（信号与信息处理专业论文）神经元干细胞序列图像分割与追踪系统的研究.pdf

神经元干细胞序列图像分割与追踪系统的研究 摘要 成体神经元干细胞是藏匿于成体神经系统某些部位中的一些细胞，这些 细胞具有良好的可塑性，可以通过基因工程或细胞工程等当代高新技术将之 进行人工改造，使其发育成为能够对神经损伤特别是中枢神经损伤进行替代 治疗的工具。如何找出神经元干细胞的这种自然的分裂、增殖规律，从而能 够利用特定的神经元干细胞的祖细胞，人工培植出所需要的具有特定功能的 神经器官，在医学角度上以移植的方式救治神经方面的患者，越来越成为当 今世界上的研究难点和热点问题。借助计算机在数字图像的成像分析技术和 在信号与信息的高速处理技术等方面具有的高性能，对神经元干细胞进行追 踪，其研究目前属于起步阶段。本课题以c h a l m e r s 技术大学的k a r i n a l t h o f f 和j o h a nd e g e r m a n 所采集的神经元干细胞序列图像作为图像源，以u p p s a l a 大学图像分析中心的c a r o l i n a 和y o a k i m 所发展的以源点作为区域表象的基 于区域的全自动水线分割( w a t e r s h e ds e g m e n t a t i o n ) 算法为基础，设计了一 个分割与追踪系统。该系统的特点是在追踪过程中结合了多项分割技术以保 证追踪结果的正确性。研究的主要内容和创新点如下： 1 针对全自动水线分割算法对于在全自动成像过程中，由于焦距发生改 变而采集的图像分割效果差的不足，通过研究和分析基于等值面的h a m i l t o n - j a c o b i 方程和几何蛇算法，把几何蛇算法的思想嵌入到等值面的h a m i l t o n j a c o b i 方程中，针对神经元干细胞数字图像的特点，提出了应用到该课题中 的基于等值面的几何蛇模型的分割算法。等值面方法由于其计算量复杂在图 像处理方面应用很少，几何蛇模型的研究在国内的开展的也不多，本文在把 二者结合应用方面进行了一定的探索。最终实验结果表明该算法对于该类图 像能够有效地捕捉图像中所有目标，完成分割目的。 2 针对当一帧图像所含的细胞数目多，分裂后两个子细胞之间的距离与 其它非分裂细胞之间的距离小于所设定的距离门限时，需要对其进行进一步 的处理和识别这一问题，提出了一种能够精确提取分裂子细胞轮廓信息的分 割算法。该方法采用了基于最大熵的模糊阈值分割方法，并应用遗传算法确 定最大模糊熵准则下的最优参数。然后利用加权距离变换，区域标注和形态 哈尔滨工程大学博士学位论文 学运算，实现了对分割结果中的于扰区域的吞没，以及对于分割图中欠分割 目标的分离。最后对模糊分割后的目标轮廓的c c d 曲线，提出了一种新的 平滑方法。实验结果表明对于面积在3 0 个像素左右，边缘模糊的微小目标， 本算法对其轮廓的提取基本上能够达到人类视觉模糊提取的效果。在对微小 目标形状信息的精确提取方面，该算法为微小目标的进一步识别和匹配奠定 了基础。 3 由于在追踪中出现的错误大多数是来自于分割，为了避免追踪过程中由 于分割出现的错误保持到最后，本文还开发了一个人机交互软件。该软件能 够实现对图像的调用、分割错误的修改、删除，对修改后图像的保存，在修 改后的分割图像插入到序列图像之后，追踪仍能继续进行，还能允许操作者 以人机交互方式自由察看追踪图、分割图和原灰度图序列中任何一帧图像。 该软件具有操作灵活的特点，能够有效、及时地干预和纠正在分割和追踪过 程中出现的错误。 4 由于细胞运动在整体上呈现出的非规律性，在追踪过程中，按照干细 胞运动具有不同的生命运动特征，把干细胞分为惰性细胞，分裂细胞，活跃 细胞三种类型以探索式进行追踪。应用布朗运动的模型实现了对细胞运动参 数的估计。在前向追踪结束后，一种特殊的后向跟踪实现了对于细胞i d 互 换及静态细胞等问题的处理。用细胞运动轨迹图显示了系统的处理结果。通 过人类视觉观察，追踪结果正确的正确率达1 0 0 。从轨迹图的描绘中可以看 出，干细胞的运动轨迹具有非平滑性，呈现出粒子运动的特性，进一步证明 了用布朗运动模型拟合其运动轨迹的正确性，并进一步说明了干细胞运动目 标的识别和跟踪与雷达信号的识别和跟踪具有很大的不同。 综上所述，论文对于神经元干细胞序列图像的分割与追踪系统进行了深 入的研究，仿真实验证实本文所设计的系统能够获得好的追踪结果。 关键词：神经元干细胞；序列图像；分割；追踪；系统 i i 神经元干细胞序列图像分割与追踪系统的研究 a b s t r a c t a d u l tn e u r o ns t e mc e l l sa r eas o r to fc e l l sh i d d e ni ns o m ep o s i t i o n so fa d u l t n e r v es y s t e m t h e yh a v es og o o dp l a s t i c i t yt h a tc a nb ea r t i f i c i a l l yb u i l tb ym e a n s o fg e n ee n g i n e e r i n go rc e l le n g i n e e r i n ga n ds