sf o rm i x e da z od y e st h a nec o l fy b s t r u c t u r em o d e lo f a z o r e d u c t a s ea z ro f r s p h a e r o i d e sa s l 1 7 3 7w a sc o n s t r u c t e du s i n g h o m o l o g ym o d e l i n gm e t h o d a z rm o n o m e rd e m o n s t r a t e saf l a v o d o x i n - l i k eg l o b u l a ra 1 3 s t r u c t u r ew i t ht h ec e n t r a l f i v e s t r a n d e dp a r a l l e ld s h e e tf l a n k e db yf i v e0 【h e l i c e s a nf m n p r o s t h e t i cg r o u pw h i c hl i e so nt o po ft h em o l e c u l em a ya c ta sr e d o xa n dr e a c t i v ec e n t e r s a l t h o u g hf m n d e p e n d e n ta z o r e d u c t a s e sc a nb ec l a s s i f i e di n t ot w og o u p sa c c o r d i n gt oa m i n o a c i ds e q u e n c e ，t h e i rm o n o m e r sd e m o n s t r a t e ds i m i l a rf l a v o d o x i n l i k e3 ds t r u c t u r e s m a n yn i t r o a r o m a t i c sc o u l db er e d u c e db va z ru s i n gn a d p h a se l e c t r o nd o n o r t h e o p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hf o ri t sn i t r o r e d u c t a s ea c t i v i t yw a s5 0o ca n dp h7 ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dw i t hn a d h ，n a d p hw a sab e t t e r e l e c t r o nd o n o r t h er e a c t i o nt o l l l o w e d p i n g p o n gb ib ik i n e t i cm e c h a n i s m i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a t ，a m o n g2 ，4 ，6 - t 五n i t r o t o l u e n e ( t n t ) ，2 ，4 d i n i t r o t o l u e n e ( 2 ，4 一d n t ) a n d2 , 6 - d i n i t r o t o l u e n e ( 2 ，6 - d n t ) ，t n tw a st h eb e s t s u b s t r a t ea n d2 ，4 d n tw a sab e t t e rs u b s t r a t et h a n2 ，6 一d n t h y d r o x y l a m i n o d i n i t r o t o l u e n e 偶氮还原酶a z r 的结构与功能研究 w a sd e t e c t e dw i t l lh p l c m sa sr e d u c t i o np r o d u c t so ft n t a z rc o u l da l s or e d u c ef 【l 、i f o l l o w i n gp i n g - p o n gb ib ik i n e t i cm e c h a n i s m 尺卅v a l u e sf o rn a d p ha n df 烈w e r e0 5a n d 14 2m m ，r e s p e c t i v e l y 缸w a sc a l c u l a t e dt ob e17 2 4l a m o lm gp r o t e i n 。1m i n e x t e r n a l l y a d d e df m nw a sac o m p e t i t i v ei n h i b i t o ro fn a d p h m e t h y lr e da n dn i t r o f u r a z o n e t h e i n h i b i t i o nc o n s t a n t sf o rn a d p h ，m e t h y lr e da n dn i t r o f u r a z o n ew e r e1 7 ，2 3a n d6 4l a m ， r e s p e c t i v e l y a z rh a saw i d er a n g eo fs u b s t r a t e s ，i n c l u d i n ga z oa n dn i t r oc o m p o u n d s ，f m n a n dm e t a li o n s i ti sam e m b e ro fan e wn i t r o f m nr