（食品科学专业论文）猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究.pdf

y f 删舢1 俐7 删3 胂9 删2 f f i j 5 册棚2 胂 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：美亏_ 彬 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：导师签 沙，护年多月日 猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究 摘要 本文以猪骨为原料，将其制成骨粉，然后进行酶解并对其酶解产物进行抗氧化分析， 同时对酶解液中氨基酸含量进行分析。 分别采用高温高压蒸煮和化学试剂脱脂脱钙等方法进行处理制成骨粉，经试验证明 最佳工艺为：高温高压( 1 2 1 ，l k p a ) 蒸煮2 d 时，趁热脱去脂肪，经水洗、烘干、粉碎 制得骨粉，蛋白质含量为2 4 9 。 单酶水解实验。采用中性、碱性、风味、复合蛋白酶以及木瓜蛋白酶五种酶分别对 猪骨蛋白进行酶解，以温度、p h 值、加酶量、料液比以及酶解时间为单因素，确定各单 酶水解的最佳酶解条件，其中碱性蛋白酶水解度最高，最大水解度为2 3 0 2 。 响应面优化实验。在单酶水解的基础上选取碱性蛋白酶为最佳用酶，以单因素实验 为基础，选取温度、加酶量、底物浓度以及酶解时间作为4 个因素进行响应面的优化实 验，利用d e s i g ne x p e r t 软件获得了水解度最高时的各个因素的最佳水解条件为：水解温 度5 1 、料液比7 、加酶量为5 0 0 0 u g ，酶解时间为5 h ，理论水解度为2 3 7 2 。且该模 型具有较好的重复性。 双酶分步水解实验。在单酶酶解的基础上，采用中性、碱性、木瓜、复合蛋白酶分 别与风味蛋白酶组合进行双酶分步水解，评价其水解效果，确定双酶分步水解可大大提 高水解度。其中用内切的碱性蛋白酶和外切的风味蛋白酶组合作用效果最好，先用碱性 蛋白酶加酶量为5 0 0 0 t e g ，在其最适条件下水解4 h ，之后再以5 0 0 0 u g 的加酶量j j n a , 风味 酶进行水解，并且使水解条件保持在风味酶的最适酶解条件，其水解度达至1 j 3 6 9 ，且 反应过程中不需要调整p h 值。 猪骨蛋白酶解液的抗氧化实验。本文对猪骨蛋白酶解液的抗氧化性进行了研究，结 果表明猪骨蛋白酶解液具有很好的抗氧化性。猪骨蛋白酶解液的还原力和对0 2 。- 的清除 效果不是很明显，效果均不如v c 和b h t 。但猪骨蛋白水解液对o h 自由基及d p p h 自由 基具有很好的清除效果，酶解液浓度与o h 清除率之间呈正相关，最高清除率达到 i l r e s e a r c ho ne n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp o r c i n eb o n ep r o t e i na n d f u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fe n z y m o l y s i sp r o d u c t a b s t r a c t t h ep o r c i n eb o n ep r o t e i nw a sh y d r o l y z e dw i t l lp r o t e i n a s et oa n a l y s et h e o x i d a t i o nr e s i s t a n ca n dt h ec o n t e n to fa m i n oa c i di nt h i ss t u d y t h e 毹s hp o r c i n eb o n ep o w d e rw a sm a d eb yh i g ht e m p e r a t u r ea n dh i g h p r e s s u r eo rd e f a t t e da n d d e c a l c i f i e db yc h e m i c a l s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e f o u n d e d ，c o o k i n g2h o u r s 诵t hh i g ht e m p e r a t u r ea n dh i g hp r e s s u r e ，r e m o v i n gf a t i m m e d i a t e l y , w a s h i n g ，d r y i n g ，a n dc m s h i n gt op o w d e r t h ec o n t e n to fp r o t i n ei s 2 4 9 h y d r o l y s i sp o r c i n