o m eo t h e rm o d e mt e c h n i q u e si n o r d e rt om a k et h e md i r e c t i o n a ld i f f e r e n t i a t i o na n dt ob u i l du pak i n do f r e p l a c e m e n to fi m p a i r m e n ti nn e r v e ，e s p e c i a l l yi m p a i r m e n ti nn e r v ec e n t e r h o w t of i n dt h el a wo ft h en a t u r a lc l e a v a g ea n dp r o l i f i c a t i o no fn e u r o ns t e mc e l l ss o t h a tw ec a na p p l yt h ec e r t a i np r o g e n i t o rc e l l so fn e u r o ns t e mc e l l st h e nt oc u l t u r e t h e mt ob e c o m eas o r to fn e r v eo r g a nw h i c hh a sc e r a t i nf u n c t i o nb e i n gu s e dt o c u r et h ep a t i e n t so fn e u r a ld i s e a s eb yo r g a nt r a n s p l a n t a t i o nm e t h o d t h i sp r o j e c t b e c o m e sh a r d e ra n dm o r ep o p u l a ri nt h ew o r l d a i d e db yt h ei m a g i n ga n a l y s i s t e c h n i q u eo fd i g i t a li m a g ei nc o m p u t i n gs c i e n c ea n dt h et e c h n i q u eo fh i g hs p e e d p r o c e s s i n gi ns i g n a la n di n f o r m a t i o n ，t h et r a c k i n go fn e u r o ns t e mc e l l si ss t u d i e d t h i sp r o j e c ti ss t i l lo na ni n i t i a ls t a g es of a r t h eo r i g i n a li m a g e sa n a l y s i s e di n t h i sd i s s e r t a t i o na r eb a s e do nt h et i m e l a p s ei m a g es e q u e n c e so fn e u r o ns t e mc e l l sa c q u i r e db yk a r i na l t h o f fa n dj o h a n d e g e r m a no fc h a l m e r su n i v e r s i t yo ft e c h n o l o g yi ns w e d e n t h ef i r s tl e v e l s e g m e n t a t i o nc a l l e dw a t e r s h e ds e g m e n t a t i o ni sa d o p t e db yt h ea u t o m a t i c r e g i o n b a s e ds e e d e dw a t e r s h e ds e g m e n t a t i o ni m p l e m e n t e db yt h eg r o u po fc e n t e r o fl m a g e a n a l y s i si nu p p s a l au n i v e r s i t y as e g m e n t a t i o na n dt r a c k i n gs y s t e mh a s b e e ns e t u p o nt h eb a s eo ft h ec o n d i t i o n sa b o v em e n t i o n e d t h em a i n c h a r a c t e r i s t i co ft h i ss y s t e mi st h et r a c k i n ga l g o r i t h mc o m b i n e dw i t l lm a n yk i n d s o fs e g m e n t a t i o na l g o r i t h m si no r d e rt oe n s u r et h ea c c u r a c yo ft r a c k i n gr e s u