e d u c t a s ef a m i l y o nt h eb a s i so fm o d e la n a l y s i sa n dm u l t i p l es e q u e n c ea l i g n m e n t ，s e v e r a la m i n oa c i d r e s i d u e s ( t y r 7 4 、h i s 7 5a n dl y s l 0 9 ) i nt h et w ol o o p sa r o u n df m nw e r ec h o s e na sm u t a t i o n t a r g e t s s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i si n c l u d i n gk l0 9 a ，k 10 9 h ，y 7 4 wa n dh 7 5 nw e r e p e r f o r m e dw i t l lm u l t i p l es t e p so fp c r w i l d - 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p h o s p h a t eg r o u p o f n a d p ha n dh a v en oe f f e c to nt h eb i n d i n go f n a d h t h e r ea r ev e r yf e wn a t u r a la z oa n dn i t r oa r o m a t i c s t h u sa z r m a yh a v es o m eo t h e r f u n c t i o n sr a t h e rt h a na z o o rn i t r o r e d u c t a s e q u i n o n ec o m p o u n d sa r ew i d l yf o u n di nn a t u r a l e n v i r o n m e n t sa n dm e t a b o l i s mp r o c e s s e so fm a n yd i f f e r e n tl i v e s as h o r tp a r t i a ls e q u e n c e ( 4 0 - 5 0a m i n oa c i dr e s i d u e s ) i n v o l v e di nt h eb i n d i n go fs u b s t r a t ea n dc o e n z y m ew a sf o u n d c o n s e r v e da m o n ga z ra n ds e v e r a lo t h e rq u i n o n er e d u c t a s e sf r o md i f f e r e n td o m a i n s s i m i l a r “dm o n o m e rs t r u c t u r e sa n dw a y so ff l a v i nc o f a c t o r sb i n d i n gw e r ef o u n db e t w e e na z ra n d q u i n o n er e d u c t a s en q 0 1 i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a ta z ri sat w o e l e c t r o nq u i n o n er e d u c t a s e f o l l o w i n gt h ep i n g p o n gb i b i k i n e t i c s i tc o u l dr e d u c e2 - m e t h y l 1 ，4 一n a p h t h o q u i n o n e ( m e n a d i o n e ) ，2 - h y d r o x y - 1 ，4 - n a p h t h o q u i n o n e ( 1 a w s o n e ，l q ) ，a n t h r a q u i n o n e 一2 一s u l f o n a t ea n d a n t h r a q u i n o n e 一2 ，6 - d i s u l f o n a t e m e n a d i o n ew a st h e b e s ts u b s t r a t e a m o n gq u i n o n e s i n v e s t i g a t e d n oa c t i v i t yw a sd e t e c t e dw i t h1 ，4 b e n z o q u i n o n e c o m p a r e dt oa z oa n dn i t r o c o m p o u n d s ，q u i n o n e sa r eb e t t e rs u b s t r a t eo fa z r t h eq u i n o n er e d u c t a s ea c t i v i t yo fa z rw a s i v 大连理工大学博士学位论文 i n h i b i t e db yd i c o u m a r 0 1 w h i c hw a sac o m p e t i t i v ei n h i b i t o ro fn a d p hw i t hako f8 7 6l a m 1 1 1 eo v e r e x p r e s s e dc e l l u l a rq u i n o n er e d u c t a s ea z