eb o n ep r o t e i nw a sh y d r o l y z e db yn e u t r a lp r o t e a s e ， a l k a l i n ep r o t e a s e ，f l a v o u r z y m e ，c o m p l e xp r o t e a s e ，a n dp a p a i n s i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t w a ss t u d i e d b yt e m p e r a t u r e ，p h ，e n z y m ed o s a g e ，s u b s t a t e c o n c e n t r a t i o n ，h y d r o l y z i n gt i m e b e t t e rc o n d i t i o n s w e r eo b t a i n e df o re a c h e n z y m e h y d r o l y z i n gd e g r e eo fa l k a l i n ep r o t e a s e w a sb e s t ；t h ed e g r e eo f h y d r o l y s i sw a s 2 3 0 2 r e s p o n s es u r f a c eo p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n tw a ss t u d i e d b a s e do ns i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t ，s e l e c t i n gf o u rf a c t o r sw i t ht e m p e r a t u r e ，e n z y m ed o s a g e ，a n d s u b s t a t ec o n c e n t r a t i o na n dh y d r o l y z i n gt i m et ot h ee x p e r i m e n to fr e s p o n s e s u r f a c eo p t i m i z a t i o n t h eo p t i m a le n z y m o l y s i sc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e db y d e s i g ne x p e r ta sf o l l o w s ：h y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r e51 ，s u b s t a t ec o n c e n t r a t i o n 7 ，e n z y m ed o s a g e5 0 0 0 u g ，h y d r o l y z i n gt i m e5 h t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sw a s 2 3 7 2 ，a n dt h em o d e lh a sg o o dr e p e a t a b i l i t y h y d r o l y s i sr e s e a r c hi nt w os t e pm u l t i e n z y m eb a s e do ns i n g l ee n z y m ew a s o p e r a t e d t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc o u l db ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ，t h eb e s t c o m b i n a t i o nw a sa l k a l i n ep r o t e a s ea n df l a v o u r z y m e ，a tt h e h y d r o l y s i s c o n d i t i o nw i t h o u ta d j u s t i n gp h ，t h eh i g h e s td e g r e eo f h y d r o l y s i sw a s3 6 9 t h er e s e a r c ho fo x i d a t i o nr e s i s t a n c eo fp o r c i n eb o n ep r o t e i np r o t e a s e s o l u t i o ns u g g e s tt h a ti th a sag o o do x i d a t i o nr e s i s t a n c e t h er e d u c t i v ef o r c ea n d r e m o v ee f f e c t so n0 2 。