l t s t h em a i nr e s e a r c ha n di n n o v a t i o nc o n t e n t sa r es t a t e da sf o l l o w i n g ： 1 ，a st h eo u t c o m eo fw a t e r s h e ds e g m e n t a t i o na r en o ts a t i f i y i n gw h e ni m a g i n g f o c u si s c h a n g e di na u t o m a t i ci m a g e sc a p t u r i n g ，a f t e rt h eh a m i l t o n - j a c o b i e q u a t i o nb a s e do nl e v e ls e tm e t h o dc o m b i n e dw i t hg e o m e t r i cs n a k ea l g o r i t h mi s 哈尔滨工程大学| 尊十学位论文 s t u d i e d ，t h e i d e ao f g e o m e t r i c s n a k ei se m b e d d e di n t ot h e e q u a t i o n o f h a m i l t o n - j a c o b ib a s e do nl e v e ls e tm e t h o d ap r a c t i c a lg e o m e t r i cs n a k em o d e l b a s e do nl e v e ls e ta l g o r i t h mc o m b i n e dw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i co f t h e d i g i t a li m a g e s o fn e u r o ns t e mc e l l si sp r e s e n t e di nt h i sd i s s e r t a t i o n t h em e t h o do fl e v e ls e th a s b e e na p p l i e dn o tm u c hb e c a u s eo fi t sr a t h e rc o m p l e x i b l ec o m p u t a t i o n t h e d i s c u s s i o na n di m p l e m e n t i o no ft h em e t h o do fg e o m e t r i cs n a k ei sa l s of e wi n c h i n a t h e r e f o r eak i n do fe x p l o r a t i o nh a sb e e ni m p l e m e n t e di nt h i sa p p l i c a t i o n c o m b i n e dw i t ht h e s et w oa l g o r i t h m s 1 1 1 er e s u l to fs i m u l a t i o ns h o w st h a ti tc a n c a p t u r ea l lo b j e c t si nc e r t a i ni m a g e se f f e c t i v e l yt or e a c ht h eg o a lo fs e g m e n t a t i o n o fs o m ec e r t a i ni m a g e si ni m a g es e q u e n c e s 2 w h e nt h en u m b e ro fc e l l sc o n t a i n e di na ni m a g ei sl a r g e ，t h ed i s t a n c e b e t w e e nt w od a u g h t e rc e l l sh a v i n gs p l i ti sl e s st h a nt h et h r e s h o l dp r e s e tc o m p a r e d t ot h ed i s t a n c eo fo t h e rn o n s p l i tc e l l s ，af u r t h e rs t u d i e do nt h e i rs e g m e n t a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o ni sn e e d e d ap r e c i s e s e g m e n t a t i o nw h i c hc a n a b s t r a c tt h e i n f o r m a t i o no fc o n t o u r so fd a u g h t e rc e l l sh a v i n gs p l i ti s p r e s e n t e