rs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h er e s i s t a n c eo fe c o l iy bt oo x i d a t i v es t r e s s w h e nt r e a t e dw i t l ls t r e s s o r ss u c ha sh e 0 2 ，m e n a d i o n e ，p a r a q u a t a n dh e a ts h o c k t h es u r v i v a lr a t e so fec o l iy bw e r eh i g h e rt h a nt h o s eo ft h ec o n t r 0 1s t r a i ne c o l ij m10 9 1 1 1 ea d d i t i o no fr e d o xm e d i a t o rl qs i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dt h ed e c o l o r i z a t i o n p e r f o r m a n c e so fec o l ij m10 9a n dec o l iy b t h er e c o m b i n a n ts t r a i np o s s e s s e db e t t e r m e d i a t e dd e c o l o r i z a t i o na b i l i t yt h a nt h ec o n t r o lo n e i nt h ep r e s e n c eo f0 2m ml q ec o l i y br e m o v e d7 5 a m a r a n t h ( 1m m ) i n2h ，w h i c hi st h eb e s tb a c t e r i a ld e c o l o r i z a t i o n p e r f o r m a n c ee v e rr e p o r t e d t i l i sd e m o n s t r a t e dt h ea d v a n t a g eo fg e n e e n g i n e e r e ds t r a i na n d p r o v i d e d an e ws t r a t e g yf o rt h ea p p l i c a t i o no fh e t e r o g e n e o u s l ye x p r e s s e di n t r a c e l l u l a r r e d u c t a s e n l e s t u d yp r o v i d e s a d e e p e ru n d e r s t a n d i n g o ft h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f f m n d e p e n d e n ta z o r e d u c t a s e i tl a y st h ef o u n d a t i o nf o rt h ea p p l i c a t i o no fa z ra n do t h e r r e d u c t a s e s k e yw o r d s ：a z od y e ；r e d u c t a s e ；h o m o l o g ym o d e l i n g ；s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ；o x i m i v e s t r e s s v 一 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：五墅垂垂磕煎垒坐鱼量 邈煎丝壹兰丝丕五星 作者签名： 叠牛之鳖 日期： 丝皇；年卫月皇- _ 日 偶氮还原酶a z r 的结构与功能研究 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目： 互臣玺重匾毖垒堡垒( 地避曼丝塑五望 e l 期： 丑近年旦月2 一日 日期：4 年阜月上日 大连理工大学博士学位论文 1偶氮染料的微生物脱色及相关还原酶的研究进展 工业革命以来，人类大量开发自然资源，科技的进步给人类社会带来巨大发展的同 时也伴随着环境污染。天然物质极易被自然界中的微生物分解，对环境的冲击较小。但 人类利用现代科技所合成的大量自然界中本不存在的异生物质( 如偶氮化合物和多硝基 芳香化合物等) ，由于其本身的结构复杂性和生物陌生性，短时间内难于降解，使得环 境污染问题愈演愈烈。相对于传统的物理和化学方法，微生物具有巨大的处理污染物的 潜力。利用基因工程和蛋白质工程等现代生物技术深化对降解污染物的微生物和相关功 能酶的认识已成为重要的课题。近年来，利用微生物处理含偶氮染料废水以及细菌胞内 偶氮还原酶的作用受到越来越多的关注。 1 1染料的分类、结构与发色机理 1 1 1 染料的分类 凡是能赋予色彩性质的物质，一般称为色素( c o l o r i n gm a t t e r ) ，可分为有机色素和 无机色素。一般地，对于纤维具有永久染着性，且耐光照、水、皂洗的有机色素，称为 染料( d y e s t u f f ) 。由于染料能够强烈地选择吸收可见光某一部分的波长，因而显现出所 吸收光线的补色。 人类历史之初便伴随着染料应用。无机颜料如烟灰、锰氧化物、赤铁矿和赭石等可 见于旧石器时代的岩画。有机天然颜料，特别是纺织品染料也有着漫长的应用历史。这 些染料都是芳香化合物，通常来自于植物( 如洋西的茜素和靛蓝的靛青) 、昆虫( 如胭 脂虫的胭脂) 、真菌和地衣等。直到1 9 世纪中叶之前，所有应用的颜料都是天然来源的。 