w a sn o ta sg o o ga sv ca n db h t , b u tt h er e m o v ee f f e c t st o o h a n dd p p hw a ss i g n i f i c a n t t h ec o n c e n t r a t i o no fh y d r o l y s i ss o l u t i o nh a d s t r o n gp o w e r t oa r r e s to h 。r a d i c a l ，t h eh i 曲e s tc l e a r a n c ew a s9 4 5 3 w h e nt h e c o n c e n t r a t i o nw a sw i t h i n16 0 4 0 m g m l ，t h er e m o v ee f f e c t sw e r eb e t t e rt h a nv c a n db h t t h ec l e a r a n c et od p p hw a sr i s i n gw i t l lt h e i n c r e a s i n g o f c o n c e n t r a t i o nh y d r o l y s i ss o l u t i o n t h eh i g h e s tc l e a r a n c ew a s9 3 4 9 w h e nt h e c o n c e n t r a t i o na t16 0 m g m 1 t h ep o r c i n ep r o t e i nh y d r o l y s i ss o l u t i o nh a sl o t so f a m i n oa c i da n di ti sab a l a n c em a t c h i n g ，a n dh a st h ei d e a lm o d eo fa m i n oa c i d s t oa c c o r dw i t hh u m a n ，i ti ss u i t f u la sg o o da m i n oa c i df o o da d d i t i v e s k e y w o r d s ：p o r c i n eb o n ep r o t e i n ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s ；a n t i o x i d a n t ；a m i n oa c i d i v 1 2 6 蛋白酶解物的功能特性及抗氧化性测定方法概述1 2 1 2 7 蛋白酶解物的应用前景1 4 1 3 选题依据1 4 1 4 研究内容15 第二章猪骨蛋白酶解工艺研究1 6 2 1 材料与仪器1 6 2 1 1 材料与试剂16 2 1 2 主要实验仪器与设备1 6 2 2 实验方法：1 7 2 2 1 检测指标与分析方法1 7 2 2 2 猪骨蛋白酶解前处理条件及酶解工艺研究1 9 2 3 结果与分析2 2 2 3 1 骨粉生产工艺2 2 2 3 2 酶活测定结果。2 6 2 3 3 酶解预处理2 7 2 3 4 酶解工艺3 l 2 4 本章小结4 3 v 3 2 4 清除超氧阴离子0 2 实验研究4 6 3 2 5 清除d p p h 自由基实验研究【1 l l j 4 7 3 2 6 氨基酸含量分析4 7 3 3 结果与分析4 7 3 3 1 总还原力测定结果4 7 3 3 2 清除羟自由基o h - 实验研究5 0 3 3 3 清除超氧阴离子0 2 实验研究5 2 3 3 4 清除d p p h 自由基实验研究5 5 3 3 5 氨基酸含量分析5 7 3 4 ，j 、结6 0 第四章结论与展望6 1 4 1 结论6l 4 2 仓i j 新点6 2 4 3 展望6 2 参考文献6 3 致谢7 0 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录。7 1 v i 广西大掣明页士掌位论文猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究 第一章绪论 畜禽鲜骨大约占到胴体的1 0 - , - - 1 5 ，是肉类加工业中一个非常重要的副产物，具 有促进大脑神经发育和增智健脑的功效，因为鲜骨中含有丰富的蛋白质、磷脂质、脂肪 酸和磷蛋白【l 】。骨头是一种营养价值非常高的肉类加工副产品，骨蛋白是一种优质蛋白， 国外许多发达国家利用各种高新技术生产出多种骨蛋白制品，而我国的蛋白质资源还比 较紧缺，所以大力开发和合理利用蛋白质资源就显得十分必要。骨富含人体所需的营养 成分，其中蛋白质含量很高【2 】。