di n t h i s d i s s e r t a t i o n ，f u z z yt h r e s h o l ds e g m e n t a t i o nb a s e do nm a x i m a le n t r o p yi sa p p l i e d i n t h i sa l g o r i t h mc o m b i n e dw i t hg e n e t i ca l g o r i t h mt oc o n f i r mt h e o p t i m a l p a r a m e t e ru n d e rt h ec r i t e r i o no fm a x i m a le n u o p y t h e nw e i g h t e dd i s t a n c e t r a n s f o r m ，r e g i o nl a b e l i n ga n dm o r p h o l o g i c a lo p e r a t i o n sa r ea p p l i e di no r d e rt o i m p l e m e n tt h er e g i o nm e r g i n gt ot h ed i s t u r b i n gr e g i o n sa f t e rs e g m e n t e dp r o c e s s m e n t i o n e da b o v e a n dt h e nt h eu a d e r s e g m e n t a t i o nt ot h eo b j e c t sa r es p l i t f i n a l l y an o v e ls m o o t h i n gm e t h o do ft h el - dc c d so ft h ec o n t o u r so fo b j e c t sa f t e rf u z z y s e g m e n t a t i o ni sp r e s e n t e d t h er e s u l to fs i m u l a t i o ns h o w st h a t t h ea b s t r a c t e d c o n t o u r sa p p l i e di nt h i sa l g o r i t h ma r ev e r yc l o s et ot h er e s u l t so fh u m a nf u z z y v i s i o nt ot h et i n y , v a g u e e d g e do b j e c t sh a v i n go c c u p i e dt h ea r e ao f 3 0p i x e l so rs o t h i sa l g o r i t h mi su n i q u et ot h ep r e c i s e l ya b s t r a c t i o nt ot h es h a p eo ft i n yo b j e c t s w h i c hi saq u i t eg o o db a s et ot h ei d e n t i f i c a t i o na n dm a t c h i n go fo b j e c t si nf u r t h e r s t e p 3 a st h ee r r o r sa p p e a r i n gi nt r a c k i n gm o s t l yr e s u l tf r o ms e g m e n t a t i o n ，a n i n t e r a c t i v es o f t w a r ee n v i r o n m e n th a sb e e nd e v e l o p e di no r d e rt oa v o i dt h ee r r o r s i i 神经元干细胞序列图像分割与追踪系统的研究 p r o d u c e di nt r a c k i n gt h a tc a nb ek e p tt ot h ee n d t h i ss o f t w a r ec a ni m p l e m e n tt h e l o a d i n go fi m a g e s ，c o r r e c t i o na n dd e l e t i o nt ot h ee r r o r si ns e g m e n t e di m a g ea n d s a v ei t a n di tc a na l s oe n s u r et h et r a c k i n gt ob ec o n t i n u e da f t e rt h ec o r r e c t e d s e g m e n t a t i o ni m a g e sa r ei n s e r t e di n t ot h ei m a g es e q u e n c e s a l s oi tc a np e r m i tt h e o p e r a t