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文档简介

RNA 提取方法（TRIzol法）一、 试剂准备1、 TROzlo试剂、氯仿、75%乙醇（0.1% DEPC配制）。2、 塑料器皿需用0.1% DEPC水浸泡。3、 0.1%DEPC水：100ml dd水中加入DEPC0.1ml，充分振荡，37孵育12h以上，121高压灭菌20min，于4保存。二、 操作步骤1、 样品处理（1） 组织：50-100mg组织中加入1ml TROzlo试剂。（2） 单层细胞：加入TROzlo试剂1ml/cm2平板。（3） 悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。每5-10105动物、植物或酵母细胞，或1107细菌加入1 ml TROzlo试剂。2、 将上述样品于15-30静置5min，使核蛋白充分解离。3、 加入0.2ml（1 ml TROzlo试剂）氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30静置2-3min。4、 于2-8 12000g离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。5、 取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。6、 于2-8 12000g离心10min后弃去上清。7、 向沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀。8、 于2-8 7500g离心5min后弃上清9、 将RNA样品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60促溶10min）。三、 注意问题1、 在加入氯仿之前（第1步），样品能于-60- -70保存至少一个月。2、 RNA沉淀（第6步）在75%乙醇中于2-8能保存至少一周，于-5- -20能保存至少一年。四、 RNA定量RNA（mg/mL）=40OD260稀释倍数（n）/1000 RNA纯品OD260/OD280=2.0五、 RNA电泳（1）用1TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4l于封口膜上。在实验台上再加入5l 1TAE电泳缓冲液及1l 的10载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30
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