我国作为世界上饲养畜禽最多的国家之一，畜骨资源极 为丰富，但目前对畜骨的开发利用还比较落后，导致畜禽骨资源的极大浪费，或者仅仅 是用于生产低附加值的产品或者动物饲料等，对骨中其他营养成分及蛋白质都没有得到 充分的开发和利用。 对骨进行酶解，可以将骨中的胶原蛋白水解成胶原多肽及氨基酸，更易于人体消化 吸收，发挥骨的营养功效。对骨进行酶解不仅可以使其营养价值更好的发挥，提高功能 特性，重要的是还可以将骨蛋白水解为多肽和氨基酸，是利用骨蛋白的一种有效途径， 可以变废为宝很好的提高经济效益。对骨蛋白进行酶解，开发骨蛋白制品及功能性食品， 、 以及对骨蛋白水解产物的功能特性研究都具有极大的研究意义和经济价值。 1 1 骨的简介 1 1 1 骨的结构组成 骨是动物的结构器官，畜禽的骨骼一般分为骨膜、骨质和骨髓三个部分，骨膜覆盖 在骨的表面，是一层淡红色的致密的结缔组织膜，上面分布有很多微细血管和神经末梢， 具有一定的坚韧性。骨质是骨的主要构成部分，又分为骨松质和骨密质。骨松质呈海绵 状结构，由许多粗细不等的骨小梁集合而成，内有许多小孔，孔内充满骨髓。骨密质位 于骨的外表层，致密而坚硬。骨密质的结构单位是哈佛式系统，由哈佛式管、骨板层和 骨小管等组成。骨髓则分布在长骨的髓腔( 内腔) 及骨松质的腔隙中，有红色和黄色两 种。红色骨髓含有大量的血管和各种细胞成分，是造血组织，而黄色骨髓的主要成分是 脂肪 3 1 。 骨骼按形状不同可分为长骨、短骨、扁骨和不规则骨等。长骨一般位于四肢，在运 动中起杠杆作用。不同骨的骨松质和骨密质分布情况也有不同，以长骨为例，其两端为 猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究 骨髓，密质很薄，内面含有大量骨松质。长骨中间的骨干部分由骨密质构成，纵截面为 矿化的胶原纤维取向排列。不同动物骨骼的化学成分差别很大，一般脂肪含量为 l 2 7 ，有机物含量为1 6 3 3 ，无机物含量为2 5 5 6 【4 】。而同一头动物的骨骼， 部位不同，其化学成分的组成也有很大差别。牛骨的一般组成成分见表1 1 【5 1 。 表1 1 牛骨的一般组成( ) t a b l e1 - 1t h ec o m p o s i t i o no f b e e f b o n e ( ) 1 1 2 骨的营养价值 大量研究分析表明，畜禽骨所含有的营养素非常丰富，甚至优于鲜肉本身。骨头内 除含大量钙质以外，还含有大脑不可缺少的磷脂质和磷蛋白，同时含有能滋润皮肤，补 充精血，防止老化的营养素，如软骨素、骨胶原和多种氨基酸以及维生素等 6 1 。骨中蛋 白质的质和量均可与肉中的蛋白质含量相媲美，其中含有构成蛋白质所需的氨基酸和人 体必需的氨基酸，比例均衡且含量高【7 1 。表1 2 中的数据反映了各类骨的营养价值，从中 可以看出骨的营养素含量优于其他食物【引。 胶原、骨胶原及软骨素( 酸性粘多糖) 占到了骨中蛋白质总量的9 0 【1 2 1 ，能够增强 皮下细胞代谢及延缓衰老。骨蛋白是可溶性蛋白，具有很高生物学效价【1 3 1 ，并且八种必 须氨基酸的含量很高，有资料表明每l o o m g 骨粉中的e a a 含量占氨基酸总量的2 0 6 7 ( 损失的氨基酸未计算在内) 【l 钔，达到5 5 1 8 r a g 。晋佳路等( 2 0 0 5 年) 分析测定表明， 2 广西大学臻页士学位嵌譬猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究 猪骨提取肽中含有1 7 种天然氨基酸，其q 丁g l u 、g l y 、p r o 、a s p 、a l a 、a r g 、l y s 、l e u 是主要存在的氨基酸1 5 1 。由表1 3 可以看到骨中游离氨基酸含量。 表1 2 一些畜禽骨与食物的成分含量表( ) t a b l e1 - 2t h ec o m p o s i t i o no fs o m eb o n e sa n dm a t e r i a l s ( ) 名称水分 蛋白质脂肪 灰分 钙 猪骨 6 2 71 2 9 6l l3 1 牛骨 “21 1 581 5 45 4 羊骨6 5 1 1 1 79 2 1 1 9 3 4 鸡骨 6 5 61 6 31 4 53 11 猪肉 6 9 31 7 51 5 10 90 0 0 9 牛肉 6 41 7 51 7o 40 o l1 鸡肉6 6 31 7 21 5 80 70 0 2 6 牛奶8 9 933 20 60 1 0 4 大米 1 2 87 40 80 60 0 1 3 精白粉 1 37 21 30 50 0 2 表l - 3 动物骨头中游离氨基酸成分表( ) t a b l e1 - 3t h ec o m p o s i t i o no ff r e ea m i n oa c i d si na n i m a lb o n e 成分牛骨猪骨鸡骨成分牛骨猪骨鸡骨 注：动物高汤经高温蒸煮冷却后，用蛋白酶作用分解成氨基酸，然后测定得到以上数据。 