o rc h e c k st h et r a c k i n g ，s e g m e n t a t i o na n do r i g i n a li m a g e sf r e e l y t h e c h a r a c t e r i s t i co ft h i ss o f t w a r ei sf l e x i b l ew h i c hc a nc o r r e c tt h ee r r o r sr e s u l tf r o m s e g m e n t a t i o na n dt r a c k i n ge f f e c t i v e l ya n dt i m e l y 4 a st h ei r r e g u l a r i t ya p p e a r i n gi nt h ew h o l ec e l l s m o t i o n t h es t e mc e l l sa r e c l a s s i f i e di n t oi n a c t i v e c e l l s ，s p l i t t i n gc e l l s ，c l u s t e r e dc e l l sa n da c t i v e c e l l s a c c o r d i n gt oc e l l s d i f f e r e n tb e h a v i o la ne x p l o r a t i v et r a c k i n gi sp r e s e n t e dh e r e d i f f e r e n ta l g o r i t h m sa r eu s e dt od e a lw i t ht h ed i f f e r e n tc e l lc a t e g o r i e s as p e c i a l b a c k t r a c k i n gs t e pi su s e dt oa u t o m a t i c a l l yc o r r e c tf o rs o m ec o m m o ne r r o r st h a t a p p e a ri nt h ei n i t i a lf o r w a r dt r a c k i n gp r o c e s s t h et r a c ef i g u r e sa r eu s e dt o i l l u s t r a t et h et r a c k i n gr e s u l t s t h r o u g ht e s t e db yh u m a nv i s i o n ，t h ec o r r e c t i o no f t r a c k i n gr e s u l t si sa l m o s t1 0 0 f r o mt h ed e s c r i p t i o no f t h et r a c e ，w ec a ns e et h a t t h et r a c eo fn e u r o ns t e mc e l l sh a st h eu n s m o o t hc h a r a c t e r i s t i cw h i c hi ss i m i l a rt o t h a to fp a r t i c l e s a n dt h e s ec a na l s oi l l u s t r a t et h es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c eo ft h e i d e n t i f i c a t i o na n dt r a c k i n gb e t w e e ns t e mc e l l sa n dr a d a rs i g n a l s i n c l u s i o n ，a ni n d e p t hi n v e s t i g a t i o nh a sb e e ni m p l e m e n t e do nn e u r o ns t e m c e l l si nt h i sd i s s e r t a t i o n t h es i m u l a t i o nr e s u l t sc o n f i r mt h a tt h ed e v i s e ds y s t e m c a no b t a i ns a t i s f i e dt r a c k i n gr e s u l t s ， k e yw o r d s ：n e u r o ns t e mc e l l s ，t i m el a p s ei m a g es e q u e n c e s ，s e g m e n t a t i o n ， t r a c k i n g ，s y s t e m 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本论文的所有工作，是在导师的指导 下，由作者本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文 献的引用已在文中指出，并与参考文献相对应。