qPCR流程图.doc

一、Total RNA的提取：1. 取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，15min左右，研磨充分后加入1.5ml的EP管，加入1ml Trizol，充分匀浆。（另一种，加入trizol会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。）2. 室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中3. 加入1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移至新管；4. 加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min5. 弃上清，留沉淀，加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。重复三次6. 弃上清留沉淀，自然风干（510min），加入32ul DEPC处理过的水，测OD260/280的值，根据结果调整至1g/l=1000ng/l，立即进行反转录，剩余的RNA标好号存放在-80下。附：1OD260=40g/ml用样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。（可无）可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边一条不太明显的5SRNA的条带。证明RNA完整无降解。二、反转录：说明书：10 l 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。20/1g（以前用的40，下次用20）20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH20和enzyme 配成mix5PrimeScript Buffer（ for Real Time）：4lPrimeScript RT Enzyme Mix I ：1lOligo dT Primer（ 50 M）：1lRandom 6 mers（ 100 M）：1l总RNA ：1l(1g/l)RNase Free dH2O ：12l反转录反应条件如下:37 15 min （反转录反应）85 5 sec（反转录酶的失活反应）4 -20分装保存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）三、内参检测 -actin 50l体系试剂使用量10*taq buffer5ldNTP4lPrimer-F（100M）0.5lPrimer-R（100M）0.5lTaq E0.25l模板500 ng1l灭菌蒸馏水加至50lPCR 反应条件:扩增 1 kb 的 DNA 片段的 PCR 反应条件如下：预变性：95，3min98 10 sec.55 30 sec.（下次60，去掉非特异性）72 30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）72 5min.4保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。四、定量PCR电泳检测，条件同上。增大至50个循环。五、分析数据引物AT1F: GCCCTTCGGCAATCACCTATAT1R: TGAGACACGTGAGCAGGAACAT2F: CCTGGCAAGCATCTTATGTAGTTCAT2R: CCG