3 猪骨蛋白的酶解及其产q t , t r b ：叻能特性研究 1 1 3 国内外骨制品的应用及研究情况 瑞典、丹麦等发达国家早在2 0 世纪7 0 年代就对骨资源的开发有了相当的重视，成功 研制出了畜骨加工机械及骨泥和骨粉等产品，几乎将骨1 0 0 得到利用。之后在美国、 日本也陆续兴起开发利用骨产品的热潮。日本从2 0 世纪8 0 年代开始成立了“骨有效利用 委员会”等相关组织，利用猪骨、牛骨、鸡骨等制成骨泥、骨粉、骨味素、骨味汁和骨 味蛋白等系列食品，并且称之为“长寿之物”。在日本骨味食品已发展成为面向全社会的 高级营养保健品。此外在日本还有骨汤供应市场，以其中含有的丰富骨胶原来激活人体 的生命活性。另外，在日本还有人利用骨头提取物作为营养强化剂来生产功能性食品。 而我国对骨产品的研究开发和关注都比较晚，从2 0 世纪8 0 年代才刚刚起步。经过2 0 多年的发展和改进，已经改变了过去只是经过破碎、烘干碾细成骨粉而作为动物饲料的 低附加值的简单生产。目前对畜骨的研究研究取得了很大的进步，骨类产品的品种也多 种多样。归结起来，目前对畜骨利用开发的产品和制品主要有以下几大类： ( 1 ) 骨胶原蛋白及其多肽 骨蛋白水解液含有丰富的胶原蛋白和酸性粘多糖成分，有加强皮下细胞代谢和延缓 衰老的作用，可用于美容保健，开发研制新型蛋白饮料，满足生长期儿童、老年人、恢 复期病人、高体能消耗的运动员等特殊人群的营养需求。畜禽蛋白水解液中还含有高活 性的多肽物质，易降解且具有预防和治疗骨关节炎和骨质疏松，抗高血压、抗衰老、抗 氧化等作用，此外还可促进矿物质的吸收和有利于减肥。 骨的降解物几乎没有过敏蛋白质，机体能完全吸收，因此近年来胶原蛋白及其多肽 作为天然的生物资源则广泛应用于肉品改良、功能性食品以及蛋白饮料等方面。耿秀芳 ( 2 0 0 1 ) 0 6 1 从猪骨胶原蛋白中提取出小肽，并对其作为血管紧张素转换酶抑制剂进行了 研究，结果表明：对自发性高血压有一定的降压作用；m o r i m u m 等( 2 0 0 2 ) 1 1 7 1 分别采 用n a o h 溶液( p i l l 2 ) 和醋酸一盐酸的混合酸液( p h 3 ) 提取骨胶原蛋白，结果发现两种 提取液均可有效的提取胶原蛋白；付刚等( 2 0 0 6 ) i s 】研究了用中性蛋白酶酶解猪骨来制 备胶原多肽的最佳酶解工艺，并分别采用猪油、菜油和豆油体系对股胶原多肽的抗油脂 氧化作用进行检测，结果表明胶原蛋白具有较强的抑制油脂氧化能力。另外胶原蛋白及 其多肽还具有高分子合成材料无法比拟的生物降解性和生物相容性，可广泛应用于医 药、食品、化妆品等行业中。 ( 2 ) 骨素 4 j r , - 西大掣归页士掌位论文 # t g q , - j 白的酶解及其产物的功能特性研究 将新鲜的畜禽骨破碎、高温蒸煮、酶解、过滤以及真空浓缩等，制成的骨类抽提物， 不仅营养丰富，而且味道鲜美，这就是骨素和骨油等产品。成品骨素是一种味浅褐色或 褐色膏状的天然调味料，除含有各种复杂的鲜味成分还很好的保留了畜禽骨髓和肉中的 天然香气，并且口感浓厚。 另外，骨素的热稳定性比较强，其中的各种营养物质在1 2 0 的高温下仍能保持稳 定状态。一般肉制品的加工温度在8 0 1 2 0 ，所以在这个条件下骨素中营养物质在a nt _ 过程中不会受到损失，可以广泛应用于肉制品的生产和加工中【1 9 1 。利用骨素、骨油为原 料与氨基酸、还原糖、酵母膏、植物水解蛋白等发生美拉德反应，再适当添加味精、有 机酸、糖类、香辛料等调味，即可得到纯天然的骨素调味料。 ( 3 ) 畜禽骨钙的开发利用( 骨泥、骨粉) 骨泥又称骨糊，是由鲜骨经过清洗、冷冻、碎骨后再经粗磨、细磨而达到食用标准 的一种营养丰富的新鲜食品。骨泥所含营养成分比肉类更丰富，铁的含量是肉类的3 倍， 而钙的含量更是肉类无法比拟的，骨泥是肉类很好的代用品【2 0 】。骨泥可用于制作特色风 味的肉馅、肉丸、灌制肉肠以及汤圆等产品，另外还可制成骨泥饼干、富钙米粉、骨奶 及钙方等，添加骨泥的食品不仅营养美味而且还可以提高产品的出品率，适合老人、儿 童、孕妇等特定人群补钙补磷的需型2 1 1 。李少英等( 1 9 9 8 ) 2 2 1 ，郝永清等( 2 0 0 3 ) 2 3 1 分别用乳酸菌对不同浓度的骨泥进行发酵工艺研究，结果都表明发酵骨泥提高了骨泥中 可溶性钙的含量，游离氨基酸的含量也明显提高。夏杨毅( 2 0 0 5 ) 【2 4 1 系统的对骨泥的粘 度和凝胶强度等流变学特性进行了研究，并采用超微粉碎、酶工程、食品胶粘合等技术 加工出了一种高钙食品一骨泥软糖，并且确定了加工的生产制备工艺、产品配方以及 主要的操作要点等。 骨泥经过干燥细磨便可制得骨粉。骨粉可做饲料，还可作为牙膏的磨料，占牙膏 总量的3 0 8 0 。骨粉的质量一般以粗蛋白含量来衡量，粗蛋白含量在5 0 左右最为常 见。叶明泉，邓国栋等( 1 9 9 9 ) 2 5 1 从不同性质的组成部分着手，采取有针对性的高效的 粉碎原理和方法，制成了超细低脂鲜骨粉，克服了传统生产中出现的问题，同时很好的 保持了骨粉的营养成分，具有较高的生物学功能，并对其工艺流程和工艺条件进行了确 定。