除文中已 注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已 经公开发表的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律结果由本人承担。 作者( 签字) ：i 玉盘企 日期：删6 年s 月2 仁日 第1 章绪论 第1 章绪论 于细胞的发现是上世纪术期生命科学领域中具有划时代意义的重大进 展。干细胞是一群尚未完全分化的细胞，同时具有分裂增殖成另一个与本身 完全相同的细胞，以及分化成为多种特定功能的体细胞的两种特性。干细胞 在生命体由胚胎发育到成熟个体的过程中，扮演了最关键的角色，即使个体 发育成熟之后，我们相信干细胞仍然普遍存在于生命体中，担负着个体的各 个组织及器官的细胞更新及受伤修复等重责大任，如图t 所示。本文主要研 究的是神经元干细胞，主要在脑部产生。本章从神经元干细胞研究的历史背 景和意义出发，以本文所研究的神经元干细胞及其图像为着眼点，分别阐述 了神经元干细胞人工培养的生物技术，有关显微图像的采集，以及微观物体 分割技术及追踪技术的发展概况，最后给出了本文以神经元干细胞图像分割 与细胞追踪为目的的系统框图。 1 1 神经元干细胞研究的历史背景和意义 神经元干细胞是藏匿于神经系统某些部位中的一些细胞，这些细胞保持 相对原始的状态，即具有多向分化的潜能以及自我更新的能力。这些细胞具 有良好的可塑性，可以通过基因工程或细胞工程等当代高新技术将之进行人 丁改造，使其发育成为能够对神经损伤特别是中枢神经损伤进行替代治疗的 工具。 传统观念认为，中枢神经系统的神经细胞在出生前或出生后不久就不再 产生了。这意味着成年动物脑和脊髓内的神经细胞只能逐渐减少而不能被更 新或替代，对于后天发生的中枢神经系统的损伤，也无法进行修复。神经功 能的恢复只能依靠邻近或其它部位中枢结构的代偿。2 0 世纪8 0 年代中期， 美国洛克菲勒大学两位学者在研究鸣禽金丝雀的发声学习行为中，发现成年 鸣禽金丝雀脑中确实有新的神经细胞产生，而且这些神经细胞能够产生在前 脑控制发声学习的高级神经中枢当中。近年来研究发现，成年哺乳动物中枢 哈尔滨工程大学博十学位论文 神经系统仍有新的神经细胞产生，并且证实在成人脑组织中同样存在着神经 干细胞【2 1 。一些非神经发生的部位如脊髓，也发现有成体神经f ：细胞存在。 图1 1 认识干细胞 f i g 11 r e g o g n i t i o no f t h es t e mc e l u s 所以，目前对于神经干细胞研究主要在两个方面：一是胚胎神经干细胞。 第1 章绪论 二是成体神经干细胞。近几年内，人类在胚胎神经干细胞的研究方面取得了 一些进展，如k y o t o 大学的研究者们把产生于猴子胚胎干细胞中的d a 神经 元移入人脑某区域该区域神经元如果退化会导致猴子型帕金森疾病的发 生，结果表明这一移入会使帕余森症状发生逆转。在2 0 0 4 年6 月召开的第6 届全国立体定向和功能性神经外科学术会议上，我国在国际卜首次将预诱导 的、向y 氨基丁酸能神经元方向分化的大鼠胚胎海马神经干细胞移植入大 鼠海人酸癫痫卣模型的海马内，研究神经干细胞移植治疗颞叶癫痫的效果。 2 0 0 5 年1 月3 0 日，在美国威斯康星大学工作的中国科学家张素春和李学军 报告说，他们成功使用人类胚胎干细胞分化出了运动神经元，在干细胞研究 中迈出一大步。这一成果当天发表在自然生物技术杂志网络版上。 然而，如何获得自愿捐献的合适的胚胎脑组织方面，技术上和伦理道德 上的难点限制了这种治疗方法的应用和推广。因此，更多的研究者又投入到 对于成体神经干细胞的自体移植的研究中去。成体神经干细胞的研究主要集 中在将定向分化或基因工程修饰的神经干细胞移植到中枢神经系统相关部 位：或将处于静止状态下相关脑区的神经干细胞诱导活化，使它们迁移到特 定脑区，发育成所需要的神经元，以替代疾病中缺乏的神经细胞。这将对帕 金森氏病、亨廷顿病、脱髓鞘疾病、老年性痴呆、脑梗塞以及恶性脑肿瘤、 脊髓损伤、癫痫等，起到积极治疗作用。我国是世界上人口最多的国家，需 要细胞移植治疗的疾病发病率与其它国家大致相似。由于我国早就实施了计 划生育政策，目前的家庭结构以独生子女家庭为主体，能提供具有相同或相 关基因的干细胞的可能性较其它国家低，因此我国干细胞及其自体移植的应 用研究更有其迫切的需求。 1 2 神经元干细胞人工培养的生物技术概述 1 2 1 细胞培养方式的介绍 如何能够分离出我们研究所需要的神经元干细胞? 这涉及到细胞在哪 罩? 如何识别? 如何取下来? 如何在体外扩增并且还保持其原始状态? 如何 让它长期在体外存活保留? 干细胞的增殖分化机制是什么? 如何将其进行基 因改造、使其成为治疗不同疾病的需要? 如何能够使其进入脑内正好起到治 哈尔滨i ：程人学博士学位论文 疗作用而不会形成肿瘤( 要知道干细胞是处于原始状态的细胞) ? 如此等等， 要解决的问题甚多。现在，全世界该领域的科学家都在积极探讨攻克这些难 关。 研究人员首先研究的是成年动物神经干细胞的位置和形态，以期能够很 好地鉴别出成年动物脑内哪罩有神经干细胞。