1 8 5 6 年，英国化学家p e r k i n 在试图合成奎宁的时候却获得了一种具有很好的染色性质的 蓝色物质，即第一种合成染料苯胺紫。随后，染料的合成日益增长，2 0 世纪初，合成染 料已经基本取代了天然染料i l 捌。 基于化学结构或发色基团的性质，可将染料分为2 0 3 0 个不同种类。偶氮( 单偶氮、 双偶氮、三偶氮、多偶氮) 、葸醌、酞菁和三芳基甲烷染料在数量上是最重要的种类。 其他种类有二芳基甲烷、靛蓝、吖嗪、嗯嗪、噻嗪、咕吨、硝基、亚硝基、次甲基、噻 唑、吲达胺、靛酚、内酯、氨基酮和羟基酮染料以及未定结构染料( 杂芪和硫染料) 等 【3 】 o 基于染料的应用方法，可将其分为直接染料、还原染料、硫化染料、酸性染料、活 性染料、纳夫妥染料( 冰染染料) 、氧化染料、分散染料和阳离子染料等【3 j 。 1 9 2 4 年起，英国染色家协会与美国纺织化学家和染色家协会根据颜色、结构和应用 偶氮还原酶a z r 的结构与功能研究 方法对商业染料编订了染料颜色索引( c o l o ri n d e x ，c i ) 。根据其应用性质和颜色，给 予每一种染料一个属名。染料颜色索引作了1 5 种不同分类：酸性染料、活性染料、金属 复合染料、直接染料、碱性染料、媒介染料、分散染料、颜料染料、还原染料、阴离子 染料和显色染料、硫染料、溶剂染料、荧光增白剂、食品染料和天然染料等【3 1 。 一般地，为了判断脱色机制可能作用的基团，分离筛选染料脱色微生物时往往选用 基于化学结构分类的染料；而为了取得与实际生产更接近的效果，测定微生物脱色染料 的能力时常基于染料的应用分类来选择。 1 1 2 染料的结构与发色机理 一般地，染料的分子构成都含有一种或多种煤焦油蒸馏化合物，主要包括苯( c 6 1 4 6 ) 、 甲苯( c 6 h s c h 3 ) 、萘( c l o h 3 0 ) 、葸( c 1 4 h l o ) 、苯酚( c 6 h 5 0 h ) 、甲酚( c 7 h 7 0 h ) 、吖 啶( c 1 3 h 9 n ) 和喹啉( c 9 h 7 n ) 等。这些化合物有别于实际的染料，它们必须先转化为 中间体化合物。染料中间体为分子中一个氢被- n 0 2 、- n h e 、一o h 、一s 0 3 h 等取代的碳氢 化合物，如硝基苯( c 6 h 5 n 0 2 ) 、苯胺( c 6 h 5 n h 2 ) 、d 萘酚( c l o h t o h ) 和1 3 一萘磺酸 ( c l o h 7 s 0 3 h ) 等。 所有的芳香化合物都能吸收电磁能，但只有那些吸收可见光范围内( - 3 5 0 7 0 0n m ) 的光线的才具有颜色。染料包含发色基团( 具共轭双键的离域电子体系) 和助色基团( 吸 电子或给电子取代基通过改变电子体系的整体能量而引起或加强发色基团的颜色) 。常 见的发色基团有c = c 、c = n 、c = o 、- n = n 、- n 0 2 和醌环等；常见的助色基团有- n h 2 、 c o o h 、s 0 3 h 和o h 等。 染料的结构与生色机理对判断微生物染料脱色具有重要的理论分析意义。现代理论 认为，染料的颜色与其结构有密切的关系，结构对颜色的影响有： ( 1 ) 在共轭双键体系中，共轭双键增长，7 r 电子活动性增高，激化能随之减少，吸收的 光线波长愈长，产生不同的深色反应。 ( 2 ) 共轭体系两端若存在极性基团，颜色加深。 ( 3 ) 分子离子化后，如果给电子基的给电子性或吸电子基的吸电子性加强，兀电子活动 性增大，分子的激化能降低，分子颜色加深。反之，则变浅。 ( 4 ) 在共轭双键体系中，只有原子和原子团在同一个平面时才具有最大的共轭效应。7 c 电子的活动性与分子的共平面性有关，如果分子的共平面性遭到破坏，共轭双键体 系也会被破坏，冗电子的活动性降低，颜色变浅。 ( 5 ) 染料共轭系统中的原子或原子团与金属原子形成配位键时，电子云分布状态发生重 大变化，从而影响共轭体系的流动性，引起颜色变化。 大连理工大学博士学位论文 1 2 偶氮染料的生产应用、危害及各国政策 1 2 1 偶氮染料的生产与应用 偶氮染料是分子中具有一个或多个偶氮基( - n = n ) 的芳香类化合物，其偶氮基常 与一个或多个芳香环系统相连构成一个共轭体系扩大未定域尢电子系统，吸收可见光线， 即作为染料的发色基团。由于其生产方法较简单，颜色范围广( 红、橙、黄、兰、紫、 黑等) ，色光良好，并具有一定的牢度，因而成为商业应用最多的合成染料【4 】。据统计， 1 9 9 4 年全世界染料产量为1 0 0 万吨，其中5 0 以上为偶氮染料【5 ，6 1 。这些染料广泛应用 于纺织印染、食品、化妆品、纸张印刷等许多行业中，其中纺织行业用量最大。 1 2 2 偶氮染料的危害 并非所有染料都能吸附在织物上，不同类型的染料损失情况差异很大( 碱性染料为 2 ，而活性染料高达5 0 ) ，这些残留在废水中的染料对印染厂附近的地表水和地下水 造成了严重污染【7 一。许多染料即使在水中浓度低至1m gl 。1 也是可见的，纺织行业废 水的色度很大，通常其中染料浓度为1 0 2 0 0m gl 1 【8 】。含偶氮染料的废水排放到地表水 中还带来了视觉美观问题，影响水体中光的透过性和氧气的传输，危害水生生物的生长。 在设计染料分子的时候往往考虑使其具有良好的化学和光学稳定性，因此染料一旦进入 自然环境中便容易造成持久的污染。染料进入环境中可能会带来生态毒性危害，生物积 累作用通过食物链最终可能影响到人类。有报道指出，纺织等染料相关行业废水通常较 其他行业废水具有更高的致畸性【9 】，被纺织废水污染的地表水和地下水中的致畸性由偶 氮染料造成i lu ，1 1 j 。 近年来有许多关于染料毒性评价的研究工作。这些毒性( 如致死性、致突变性、致 癌性、遗传毒性等) 研究的对象很广，从水生生物( 鱼、藻类等) 到哺乳动物都有开展。 染料的急性毒性通常较低。对多种商业染料的考察表明，当染料浓度在lm gl 1 以下时 藻类生长( 光合作用)