此外国外有人研究了用骨粉作为固定化酶的载体，把半乳糖苷酶和淀粉酶固定于骨 粉上，用于生产糖浆取得了非常好的效果【硐。 ( 4 ) 其他活性成分的利用 硫酸软骨素( c h o n dr o i t i ns u l f a t e ，c s ) 是由动物软骨中提取的种粘性多糖，是有 s 广西大鼍明弧士学位论文 猪骨蛋白的萌i 解及其产物的功能特性研究 乙酰胺基半乳糖硫酸酯与d 葡萄糖醛酸相互连接而成的一种高分子化合物，广泛存在于 哺乳动物的软骨、鼻骨、喉骨和气管中。硫酸软骨素是构成弹力纤维的重要物质也是真 皮的构成成分，具有强化结缔组织，加强皮下细胞的代谢，防止老化等作用。主要是用 于人体内脏器官劳损的治疗和冠心病治疗，长期使用无明显的毒副作用 2 7 1 ，是临床常用 药，具有抑制肿瘤、抗突变及良好的免疫调节作用。另外硫酸软骨素还可用于食品的乳 化、保湿及祛除异味【2 羽。高华( 2 0 0 3 ) 【2 9 】等以牛鼻软骨为原料制得白色粉末状的硫酸软 骨素，在其工艺条件下值得的产品纯度达至t 9 5 2 ，回收率为3 2 6 ，对产品的纯度和回 收率都有很大提高。 骨形态发生蛋白是一种由骨基质分泌的疏水性非胶原糖蛋白，主要存在于长管状 骨的皮质部分，体内含量极少。它是诱导未分化的间充质型细胞向成骨细胞分化的诱导 因子，对细胞分化、骨及骨肿瘤形成的研究及在临床应用方面都有重要意义。尹绍雅 ( 2 0 0 5 ) 3 0 1 对迸一步降低牛骨形态发生蛋白提取成本，增加纯度和安全可靠的对其进行 消毒贮存的方法进行了报道。 1 2 酶解骨蛋白及其研究动态 1 2 1 酶解的优点 蛋白质水解后的产物称为蛋白质水解物，一般来说其生产方式分化学降解法和酶降 解法。用酸碱的作用使肽链断裂成小分子的物质，这种方法属于化学法，而酸法多为采 用在强酸条件下高温反应，不仅反应强烈而且还严重腐蚀设备，并且反应过程中由于水 解彻底会生成氨基酸混合物，尤其色氨酸被完全破坏，因此这种方法目前已经淘汰。但 碱法又容易使氨基酸消旋，生成有毒物质【3 1 1 ，基本无生物利用价值，故不宜采用。n 2 0 世纪8 0 年代食品工业和酶制剂工业得到了迅猛发展，酶法也因为其水解反应温度低、时 间短、无污染，产品价值高等特点受到人们的重视和关注。酶法水解后的水解物以多肽 和l 游离氨基酸为主，速溶性好并且易于人体吸收，因此酶工程及酶法水解骨蛋白也随 之兴起。酶法水解骨蛋白提取率高，一般可达7 0 以上，同时酶解工艺的条件易控制， 可在一定条件下通过定位酶解产生特定的肽。另外酶法水解蛋白所得水解物还具有产品 理化性好，营养价值高等特点。 骨蛋白以胶原蛋白为主，其分子形成一种三股超螺旋结构，十分稳定，这种结构在 一般的加工温度及短时间的加热条件下都很难被破坏，因此造成这类产品不仅口感差， 6 广西大d 瞻页士学位论文猪骨蛋白的萌啊晖及其产物的功能特性研究 而且不易消化吸收。利用酶解的方法将其中的胶原蛋白分解为多肽和氨基酸，不仅改善 了其营养价值，提高了功能特性及生理效果，同时还具有了易吸收易消化等营养功能， 并且溶解性，热稳定性等功能性质也更加优越。将胶原蛋白水解为多肽以后还可以最大 程度的发挥胶原的功能，如：( 1 ) 其营养效果好，消化吸收率达可以到百分之百；( 2 ) 具有保护胃粘膜及抗溃疡的作用；( 3 ) 可增强低钙水平下骨胶原结构，促进骨质形成， 从而提高骨强度预防骨质疏松；( 4 ) 抑制血压上升作用；( 5 ) 可促进皮肤的胶原代谢， 具有美容的功效。因此胶原蛋白水解物的研究引起了越来越多人的关注和兴趣。 酶解深加工蛋白质技术可以提升蛋白质各种功能特性并能扩大蛋白质的应用范围 【3 2 】。蛋白质部分水解后可产生许多低分子量的肽段。这些肽段往往具有比原蛋白质分 子更高的功能活性及营养特性【弼，所以酶解技术可以在很大程度上提升一些食品加工过 程中产生的副产物的附加值。 1 2 2 酶的选择 酶法水解蛋白质的关键在于酶的选择，选用的酶不仅应该符合食品安全，同时还应 该可以满足生产目的产物的需要。酶解所采用的生物蛋白酶多是肽类酶，在生物界分布 极广，可分为动物蛋白酶( 如胃蛋白酶、胰蛋白酶等) 、植物蛋白酶( 如木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶等) 和微生物蛋白酶3 类。骨基质中的有机成分胶原蛋白占到9 0 1 3 7 】，能够 水解胶原蛋白的酶种类很多，但在实际生产中如没有特殊要求的情况下一般根据酶作用 的强弱及价格选用已工业化的酶。不同的酶对底物的作用位点不同，水解后产物的分子 量分布也有区别，所以选择合适的酶对水解产物是否适合开发所需产品显得至关重要 d s 。如在降低苦味的同时又想得到适宜的多肽，可以选用即兼有内切肽酶和外切肽酶的 双重活性的复合蛋白酶【3 9 1 。因此酶的选择就显得尤为关键。在实际生产中，酶的初步纯 化也是很有必要的，纯化不仅可以除去其中的物理杂质，提高酶活性，而且还具有改善 酶及水解产物色泽的作用。