为此，针对大鼠脑的侧脑室下 带( s u b v e n t i c u l a rz o n e ，s v z ) ，用各种染色技术，包括半薄切片、数字化处理、 切除嗅球( 因为已知s v z 处的干细胞能够迁移到嗅球) 等方法，对成年干细 胞进行定位。 如果将细胞从s v z 取下来进行培养，经过艰苦的过程可以获得活的神经 于细胞，它们在培养液中形成特有的球状。但球中的细胞比较复杂，对其分 化很难驾驭，最好能够将其纯化。为此，试图选择用神经干细胞细胞膜上的 抗原( 跨膜蛋白) c d l 4 4 作为特定标记物，特殊制备了带有c d l 4 4 抗体的 人工磁珠，用一种称为磁珠亲和细胞分选的方法将干细胞分离纯化，得到了 较单一的细胞群体。经检测，这些细胞具备明确的神经干细胞特性，具有自 我更新和多向分化的能力。 由于神经干细胞分化具有多样性，它们在改变培养条件的情况下可以分 化为各种细胞，甚至绝大多数是胶质细胞，而我们则希望将它们能够定向分 化成为多巴胺( d a ) 能神经元，以达到治疗帕金森病的目的。为此，将取自 大鼠胚胎中脑的神经干细胞与取自睾丸的支持细胞s e r t o l i 细胞共同培养， 发现该方法能够加强培养的干细胞向d a 能神经元方向分化。 为了使神经干细胞能够长期在体外保存，达到随时能够临床应用的目的， 研究人员试图将从人脑分离下来的干细胞永生化。方法之一是将源自人胚胎 脑纹状体的神经干细胞转入端粒酶基因，转入端粒酶基因的干细胞保存了良 好的原始细胞的特性，达到在体外长期不分化的效果；在改变培养环境后， 这些细胞仍然能够分化成为神经元和神经胶质，在可能分化为神经元的细胞 中，还有向d a 能神经元分化的趋势。使神经干细胞永生化方法之：二是向这 些细胞转入s v 4 0 t s a 5 8 基因。该基因来自猴病毒s v 4 0 中温度敏感的大t 抗 原突变体，在4 4 。c 温度下保持增殖不分化，具有明确的干细胞特性；在4 9 。c 时，细胞不再增殖而进入分化，可以分化为神经元和神经胶质。这就似乎很 有利于将来应用，即在体外储存时，它们可以只增殖不分化，一旦移植到了 4 第1 章绪论 脑内，随着体温的制约，它们就只分化为神经组织细胞而不再增殖。因此我 们己经获得了两种永生化神经于细胞系。但将它们植入脑内是否安全，是否 能够分化为起修复损伤的神经细胞? 需要进一。步研究。 1 2 2 本文研究的神经元干细胞的样品准备和细胞培养 实验方法中具体的神经元干细胞的培养方法： 采用成年f i s c h e r 鼠的脑组织，首先分离出a h p s ，得到来自于f r e dg a g e ( l a b o r a t o r y o f g e n e t i c s ，t h es a l k i n s t i t u t e ，l aj o l l a ，c a ) 博士的克隆细胞。海 马回从成年( 大于4 个月) 雌性，共4 4 4 个f i s c h e r 鼠的脑中双面解剖出。 然后该组织在冷的、无菌d u l b e c c o sp h o s p h a t e b u f f e r e d 盐水中浸泡，再以机 械方式分开，加入酶( 0 0 1 p a p a i n ，0 1 n e u t r a l p r o t e a s e ) 。细胞受离心机的 作用，同时加入e a g l e 介质及含有2 5m m 的l 一麸氨酸的f 1 2n u tm i x ，还有 1 0 的小牛血清( 来自于s i g m a - a l d r i c hs w e d e na b ，s t o c k _ h o l m ，s w e d e n ) 。 细胞在未加盖的塑料长颈瓶内培养，瓶内温度保持在4 7 0 c 并一直提供5 的 二：氧化碳。培养的第二天，介质换用无血清的：d e m e m n u tm i xf 1 2 ，其中 包含2 5 m ml 的一麸氨酸和n 2 补充物质( g i b c oi n v i t r o g e nc o r p ，p a i s l e y , s c o t l a n d ，u k ) 以及2 0 n g m l 的人类基本的f g f 一2 ( p e p r o t e c hl n c ，r o c k y h i l l ，y j l 。在无f g f 一2 的条件下培养意味着要控制整个的培养过程，并且意味 着介质是n 2 介质。细胞在4 7 0 c 进行两分钟的胰蛋白酶化。成年鼠的海马回 通过在体外试管内通过至少4 0 次的变迁进行人工培养，使分裂继续进行，而 其在特征上无任何变化。使用的细胞是克隆后的第5 次至第2 0 次变迁之间的 细胞。 1 3 图像的采集 1 3 1 采用信息处理技术研究神经元干细胞的原因 近几年的研究表明，胚胎干细胞、成体神经干细胞在体外的培养中部可 以分化成为神经细胞，并且已经在小鼠、大鼠模型移植实验中取得明显疗效。 但是，人类对于成体神经干细胞在人工培养过程中，如何从神经干细胞发育 成特定的神经细胞，进一步发育成为具有特定功能的神经器官，知之甚少。 哈尔滨i = 程大学博士学位论文 而且，为了尽最人可能的保持细胞在人工培养环境下的自然活性状态，使之 自然的分裂，增殖，不能采用人类观察其它细胞及蛋白质等显微目标常采用 的染色及添加荧光技术，这就使得只利用鼹微观察技术研究其定向分化过程 几乎成为不可能，必须借助计算机在数字图像的成像分析技术和在信号与信 息的高速处理技术等方面具有的高性能。