RAW264.7细胞株的传代.doc

RAW264.7细胞株的传代我养的是RAW264.7细胞株，前面有战友都提到过这种细胞的消化传代，但是因为这种细胞最大的特点是贴壁特别强， 每次传代都很难消化下来， 刚开始使用胰酶消化，发现37度， 消化15min细胞也还是吹不起来，后来又用单纯的用细胞刮刀刮的办法，但是这样养了一段时间，发现细胞损伤非常大，贴壁性变差，生长缓慢，后来使用了现在这个方法，到现在细胞的生长状况一直很好!简述如下：1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉， 然后用D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用)2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml， 37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶此法屡试不爽，细胞生长饱满圆润，再也没出现过以前那种情况。 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。我的操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70时，弃去培养液，加DPBS10ml漂洗 一至两次；弃去2、 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3、分入新的培养瓶； 4、入375CO2孵箱，几小时后即可再贴壁 。细胞生长很好。 刚从上海细胞库买回来的RAW264.7细胞传了大概5到6代就开始不行了,实验进行不下去.刚开始细胞状态都很好,但是后面就开始很多细胞贴着,消化不下来,后面就都裂解掉.后来又复苏了一瓶细胞,也是传了4代左右就开始不行了 .急啊 !搞不懂为什么会这样.有没有人出现这种情况啊?能不能提供一点经验呢? 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7本身就比较难消化,在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。我们的经验是,以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。使用温至室温的消化液进行消化,消化时镜下观察,并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底,约35 min后,待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化,弃去胰酶,以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感,所以不要用吸管反复吹打细胞。该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来,所以换瓶传代就行了。看了楼主的描述,感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。多多交流！ 我的细胞跟楼主的一样,今天痛苦得不行了,是不是先变成很不规则的多边形然后裂解？多交流阿！我的qq: 是啊.就是传几代就不行了.我是都有吹打,如果不吹打的话怎么能成单细胞呢?我现在也不知道怎么办啊 刚开始养,还未见异常 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代： RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢,普通的方法根本就不可能将它消化下来,这也是养这种细胞最头痛的问题。现将我的一点心得,简介如下： 消化液：0.5胰酶、0.2EDTA,实验前加温到37度 以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长,长满瓶底80时,弃去培养液,加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液12ml,消化37约2-5min,镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化,弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞,按需要分入新的培养瓶RAW264.7 RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。 我得操作如下： 实验前将DPBS及DMEM加温到37度 使用Flask75培养瓶： 1、细胞贴壁生长,长满瓶底70时,弃去培养液,加DPBS10ml漂洗一至两次；弃去 2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可,离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞 3.分入新的培养瓶； 4. 入375CO2孵箱,几小时后即可再贴壁；4. 入375CO2孵箱,几小时后即可再贴壁。培养条件：1640培养液+四季青10%新生牛血清。PH：2gNaHCO3每1L 1640培养液。在我培养的过程中，从来没有用过胰酶消化传代。我一直是直接用弯嘴滴管吹打的。只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。吹打一遍之后，置镜下观察哪里还有未吹下的细胞，再着重吹打。吹打过程中，注意用力，要比常规稍加力度以能够吹下细胞。当然，用胰酶消化也是可以的，但是细胞的生长状态就是没有不用直接吹打下来的好。对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢扎堆的。正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。一般，在细胞小片小片地铺满瓶底而未连成大片的时候就该传代了。并且一旦有片细胞叠加成层就要进行传代。否则该处细胞必老化。影响整体生长状态！该细胞的生长速度比较快，常规留种下，一般3-4天传代。有时生长旺盛的时候甚至2天就需要传代，所以在你传新瓶的时候，尽量少留种，我们在平时维持的时候，一般都是只在新瓶里用滴管口蘸一下而已。能够维持4-5天再传代。如果是一次性大塑料瓶，则可以维持7天左右。过节假日时可以用此方法维持。RAW264.7 细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形或多边形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。RAW264.7 细胞生长速度非常得快，贴壁速度很快，对生长空间的要求比较敏感。所以传代的时候以及培养的时候都要注意不要太多的细胞在培养瓶里，这样细胞状态会比较好。很多反而不利于该细胞生长。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该把我好该细胞喜欢的生长空间密度。对于细胞生长状态不好的时候，可以采取“二传”的方法，是我在另一帖子里写到的，现在转述如下：【对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。