目前在实际生产中中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、 胰蛋白酶等应用比较广泛。另外，由于蛋白质自身结构的复杂性以及产物组成多样性的 特点，目前也多采用多种生物酶联合作用的酶解方式，较单一酶的作用效果有所提高。 1 2 3 影响酶解的因素及酶解机理 骨骼是由胶原纤维和埋藏在胶原纤维基质中的羟基磷灰石的微晶体组成的，结构坚 硬而致密。胶原纤维的二股超螺旋结构通过分子内和分子间交联得到进步的稳定和增 强，使得一般短时间的加工及低温加热都很难破坏其机构而使其分解，骨中蛋白质的利 7 猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究 用因此受到限制。将畜禽骨经过高温蒸煮或者在酶解前进行预处理，可使骨粒软化，蛋 白质热变性，使部分弱键断裂，内部非极性基团暴露于分子表面，可加快骨蛋白的水解 速度，提高水解效果。酶解过程中的条件选择和控制也很关键，酶解过程中的p h i 酶解 温度、酶解时间、底物浓度、最佳e s 比都对酶解过程产生影响。p h 对酶催化反应的影 响主要表现在影响酶的稳定性及酶催化底物转变成产物，在不同的p h 下，蛋白酶对骨的 水解作用不同。酶解温度主要影响酶催化的速度和酶的稳定性，在一定温度范围内升高 温度可加快底物向产物的转换，酶解效率也相应提高。但温度过高也会使酶蛋白变性， 降低酶解效率。不同的酶解时间对酶解产物的氨基酸组成影响较大，而底物浓度则对反 应速率起着重要作用。料液比过小会导致水解不彻底，蛋白质提取率低；料液比过大虽 有助于水解的进行，提高蛋白质提取率，但导致产物浓度过低，浓缩时能耗过大。故生 产中控制合适的料液比十分重要。e s 臣o 酶浓度与底物浓度之比。比酶浓度本身更能反 映酶解过程中的反应速度特征。当底物浓度一定而酶的增加量又未使底物浓度达到饱 和，则e s 越大反应速度就越快，蛋白质的水解率也越高。但e s 过大时生产成本也会相 应提高，同时还可能导致酶自身的相互水解使酶活力降低m 。 表l - 4 一些蛋白酶的来源、切割位点和最j 遥p h t a b l e1 - 4t h e $ o u r c 2 ，c l e a v a g es i t ea n do p t i m u mp ho fs o m ep r o t e a s e s 目前的蛋白酶种类很多，按照其水解蛋白质的方式不同可分为内切蛋白酶 8 猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究 ( p r o t e i n a s e ) 和外肽酶( p e p f i d a s e ) 两种。 ( 1 ) 内切酶针对蛋白质分子内部肽键一c o - n h 作用，可将蛋白质水解成小分子 的肽类。包括动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。 ( 2 ) 外切酶可将蛋白质或多肽分子的氨基或羧基末端的肽键切开而游离出氨基 酸。外切酶( e x o p e p t i d a s e ) 仅作用于肽链的末端，可将蛋白质多肽链从末端开始逐一的 水解成为氨基酸。按其作用部位不同，又可将作用于羧基端的称为羧肽酶 ( c a r b o x y p e p t i d a s e ) ，作用于氨基端的称为氨肽酶( a m i n o p e p t i d a s e ) ，作用于二肽的称 为二肽酶( d e p e p t i d a s e ) 。另外，外肽酶可以将位于肽链末端的疏水氨基酸水解，从而 降低水解物的苦味。 根据酶解物的结构差异以及的蛋白水解产物中多肽和氨基酸的要求，生产中应选择 具有适宜切割位点的酶进行水解，从而获得优质的目的产物，利用蛋白酶的底物专一性 定向获得特殊结构的多肽。表i _ 4 1 5 列出了几种常见蛋白酶的主要切割位点和最适p h 范 围。 1 2 4 骨蛋白酶解的国内外研究情况 ( 1 ) 国外研究现状 二十世纪六十年代可以作为食用蛋白质酶法水解研究的分界线【4 ，关于食用蛋白酶 法水解的报道在这之前是很少的，此后才逐渐增多，大量关于食用蛋白酶法水解方面的 报道直到七十年代以后才出现。食用蛋白质水解研究在7 0 年代作为一门相对独立的的 研究领域建立起来，而酶法水解骨蛋白也成为其中的一个研究分支。 骨食品的开发研究在国外非常普遍，瑞典、美国、前苏联、日本、丹麦、英国等国 家起步较早，尤其以美国、日本等国家在这方面的开发研究走在世界前列。s u r o w k a 和f i c 【4 2 1 ( 1 9 8 7 ) 用酶法加工从鸡头骨中制取了一种蛋白浓缩物，而后又对鸡头骨蛋白进 行了商业酶水解的研究【4 3 1 。1 9 9 2 年丹麦也出现了食用蛋白粉的酶法生产，将骨骼在5 8 6 2 c 下用中性蛋白酶处理l h ，生产出了高品质的肉骨蛋白粉，从而证明了酶工程技术用 于骨蛋白食品生产的可行性1 4 4 。