利用显微成像技术研究荧光细胞图 像形态学分析与追踪网f 8 9 ，目前也是研究显微目标的有效手段之一。而在数 字图像分析中，通过序列图像分析目标的运动，已经在街面人流【9 、车辆统 计f 9 1 1 ，云朵流动图瞰1 分析，人脸定位分析【9 3 j ，足球运动员视频追踪等宏观物 体方面得到了较为广泛的探索。 1 3 2 本文所采用的图像采集技术 本文研究有关神经元二f 细胞的生长、发育机制的手段，就是利用时间序 列数字图像分析和处理以及在信息与信号处理方面的技术。 该成像系统使用的是l e i c ad mi r b 明视野显微镜( 2 0 倍镜头) ，应用 显微成像仪型数字照相机捕捉数字图像。细胞是在封闭的f a l c o n 细胞培 养盘中，并提供丰富的二氧化碳气体，加热到4 7 0 c 。使用的是那些能够分化 成神经元和神经胶质细胞的神经元母细胞。 在图像的获取中主要有三点需要注意： 1 通过计算和评估图像直方图避免图像饱和； 2 图像的等方性依赖于显微镜的几何光学特性，其好坏主要依赖于显微镜制 造技师的水平。而且，如果培养细胞覆盖不均，或是表面有稍微的倾斜将 导致漫反射； 3 在成像中聚焦足最复杂的部分。原因在于细胞的大小( 厚度) 与焦距深度 相比更为重要。这就意味着细胞培养盘不能被作为二维物体。因为聚在细 胞某特定部分的特定焦距，会使这个地方成像非常尖锐。为了获得最佳 聚焦特性的图像，使用具有不同聚焦平面的层叠图像，选择那些具有高频 成分的图像。 图像采集系统旧如图1 2 ： 图像在观察过程中在灰度上有一些细微的变化，仔细校准显微镜刻度可 以把这个降低到最小值，额外的数据处理可以进一步改善这种情况。具有大 6 中值滤波器( 4 5x4 5 ) 的同形滤波在阴影校正方面可以取得令人满意的结果。 幽1 2 图像采集系统 f i g 1 2 t h es y s t e mo f t i m e l a p s ei m a g es e q u e n c e s a c q u i s i t i o n 对于每一组活体样品细胞，使用全自动显微聚焦方式，每隔1 5 分钟捕捉 一帧图像，由此产生一组序列图像。其中每一帧图像显示的是细胞在化学催 化剂影响下的运动状态。为了保证细胞的活性以研究它们的运动状态，细胞 在显微镜下呈非染色的自然状态，这对细胞图像的分割产生了相当大的难度， 从而在细胞的追踪过程中产生了一系列的问题。 1 4 微观物体分割与追踪技术 1 4 1 微观物体分割技术概述 利用时间序列显微图像和图像分析技术分析微观物体的运动，到目前为 止该方面的研究还不是很多。其中一个较为重要的原因就是受到了微观物体 分割技术的限制。美国v a n d e r b i l t 大学的x i a l i 和d a v i dwp i s t o n 利用显微 序列图像分析活性细胞中的蛋白质的流动【9 4 】，是迄今利用显微序列图像分析 哈尔滨t ：程大学博十学位论文 显微目标的较好的探索之一。然而，未经染色的神经千细胞与蛋白质在显微 成像后的最大差异就是：蛋白质在显微暗视野成像后的图像中，整个目标与 背景相比具有很强的对比度。因此，蛋白质的分割技术f _ j 未经染色的神经元 干细胞的分割技术相比，较容易得到令人满意的分割结果。 细胞在组织培养液中是非刚性的，具有不规则形状。由丁细胞的运动、 生长和分裂，它们呈现出各种不同的形状，并且在各个细胞边界和图像背景 之间的灰度对比度会逐渐发生变化。最近几年柬，研究者们相继提出了几个 关于细胞图像分割的算法。一个简单却最受欢迎的方法是利用门限，该门限 的取值是基于图像像素灰度的直方图特征【l ”j 。但是，如果目标和背景之间灰 度值的变化在某一个较大的范围内，就很难用一个最佳门限水平来精确描述 细胞的形状。另外，门限技术并不能保证将相互接触的物体的轮廓分割出来， 通常还需要一个后处理【1 1 3 1 1 4 。除了用一个门限定义目标和背景之间的边界， 还u 以利用相邻像素在灰度、梯度或是方差上的相似性，这些通常就是我们 经常提到的区域增长算法( r e g i o ng r o w i n g ) ，像水线分割也包含在该算法之内。 水线分割由于目标内及背景中的灰度发生变化经常导致过分割。源点水线分 割算法是指分割出来的目标边界的数目受输入的一个源点区域集的限制，该 方法已经应用到荧光显微镜成像的细胞核分割之中。由全自动方式产生的源 点经常会导致一个物体中含有多个源点或是物体中根本就不包含源点。然而， 可以通过基于模型的区域吞没来降低由多源点产生的过分割现象【6 _ l ”j 。 目前，对于未经染色的显微细胞图像的分割技术m 1 【4 3 l ，【9 5 i 处于比较领 先地位的是美国的x i a n g h u a x i e 和m a j i d m i r m e h d i ，他们使用了区域辅助几 何蛇算法【18 l ，对于和背景具有弱对比度、边缘有缺口的特殊细胞图像的分割 算法，做了进一步的探索和研究。然而，该算法要在多种区域分割算法的基 础上才能建立多项约束的几何蛇平衡方程的等位函数逼近模式，相对限制了 该算法的灵活