m i e h el i n ( 1 e 5 1 等人( 1 9 9 5 ) 用酶法对小牛骨骼进行水解， 确定了水解的最佳工艺条件，实现了酶解法回收小牛骨蛋白。b e n j a k u ( 1 9 9 7 ) t 4 s l 将牙鳕的 废弃物( 包括鱼头、皮、骨、内脏和肌肉组织) 绞碎，之后用中性和碱性蛋白酶进行水解， 确定了最佳用酶及最优工艺条件，并且发现水解产物的蛋白质纯度高达7 9 9 7 ，并且 其氨基酸与鱼肉十分接近。m o r i m _ u r a 【例等人对鱼骨及猪皮的酶解产物进行研究，结果表 9 猪骨蛋白的萄 解及其产物的功能特性研究 明其水解产物具有很好的抗自由基能力，并且迸一步确定了蛋白质水解后产生的肽和氨 基酸具有抗氧化的作用。 ( 2 ) 国内研究现状 对于植物蛋白( 如大豆蛋白等) 和动物蛋白( 如乳蛋白等) 的酶解方法国内研究的比较 多，但对于骨的酶解较少研究。我国对骨的开发和利用还停留在比较落后的阶段，主要 是因为人们对骨的认识很研究不够深入，除了熬制骨汤补钙和制备骨胶外，就是骨粉和 骨糊等附加值较低的产品，而且开发渠道不够畅通。目前酶解骨蛋白的研究主要集中在 鱼骨等副产物的研究，相对报道较少。周涛等【5 0 l ( 19 9 8 ) 采用木瓜蛋白酶对鲐鱼头骨等加 工废弃物进行酶解，然后用活性炭对水解液脱色，在确定最佳水解条件的同时还制备除 了高营养价值，并且水溶性好的理想蛋白质强化剂。刘红【5 1 1 ( 2 0 0 0 ) 对废弃鱼头进行中性 蛋白酶水解，制得了红褐色香味浓郁的水解液；陈美珍【5 2 1 ( 2 0 0 1 ) r 寸鳗鱼鱼头进行酶解， 用活性炭脱苦脱色，制得了一种海鲜风味料，味道鲜美；赵玉红等t 1 2 1 ( 2 0 0 1 ) r 悯q 产 物进行酶解，确定了浓度、温度和p h 对蛋白质回收率的影响，确定了最佳酶解工艺。 李建周【5 3 】等( 2 0 0 3 ) ，采用酶法水解鸡骨泥制备水解动物蛋白h a p ，比较了f l a v o u r z y m e 、 p r o t a m e x 、a l c a l a s e 和胰蛋白酶等酶的水解效果，得出f l a v o u r z y m e 在p h 7 、温度5 0 时的水解效果最好。安广杰阱】等( 2 0 0 4 ) 以牛骨素为原料，应用a l c a l a s e 蛋白酶制备水解 明胶，确定了a l c a l a s e 最佳水解条件，并初步探讨了酶解机理。杨瑞学【5 5 j 等( 2 0 0 4 ) 对乌 骨鸡进行深加工研究，得出用f l a v o u r z y m e 蛋白酶在p h 7 、温度5 0 ( 2 时的水解效果最好。 李帆【5 6 1 ( 2 0 0 6 ) 等以蛋白质水解度为评价指标，辅以固形物溶出率，比较了中性蛋白 酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对牦牛骨蛋白的水解效果，研究了酶用量、料液比( 底物 浓度) 、酶解时间对水解度的影响，采用正交试验对酶解条件进行了优化。结果显示， 木瓜蛋白酶是牦牛骨蛋白水解的适宜催化剂。在一定条件下，样品水解度随酶用量和酶 解时间的增加而增大，底物浓度过低或过高均不利于原料中蛋白质的酶解。木瓜蛋白酶 水解牦牛骨蛋白最佳条件为：酶解温度6 0 ( 2 ，酶解时问8h ，酶用量3 5 0 0u g 。刁静 静【1 1 ( 2 0 0 7 ) 等用碱性蛋白酶水解骨蛋白，研究了其水解时间，测定了水解度，研究了水 解产物的功能特性，如持水性和持油性，乳化性及乳化稳定性、起泡性以及起泡稳定性 等。研究结果表明，水解物的持油性、乳化性及起泡性较好，尤其以3 h 的水解产物为 最佳，但乳化稳定性和起泡稳定性较差。张根生f 5 7 】( 2 0 0 8 ) 等对猪骨蛋白的提取工艺进行 了研究。首先采用石油醚低温回流的方法脱去骨中的脂肪，再经过稀盐酸浸泡脱钙、碱 处理后，采用熬煮的方法提取骨蛋白。研究了脱钙条件对脱钙效果的影响，并确定了提 1 0 猪骨蛋白的酶解及其产物的功能特性研究 取的最佳条件。赵霞网等采用酶法水解羊骨，以水解度作为测定指标，采用三因子二次 通用旋转设计试验，最终确定了中性蛋白酶水解羊骨的最优工艺条件。 目前，骨食品的开发大部分限于鱼、禽骨骼，猪、牛、羊等畜类骨骼开发潜力很大； 骨蛋白由于其特殊的营养特点很适合加工成新型的保健食品，满足各年龄层的消费者， 具有良好的社会效益；骨蛋白食品的兴起也必将解决肉类工业大量畜禽骨浪费的问题， 使畜禽骨变废为宝，给企业带来更大的经济效益。 ( 3 ) 对比分析 针对我国骨类食品加工技术含量少，产品档次低下等问题，开发科技含量高的骨类 制品，增加产的附加值，促进和推动相关产业的发展，实现经济的循环发展并与环境协 调发展，十分必要。酶工程属于现代生物技术的范畴，而酶法水解骨骼中的蛋白属于新 技术范畴。 目前国内外对骨蛋白的研究主要集中在骨蛋白提取和酶解工艺条件方面，对于骨蛋 白酶解液研究方面比较少，表